Abstrakt

Hudhyperpigmenteringsforstyrrelser, som melasma, fregner og postinflammatorisk hyperpigmentering (PIH), utløses ofte av ultrafiolett-B (UVB)-stråling, hudskader og lokal hudbetennelse. Overflødig melaninavleiring svekker hudens utseende og påvirker pasientens psykologiske velvære negativt. Konvensjonelle depigmenteringsmidler som hydrokinon retter seg først og fremst mot tyrosinase med enkeltmodusvirkning og har veldokumenterte sikkerhetsrisikoer. Multi-target naturlige botaniske blandinger har dukket opp som lovende alternativer for moderne funksjonell kosmetisk formulering.

Fenyletanoidglykosider (PhGs) er bioaktive signaturbestanddeler isolert fraCistanche deserticola, en velkjent medisinsk urt fra tørre ørkenområder. Glabridin (Gla), en prenylert isoflavan ekstrahert fraGlycyrrhiza glabra, er allment anerkjent som en naturlig sammensetning som lysner huden med høy styrke. Denne forskningen undersøkte systematisk den synergistiske anti-hyperpigmenteringsytelsen til PhGs kombinert med glabridin. In vitro biokjemiske analyser inkludert tyrosinaseinhibering, DPPH og ABTS⁺ fri-radikal-fjernende tester ble brukt for foreløpig masseforholdsscreening. Tre cellulære modeller ble videre konstruert: UVB-bestrålt B16F10 musemelanomcellepigmenteringsmodell; lipopolysakkarid (LPS)-stimulert HaCaT keratinocytt inflammatorisk modell; AAPH-indusert HaCaT oksidativt stressmodell. Indikatorer som dekker intracellulær tyrosinaseaktivitet, melanininnhold, pro-inflammatorisk cytokinfrigjøring (IL-6, TNF-), superoksiddismutase (SOD) og katalase (CAT) enzymaktivitet ble kvantifisert. Kombinasjonsindeksberegning (CI) ble implementert for å kvantitativt identifisere synergistisk interaksjon mellom de to botaniske ekstraktene.

Blant testede proporsjoner viste masseforhold m(PhGs):m(Gla)=1:1, 5:1 og 10:1 fremtredende tyrosinase-undertrykkende og antioksidantsynergi. Ved en total konsentrasjon på 0,4 g/l i fosfatbufret saltvann (PBS) med pH 6,8, nådde tyrosinaseinhiberingshastigheten 94,37 % (1:1), 92,93 % (5:1) og 88,06 % (10:1). Tilsvarende DPPH-radikalfjernende prosenter var 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %; ABTS⁺ kation-radikal-fjernende kapasitet oppnådde 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %. Ved arbeidskonsentrasjon 25 ug/ml viste alle tre sammensetningsformuleringene ingen signifikant cytotoksisitet mot B16F10- og HaCaT-cellelinjer. Den blandede 1:1-gruppen genererte overlegen omfattende effektivitet: gjenværende intracellulær tyrosinaseaktivitet falt til 23,80 %, det relative melanininnholdet falt til 30,90 %. Dessuten utøvde PhGs/Gla (1:1) sterkest undertrykkelse av IL-6- og TNF-sekresjon og gjenopprettet maksimalt SOD- og CAT-antioksidantenzymaktivitet. Eksperimentelle resultater bekreftet at PhG-er parret med glabridin oppnår synergistiske anti-hyperpigmenteringsresultater gjennom trippelveier: hemme melaninbiosyntese, dempe hudbetennelse og motvirke oksidativt stress. Masseforholdet 1:1 gir optimal integrert biologisk ytelse. Denne studien gir eksperimentelle bevis som støtter anvendelsen avCistanchefenyletanoidglykosider-glabridin-komposittmaterialer i ren-skjønnhet, planteavledet blekende hudpleie-råmaterialeutvikling.

Nøkkelord: Cistanche deserticolafenyletanoidglykosider; glabridin; synergistisk effekt; anti-hyperpigmentering; antioksidant; anti-inflammasjon; kosmetiske botaniske råvarer

1. Introduksjon

Overdreven akkumulering av melanin i epidermale lag resulterer i heterogene hudpigmenteringsfenotyper, inkludert melasma, efelider og postinflammatorisk hyperpigmentering (PIH) Google etter.... Flere ytre og indre drivende faktorer bidrar til patologisk overproduksjon av melanin. UVB ultrafiolett bestråling representerer den primære miljøutløseren; hudtraumer og kroniske lokale inflammatoriske responser forsterker pigmentforstyrrelser ytterligere. Det er veletablert at krysstale mellom epidermale keratinocytter og melanocytter dominerer pigmentprogresjon. Ved ekstern stimulering frigjør aktiverte keratinocytter reaktive oksygenarter (ROS) og pro-inflammatoriske mediatorer. Disse signalmolekylene diffunderer og virker på tilstøtende melanocytter, oppregulerer tyrosinase-katalytisk aktivitet, akselererer melaninsyntese og fremmer melanosomtransport mot keratinocytter, og produserer til slutt synlige pigmenterte lesjoner på hudoverflaten. Følgelig kan effektiv intervensjon for hyperpigmentering ikke bare fokusere på tyrosinaseinhibering. Multimodale terapeutiske strategier bør samtidig dekke melanogenese-hemming, anti-inflammatorisk intervensjon og oksidativt stress-nøytralisering.

Tradisjonelle syntetiske hudlysende aktive stoffer som hydrokinon gir depigmenterende effekt hovedsakelig ved direkte undertrykkelse av tyrosinase. Likevel begrenser enkeltmålsmekanismer den praktiske ytelsen, og langsiktig lokal hydrokinonpåføring kan utløse hudirritasjon, kontakteksem og potensielle sikkerhetsfarer, noe som begrenser bruksomfanget av kosmetisk kvalitet. Naturlige planteavledede bioingredienser tiltrekker seg økende interesse fra kosmetikkformidlere og forbrukere for deres milde profiler og multi-path farmakologiske virkninger. Sammensatte blandinger av forskjellige botaniske ekstrakter er i stand til å produsere synergistiske biologiske effekter, øke den totale effekten samtidig som de reduserer effektive doseringskrav, noe som åpner for nye tekniske retninger for antipigmentering av kosmetisk-råmaterialeforskningGoogle

Cistanche deserticola, ofte kalt "ørkenginseng", er en klassisk styrkende urt i tradisjonell kinesisk medisin. Moderne fytokjemiske undersøkelser viser at fenyletanoidglykosider (PhGs) utgjør dens viktigste farmakologisk aktive fraksjon, med echinacosid og acteosid som representative forbindelser. Publisert farmakologisk forskning viser at PhG-er har robust antioksidantkapasitet, anti-inflammatorisk bioaktivitet og moderat tyrosinaseinhiberende potensial, noe som innebærer potensielle bruksmuