Abstrakt

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight, en verdifull matmedisinsk homolog urt fra Orobanchaceae-familien, dyrkes mye i det sørlige Xinjiang i Kina. Dens viktigste bioaktive fenyletanoidglykosidbestanddeler,echinacosideogakteosid (verbascoside), leverer flere farmakologiske aktiviteter, inkludert antioksidasjon, anti-inflammasjon og immunregulering. Ustandardiserte tradisjonelle behandlingsprosedyrer forårsaker ofte betydelige tap av disse kjerneaktive forbindelsene, noe som begrenser bruken av medisinsk og funksjonell mat.Cistanche tubulosaavkok biter. Denne forskningen hadde som mål å optimalisere moderne prosessparametere for ferskeCistanche tubulosaskiver for å maksimere utvinningen av acteosid og echinacosid, og ytterligere klargjøre den antioksidative stress og anti-inflammatoriske bioaktiviteten samt den underliggende molekylære mekanismen til optimalt behandlede avkoksstykker på cellenivå.

Enkeltfaktoreksperimenter ble utført for å screene passende områder for skivetykkelse, dampvarighet og ovnstørketemperatur. En tre-faktor tre-nivå Box-Behnken respons-overflate-metodikk ble tatt i bruk for å etablere multi-faktor interaksjonsmodeller, ved å bruke acteosid og echinacoside innhold som doble evalueringsindikatorer. Deretter ble lipopolysakkarid (LPS)-stimulert RAW264.7 musemakrofagcellemodell bygget for å simulere lipidperoksidasjon og akutt inflammatorisk skade. En serie biokjemiske analyser inkludert MTT, ROS fluorescensdeteksjon, ELISA og Western blot ble implementert for å vurdere antioksidativt stressstyrke og utforske signaltransduksjonsveier.

I henhold til eksperimentelle resultater ble de optimale behandlingsparametrene bestemt som skivetykkelse på 0,6 cm, dampbehandling i 6 minutter og tørketemperatur satt til 57 grader. Under denne praktiske bearbeidingsbetingelsen nådde det målte innholdet av akteosid og echinakosid henholdsvis 7,25 % og 31,62 %, og viste god konsistens med teoretiske prediksjonsverdier. Cellebaserte analyser avslørte det optimalt behandletCistanche tubulosaavkoksekstrakter reduserte konsentrasjonen av nitrogenoksid (NO) og malondialdehyd (MDA) betydelig i LPS-utfordrede RAW264.7 makrofager. I mellomtiden økte det markant intracellulære antioksidantenzymaktiviteter av superoksiddismutase (SOD), katalase (CAT), laktatdehydrogenase (LDH), sammen med økt innhold av glutation (GSH). Sekresjonsnivåene av pro-inflammatoriske mediatorer inkludert TNF‑, IL‑1 og IL‑6 ble også undertrykt på en doseavhengig måte. Western-blot-deteksjon validerte detCistanche tubulosaekstrakter begrenset overdreven fosforylering av nøkkelproteiner i p38/AKT/JNK/NF‑κB-signalkaskader.

Oppsummert forbedrer denne optimaliserte moderne prosesseringsprotokollen effektivt utbyttene av karakteristiske fenyletanoidglykosider (acteosid og echinacoside) iCistanche tubulosaavkok biter. Bearbeidet urtemateriale utøver fremtredende antioksidativt stress og antiinflammatoriske effekter i LPS-indusert makrofagskademodell, hvis farmakologiske mekanisme delvis realiseres via inhibering av overaktivering av p38/AKT/JNK/NF‑κB inflammatorisk signalakse. Dette arbeidet gir pålitelige tekniske parametere for standardisert industriell produksjon og gir eksperimentell støtte for utvikling av antioksidantfunksjonell mat avledet fraCistanche tubulosa.

Nøkkelord: Cistanche tubulosa; prosesseringsteknologi for avkok; akteosid; echinacoside; antioksidativt stress; RAW264.7 makrofag; p38/AKT/JNK/NF‑κB signalvei

1. Introduksjon

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight tilhører Orobanchaceae-familien, og dens kjøttfulle skjellete stilk er den offisielle medisinske delen. Denne ørkenmedisinplanten er i stor grad plantet i det tørre sørlige Xinjiang, Kina. I tradisjonell kinesisk urtepraksis,Cistanche tubulosafungerer som en klassisk styrkende urt med dokumenterte terapeutiske funksjoner for å tonifisere nyre-yang, fylle på essens-blod og avslappende avføring. Klinisk brukes det for å lindre sårhet-svakhet i lumbus og knær, infertilitet forårsaket av nyremangel, og tørr tarm-indusert forstoppelse.

Fenyletanoidglykosider står for de mest kritiske bioaktive markørene forCistanche tubulosa. Den kinesiske farmakopéen fastsetter at det totale innholdet av echinakosid pluss akteosid ikke skal være mindre enn 1,50 % for kvalifiserte medisinske materialer. Likevel, gjeldende mainstream produksjon avCistanche tubulosaavkoksstykker følger fortsatt for det meste gamle manuelle arbeidsflyter: bløtlegging av fersk rå urt, fukting grundig, skjæring og naturlig tørking eller vindamping. Disse konvensjonelle tilnærmingene mangler nøyaktige kvantitative tekniske spesifikasjoner. Termisk ustabilitet av fenyletanoidglykosider fører ofte til alvorlig nedbrytning av aktive ingrediensene under prosessering, noe som senker sluttproduktkvaliteten og begrenser storskala produksjon av høy kvalitet. For tiden kombinerer bare begrenset forskning samtidig prosesseringsteknologioptimalisering med validering av biologisk aktivitet; de fleste studier oppdager bare innhold av kjemiske bestanddeler uten cellulær funksjonell verifisering, noe som skaper hull for industriell transformasjon.

Oksidativt stress fungerer som kjernepatologisk trigger for flere kroniske metabolske og inflammatoriske sykdommer. Overdreven akkumulering av reaktive oksygenarter (ROS) forstyrrer redokshomeostase, og provoserer ytterligere makrofagoveraktivering og massiv pro-inflammatorisk-cytokinfrigjøring, og danner en ond sirkel mellom oksidasjon og betennelse. Eksisterende farmakologiske undersøkelser har bevist detCistancheFenyletanoidglykosider med opprinnelse har antioksidant- og antiinflammatoriske egenskaper. Tidligere dyreforsøk har vist detCistanche tubulosatotale glykosider forbedret leverskade i sepsis-gnagermodeller ved å aktivere Nrf2/HO-1 antioksidantsignalering. Lignan-glykosidkomponenter isolert fraCistanche tubulosakunne dempe LPS-provoserte inflammatoriske responser via modulerende PI3K/AKT-vei i RAW264.7-makrofager. Hvorvidt avkoksstykker produsert under nylig optimaliserte prosessforhold beholder kraftig antioksidativt stressbioaktivitet, har imidlertid ikke blitt systematisk evaluert. Den konkrete molekylære reguleringsmekanismen krever fortsatt dypere utforskning.

Den LPS-stimulerte RAW264.7-makrofagen er en godt akseptert in-vitro betennelses-oksidativ-skade-modell, mye brukt for å vurdere naturlige produkters antioksidant- og anti-inflammatoriske effekter. I denne studien utfører vi først enkeltfaktorscreening etterfulgt av Box-Behnken respons-overflateoptimalisering for å oppnå standardiserte tekniske parametere for skjæring-dampende-tørking rettet mot høye akteosid- og echinakosid-utbytter. Etter å ha oppnådd optimaliserte avkoksprodukter, tilbereder vi urteekstrakter og tar i bruk LPS-indusert RAW264.7 cellulær skademodell. Flere eksperimentelle plattformer inkludert måling av oksidativ-stress-biokjemisk markør, cytokin-ELISA-kvantifisering og Western-blot-baneanalyse brukes for å klargjøre antioksidativt stress-effekt og signaltransduksjonsmekanisme. Denne forskningen leverer praktiske prosessparametere for produksjon i pilotskala av høy kvalitetCistanche tubulosaavkok med stabil antioksidativ stressaktivitet, og legger eksperimentelt grunnlag for påfølgende utvikling av funksjonell mat og kosttilskuddsprodukter hentet fra XinjiangCistanche tubulosaressurser.

2. Materialer og metoder

2.1 Råmaterialer, reagenser og instrumenter

FerskCistanche tubulosakjøttfulle stilker ble høstet om høsten fra Hotan, Xinjiang Uyghur autonome region, Kina. RAW264.7 muse-monocyttmakrofageleukemicellelinje ble kjøpt fra Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Wuhan, Kina). Acetonitril og metanol av kromatografisk kvalitet ble levert av Merck (Tyskland). Referansestandardsubstanser echinacoside og acteosid (renhet større enn eller lik 98 %) ble hentet fra Beijing North Weiye Metrology Technology Research Institute. Dimetylsulfoksid (DMSO) ble kjøpt fra Sigma-VETEC (USA). DMEM høyglukosemedium, BCA totalproteinanalysesett var produkter fra Thermo Fisher Scientific (USA). Fetalt bovint serum (FBS) ble kjøpt fra BI (Israel). Penicillin-streptomycin dobbeltantistoffløsning kom fra HyClone (USA). Kommersielle analysesett for NO, MDA, SOD, CAT, GSH ble anskaffet fra Beyotime Biotechnology (Shanghai, Kina). LDH-deteksjonssett og lipopolysakkarid (LPS,E. coli055:B5) ble hentet fra Solarbio (Beijing, Kina).

Nøkkellaboratorieinstrumenter inkluderte Shimadzu høyytelses væskekromatografi (HPLC)-system, LabTech rotasjonsfordamper, swing-type høyhastighets pulverisering av kinesiske urter, termostatisk støytørkeovn, dampkokerutstyr, BioTek SYNERGY-1-mode-leser, mikroplate-leser, mikroplater, HFA 1-mode, mikroplater elektronisk analytisk balanse, CF1524R kjølt sentrifuge, BSC-1300IIA2 biosikkerhetsskap og BDS200-PH invertert optisk mikroskop.

2.2 Enkeltfaktor-prosesseringseksperimenter

FerskCistanche tubulosakjøttfulle stilker ble kuttet i skiver med forskjellig tykkelse (0,2 cm, 0,4 cm, 0,6 cm, 0,8 cm, 1,0 cm, 1,2 cm). Skiver ble dampet i variert varighet (3 min, 6 min, 9 min, 12 min, 15 min, 18 min, 21 min). Etterpå ble materialer tørket under forskjellige temperaturgradienter (omgivelsestemperatur 25 grader, 40 grader, 50 grader, 60 grader, 70 grader, 80 grader). Fullt tørkede avkoksprøver ble pulverisert og siktet gjennom en 40-mesh sikt for påfølgende HPLC-komponentkvantifisering.

2.3 Bestemmelse av akteosid- og echinakosidinnhold

Preparering av prøveløsning: Vei nøyaktig 1,0 g pulverisert avkokspulver i en konisk kolbe med propp. Tilsett 100 ml 50 % metanolløsning nøyaktig. Utfør 30 min bløtlegging etterfulgt av 40 min ultralydekstraksjon. Etter avkjøling fyller du på vekttapet av løsemiddel med 50 % metanol, bland jevnt og la statisk bunnfelling. Supernatanten ble filtrert gjennom 0,22 μm mikroporøs membran for HPLC-injeksjon.

Tilberedning av referansestandardløsning: Vei nøyaktig passende mengde akteosid- og echinakosidreferansestoffer, løs opp med 50 % metanol i målekolber, klargjør seriegradient-standardløsninger, filtrer med 0,22 μm filtermembran.

Kromatografisk oppsett: COSMOSIL C₁₈ analytisk kolonne; mobilfasesystem: mobilfase A: 0,1 % vandig fosforsyreløsning; mobil fase B: acetonitril. Deteksjonsbølgelengden ble satt til 330 nm; kolonnetemperatur 35 grader; strømningshastighet 1 ml/min. Ekstern standardmetode ble brukt for kvantitativ beregning av akteosid- og echinakosidinnhold. Omfattende evalueringsscore=(echinakosidinnhold × 50 %) + (akteosidinnhold × 50 %). Omfattende poengsum fungerte som sammensatt vurderingsindikator for ytelse i prosesseringstilstand.

2.4 Box-Behnken Response-Surface Experimental Design

Basert på en-faktor eksperimentelle resultater, ble Design-Expert 13.0-programvare brukt til å implementere Box-Behnken tre-faktor tre-nivå eksperimentell ordning. Skivetykkelse (X₁, cm), dampbehandlingstid (X₂, min), tørketemperatur (X₃, grad ) ble valgt som uavhengige variabler. Akteosidinnhold (Y1, %) og echinakosidinnhold (Y₂, %) var responsverdier. Sytten grupper med eksperimenter ble utført. Nullnivå for hver faktor ble valgt i henhold til optimal parameter oppnådd i enkeltfaktortester. Etter å ha fullført respons-overflateforsøk, ble modellvariansanalyse, 3D-respons-overflateplotting og tilstandsprediksjon fullført. Praktiske verifikasjonseksperimenter ble utført etter justering av teoretiske predikerte parametere til operative faktiske produksjonsverdier.

2.5 Cellekultur og prøvepreparering

Avkoksråmateriale ble produsert under optimaliserte prosessforhold. Urtepulver ble ekstrahert i henhold til den ovenfor nevnte prøveforberedelsesprotokollen, konsentrert ved rotasjonsfordampning og vakuumtørket for å oppnå fast ekstraktpulver. Stamløsning ble fremstilt ved å løse opp ekstraktpulver i DMSO, videre fortynnet med komplett DMEM-medium (inneholdende 10 % FBS og 1 % penicillin-streptomycin) for cellulære eksperimenter; endelig DMSO arbeidskonsentrasjon ble kontrollert under 0,1 % (v/v). RAW264.7 makrofager ble dyrket i DMEM komplett medium under 37 grader, 5 % CO₂ fuktet inkubatormiljø.

2.6 MTT cytotoksisitetsanalyse

RAW264.7-celler ble sådd på 96-brønners mikroplater ved celletetthet på 8 × 10⁴ celler/ml. Eksperimentelle grupper inkluderte løsemiddelkontrollgruppe (0,1 % DMSO-medium), LPS-modellgruppe (endelig LPS-konsentrasjon 1 ug/ml) og flereCistanche tubulosaekstraktkonsentrasjonsgrupper (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/ml). Etter 2-timers pre-inkubering med urteprøve, ble LPS (1 ug/ml sluttkonsentrasjon) supplert til hver gruppe bortsett fra løsemiddelkontrollgruppen. Inkubasjonen fortsatte i 24 timer. Deretter ble MTT-reagens (5 mg/ml) tilsatt og inkubert i 4 timer. Kast supernatanten, tilsett 150 μL DMSO per brønn, rist ved 37 grader i 15 min. Absorbansverdi ved 490 nm bølgelengde ble avlest på mikroplateleser, og celleoverlevelsesrate ble beregnet. Sikkert arbeid-konsentrasjonsområde ble bestemt for oppfølgingsfunksjonstester.

2.7 Intracellulær ROS-måling

RAW264.7 makrofager ble inokulert på seks-brønns plater med en tetthet på 4 × 10⁵ celler per brønn. Etter cellevedheng ble det utført grupperingsbehandling: løsemiddelkontrollgruppe, LPS-modellgruppe og CT-ekstraktbehandlingsgrupper (12,5, 25, 50, 100 ug/ml). Etter 2 timers forbehandling med prøve, ble LPS 1 ug/ml tilsatt bortsett fra løsemiddelkontrollgruppen, inkuber 24 timer. Intracellulært ROS-nivå ble påvist ved bruk av fluorescerende-probe-lastingsmetode i henhold til instruksjonene for settet. Fluorescensintensitet ble målt med fluorescensmikroplateleser (eksitasjon 488 nm, emisjon 525 nm).

2.8 Påvisning av NO, MDA, SOD, CAT, LDH og GSH

Etter tilsvarende cellebehandling ble cellekultursupernatant samlet inn for NO-måling ved bruk av Griess-reaksjon. Festede celler ble vasket med forhåndsavkjølt PBS, lysert på is, cellelysatsupernatanten ble høstet etter sentrifugering (10 000 r/min, 4 grader, 5 min). BCA-settet bestemte den totale proteinkonsentrasjonen for hver prøve. Innholdet av MDA, GSH og enzymaktivitetsindikatorer SOD, CAT, LDH ble analysert strengt i henhold til bruksanvisninger for settet.

2.9 ELISA-bestemmelse av pro-inflammatoriske cytokiner

RAW264.7-celler mottok prøveforbehandling og LPS-stimulering i totalt 16 timer. Cellekultursupernatant ble samlet og sentrifugert. Konsentrasjoner av TNF-, IL-1, IL-6 i supernatanten ble kvantifisert med kommersielle ELISA-sett.

2.10 Western-blot-analyse

Etter 45 minutter med LPS og saminkubering av prøve, ble RAW264.7-celler lysert ved bruk av RIPA-lysebuffer supplert med protease-fosfatasehemmercocktail. Cellelysat ble sentrifugert ved 10 000 r/min under 4 grader i 5 minutter. BCA-sett kvantifisert totalproteinkonsentrasjon. Prøveproteiner (50 ug per bane) ble denaturert ved 100 graders metallbad i 5 minutter. SDS-PAGE gelelektroforese separerte målproteiner, som deretter ble overført til PVDF-membraner. Membraner ble blokkert i 1 time med 5 % skummetmelk TBST-løsning. Primære antistoffer rettet mot p38, p-p38, AKT, p-AKT, JNK, p-JNK, NF-κB p65, p-NF-κB p65 og GAPDH ble inkubert over natten ved 4 grader. Etter TBST-vasking ble tilsvarende sekundære antistoffer inkubert ved romtemperatur i 1 time. Etter gjentatt vask ble ECL ultrasensitiv kjemiluminescerende reagens påført for proteinbåndavbildning. Kvantitativ båndgråskalaanalyse ble implementert for å evaluere relativt fosforyleringsproteinekspresjonsnivå.

2.11 Statistisk analyse

GraphPad Prism 8.0.2-programvaren ble brukt for statistisk beregning og grafplotting. Eksperimentelle kvantitative dataresultater ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). Enveis ANOVA etterfulgt av post-hoc multiple sammenligningstester ble brukt for sammenligning mellom grupper. \\(P<0.05\) represented statistically significant difference; \(P<0.01\) highly significant difference; \(P<0.001\) extremely significant difference.

3. Eksperimentelle resultater

3.1 Utfall av enkeltfaktoreksperimenter

Slice thickness exerted obvious influence over the contents of acteoside and echinacoside. Slices at 0.2 cm thickness were easily over‑steamed, leading to thermal degradation of phenylethanoid‑glycoside active components. Excessively thick slices (>0,4 cm) hindret frigjøring av indre stoffer, noe som senker det endelige påvisbare innholdet av komponenter. Under fast damptid (10 min) og tørketemperatur (60 grader), oppnådde 0,4 cm skivetykkelse høyeste omfattende evalueringspoeng.

Resultater for dampbehandlingens varighet: når skivetykkelsen ble fiksert til 0,4 cm og tørketemperaturen holdt på 60 grader, kunne utilstrekkelig dampingstid ikke i tilstrekkelig grad ødelegge plantecellestrukturen slik at aktive forbindelser var vanskelige å løse opp. Når dampingstiden oversteg 6 minutter, skadet overdamping urtevev og induserte nedbrytning av echinacosid og acteosid. Derfor ble 6 minutter foreløpig identifisert som foretrukket dampbehandlingsvarighet.

For ovnstørke-temperaturgradienteksperimenter: skivetykkelse 0,4 cm og damptid 6 minutter ble fastsatt. Komponentinnholdet steg med økende tørketemperatur innenfor et visst område. Når tørketemperaturen passerte 60 grader, forårsaket termisk dekomponering ved høy temperatur en merkbar nedgang i målstoffinnholdet. Derfor ble 60 grader valgt som initial optimal tørketemperaturbetingelse for påfølgende respons-overflateoptimalisering.

3.2 Box-Behnken Response-Surface Optimization and Verification

Sytten grupper av Box-Behnken eksperimentelle kjøringer ble fullført i henhold til designmatrise. Variansanalyseresultater indikerte at regresjonsmodeller for både akteosid- og echinakosidinnhold oppnådde statistisk signifikans (\\(P<0.05\)). The lack‑of‑fit terms were non‑significant (\(P>0.05\)), demonstrating satisfactory model‑fitting quality. Coefficient of determination \(R^2\) values were close to 1, illustrating high consistency between predicted values and practical measured experimental data. Factor‑influence rank for acteoside yield: slice thickness > drying temperature > steaming time. Factor‑influence rank for echinacoside yield: steaming time > drying temperature >skivetykkelse.

Gjennom matematisk modellberegning var teoretiske optimale prosesseringsparametre: skivetykkelse 0,600 cm, dampbehandlingstid 5,685 min, tørketemperatur 57,009 grader. Med tanke på den faktiske gjennomførbarheten for industriell drift, ble parametere justert til skivetykkelse 0,6 cm, damptid 6 minutter, tørketemperatur 57 grader. Tre parallelle valideringseksperimenter ble utført. Under denne praktiske betingelsen var målt akteosidinnhold 7,25 %, echinakosidinnholdet nådde 31,62 %. Avviket mellom målte verdier og teoretisk prediksjon holdt seg under 5 %, noe som beviser at denne respons-overflatemodellen var pålitelig og anvendelig for å veilede produksjonen av avkoksstykker i den virkelige verden.

3.3 Cytotoksisitetsscreening av optimalisert-behandletCistanche tubulosaTrekk ut i RAW264.7-celler

MTT-cytotoksisitetsresultater avslørte at ekstraktkonsentrasjoner i området 0-100 ug/mL ikke utøvde noen åpenbar toksisk effekt på RAW264.7-makrofager, og viste til og med mild celleproliferasjonsfremmende tendens. Når behandlingskonsentrasjonen steg til 200 ug/mL og 400 ug/mL, sank celleoverlevelsesraten betydelig sammenlignet med løsningsmiddelkontrollgruppen, noe som viste konsentrasjonsavhengig cytotoksisitet. Derfor ble konsentrasjonsgradienter på 12,5 ug/mL, 25 ug/mL, 50 ug/mL, 100 ug/ml valgt som sikre arbeidskonsentrasjoner for påfølgende oksidativt stress og betennelsesrelaterte cellulære analyser.

3.4 Cistanche tubulosaEkstraher redusert intracellulært ROS-nivå i LPS-stimulerte makrofager

Sammenlignet med løsningsmiddelkontrollgruppe økte den intracellulære ROS-fluorescensintensiteten til LPS-modellgruppen ekstremt betydelig (\\(P<0.001\)), confirming successful construction of cellular oxidative‑damage model. After intervention with gradient‑concentration Cistanche tubulosaekstrakt, intracellulær ROS-akkumulering avtok på doseavhengig måte. Hver legemiddelbehandlingsgruppe viste statistisk signifikant reduksjon av ROS versus LPS-modellgruppen (\\(P<0.001\)). This finding demonstrated that processed‑herb extract could effectively restrain excess ROS generation under inflammatory stimulation.

3.5 Effekter på NO- og MDA-innhold

NO fungerer som klassisk inflammatorisk mediator frigitt av aktiverte makrofager. MDA er en gullstandard biomarkør som reflekterer lipid-peroksidasjonsoksidativ skade. Sammenlignet med løsningsmiddelkontrollgruppe, økte LPS-stimulering markant NO- og MDA-innhold i RAW264.7-celler (\\(P<0.001\)). Different dosages of Cistanche tubulosaekstraktbehandling kan redusere NO-konsentrasjonen betydelig. For MDA-indikator: 12,5 ug/ml gruppe ga ikke statistisk signifikant forbedring; 25-100 ug/mL konsentrasjonsgrupper reduserte MDA-nivået observerbart (\\(P<0.001\)). The results illustrated that extracts alleviated LPS‑triggered lipid‑peroxidation injury and inflammatory‑mediator over‑production.

3.6 Virkninger på antioksidantrelaterte biokjemiske indikatorer SOD, CAT, LDH, GSH

Etter LPS-utfordring falt intracellulær SOD, CAT, LDH enzymatisk aktivitet samt GSH-innhold kraftig i forhold til løsningsmiddelkontrollgruppen (\\(P<0.001\)). Low‑dose (12.5 μg/mL) extract treatment could significantly raise SOD activity, but failed to generate prominent changes for CAT and LDH activity. Medium‑and‑high concentration groups (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL) concentration‑dependently enhanced SOD, CAT, LDH enzyme activities and intracellular GSH content (\(P<0.001\)). It indicated that optimally‑processed Cistanche tubulosaavkoksekstrakter kan gjenopprette cellulær endogen antioksidantforsvarskapasitet mot oksidative fornærmelser indusert av LPS.

3.7 Hemmende effekt på pro-inflammatorisk cytokin TNF‑, IL‑1, IL‑6 frigjøring

ELISA-deteksjonsresultater viste at LPS-stimulering sterkt fremmet sekresjonen av TNF-, IL-1, IL-6 fra RAW264.7-makrofager (\\(P<0.001\)). With the increase of Cistanche tubulosaekstraktbehandlingskonsentrasjon, ble frigjøringsmengden av disse tre viktige pro-inflammatoriske cytokinene gradvis undertrykt, noe som ga klar dose-respons korrelasjon. Den bekreftet at urteekstrakt utøvde en kraftig anti-inflammatorisk funksjon ved å begrense pro-inflammatorisk cytokinsekresjon fra aktiverte makrofager.

3.8 Forskrift om p38/AKT/JNK/NF‑κB signaleringsvei fosforylering

Western-blot eksperimentelle data viste at forholdene mellom p-p38/p38, p-AKT/AKT, p-JNK/JNK og p-NF-κB/NF-κB var signifikant forhøyet i LPS-modellgruppen versus løsemiddelkontrollgruppen (\\(P<0.001\)). Medium‑and‑high‑dosage Cistanche tubulosaekstraktintervensjon reduserte bemerkelsesverdig p-p38/p38 og p-JNK/JNK-forhold (\\(P<0.001\)). All concentration‑treatment groups obviously down‑regulated p‑AKT/AKT and p‑NF‑κB/NF‑κB phosphorylation level (\(P<0.05\) or \(P<0.001\)). These observations proved that Cistanche tubulosaavkoksekstrakt lindret oksidativ-inflammatorisk skade gjennom å undertrykke hyperfosforyleringsaktivering av p38/AKT/JNK/NF‑κB-signalnettverk.

4. Diskusjon

Tradisjonelle behandlingskrav registrert i kinesisk farmakopé forCistanche tubulosainkluderer hovedsakelig fjerning av urenheter, vasking, fukting, skjæring og tørking, uten å spesifisere nøyaktige numeriske parametere for skivetykkelse, dampvarighet og tørketemperatur. Ikke-standard manuell prosessering fører til store kvalitetssvingninger for kommersielle avkoksprodukter. Fenyletanoidglykosider (echinacosid og acteosid) er termisk labile bioaktive forbindelser. Feil oppvarmingstid eller temperatur vil utløse kjemisk nedbrytning og redusere medisinsk verdi. Enkeltfaktoreksperimentene våre viste at både utilstrekkelig og overdreven damping samt for høy tørketemperatur ville føre til tap av målglykosidkomponenter. Ytterligere Box-Behnken multifaktoroptimalisering oppnådde praktiske produksjonsparametere: skivetykkelse 0,6 cm, damping 6 min, tørking 57 grader. Under denne tilstanden nådde innholdet av akteosid og echinakosid 7,25 % og 31,62 %, noe som langt oversteg farmakopéens minstekvalitetsgrense. Denne optimaliserte protokollen gir mulige kvantitative tekniske referanser for standardisert industriell prosessering av Xinjiang-opprinnelseCistanche tubulosa.

Oksidativt stress og betennelse er tett sammenkoblede patologiske prosesser. Overflødig ROS induserer lipidperoksidasjon og genererer MDA, som ytterligere aktiverer medfødte immunmakrofager. Aktiverte makrofager skiller ut rikelig med NO og flere pro-inflammatoriske cytokiner, som omvendt forsterker intracellulær ROS-produksjon, og danner selvforsterkende oksidativ-inflammatorisk ond syklus. Naturlige planteavledede antioksidantstoffer kan bryte denne patologiske sløyfen ved å heve det endogene antioksidantenzymsystemet og begrense inflammatorisk signaloverføring. I denne in vitro-studien, optimalt behandletCistanche tubulosaavkoksekstrakter senket ROS-, NO- og MDA-nivåer, samtidig som de forbedret SOD, CAT, LDH-aktiviteter og GSH-innhold i LPS-stimulerte RAW264.7-makrofager. Samtidig hemmet det TNF-, IL-1, IL-6 pro-inflammatorisk-cytokinsekresjon, og demonstrerte integrert antioksidativt stress og anti-inflammatorisk kapasitet.

Mitogen-aktiverte-protein-kinase-familiemolekyler p38, JNK sammen med AKT og NF-κB utgjør sentralt signaltransduksjonsnav som medierer inflammatorisk-oksidative responser fra makrofager. Ved LPS-stimulering utløser oppstrømssignal fosforyleringsaktivering av p38, JNK og AKT, som sekvensielt fremmer NF-κB p65-underenhetsfosforylering og nukleær translokasjon. Aktivert NF-κB fungerer som transkripsjonsfaktor og initierer transkripsjon av store partier av pro-inflammatoriske cytokiner og oksidativt stressrelaterte gener. Våre Western-blot-resultater viste detCistanche tubulosaekstrakt kan undertrykke fosforylering av p38, JNK, AKT og NF‑κB p65. Derfor konkluderer vi at dets antioksidative stress og anti-inflammatoriske bioaktivitet oppnås, i det minste delvis, via blokkering av overaktivering av p38/AKT/JNK/NF-κB signalaksen.

Det er flere begrensninger innenfor dagens forskning. Alle funksjonelle verifikasjoner er begrenset til cellekulturnivå in vitro. Ytterligere dyremodell-in-vivo-eksperimenter er nødvendig for å verifisere in-vivo farmakodynamiske ytelser til optimaliserte avkoksstykker. I tillegg tok denne studien i bruk totalt blandet ekstrakt fra avkoksstykker, så vi kan ikke skille individuelle bidrag fra echinacosid, acteosid og andre mindre sekundære metabolitter. Oppfølgingsforskning kan isolere monomerforbindelser for å sammenligne respektive antioksidativt stressstyrke, og utføre kompatibilitetseffektundersøkelser. Likevel leverer vårt nåværende arbeid fortsatt praktiske prosesseringsteknologiske parametere og foreløpig mekanistisk bevis for utviklingCistanche tubulosa-relaterte helseprodukter.

5. Konklusjon

Avslutningsvis kan den moderniserte prosesseringsarbeidsflyten optimalisert av Box-Behnken respons-overflatemetodikk (skivetykkelse 0,6 cm, damping 6 minutter, tørketemperatur 57 grader) øke akteosid- og echinakosidinnholdet betydelig avCistanche tubulosaavkok biter. Ekstrakter tilberedt fra disse optimalt behandlede urteskivene utøver fremtredende antioksidativt stress og anti-inflammatoriske effekter mot LPS-indusert RAW264.7 makrofagskade. Den underliggende mekanismen er korrelert med gjenoppretting av intracellulært antioksidantforsvarssystem og hemming av overdreven aktivering av p38/AKT/JNK/NF‑κB inflammatorisk signalvei. Denne studien gir et solid eksperimentelt grunnlag for standardisert industriell produksjon og funksjonell-matutnyttelse avCistanche tubulosaressurser.

Referanser

Lin J, Yu H, Zhao Y, et al. Utvinning av echinacoside fraCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight og undersøkelse av dens beskyttende effekt på leverskade hos sepsisrotter. Food Sci Technol, 2023, 43:e010523.

Guo J, Tang S, Miao Y, et al. De antiinflammatoriske effektene av lignanglykosider fraCistanche tubulosastammer på LPS/IFN-induserte RAW264.7 makrofagceller via PI3K/AKT-veien. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2021, 22(10):1380-1391.

Rani V, Deep G, Singh RK, et al. Oksidativt stress og metabolske forstyrrelser: Patogenese og terapeutiske strategier. Livsvitenskap, 2016,148:183-193.

Park JH, Kim JH, Jang S I. Anti-inflammatorisk av dise-necionyl cis-khellactone i LPS-stimulerte RAW264.7-celler og dets hemmende aktivitet på løselig epoksidhydrolase. Heliyon, 2023,9(10):e21032.

Chung YC, Song S J. Isobavachin lindrer lipopolysakkarid-induserte inflammatoriske responser i makrofager ved å undertrykke MAPK- og NF-κB-signalveier. Journal of Ethnopharmacology, 2024,321:117501.

He X, Li Y, Deng B. PI3K/AKT-signalveien ved betennelse, celledød og gliaarrdannelse etter traumatisk ryggmargsskade. Cell Proliferation, 2022,55(9):e13275.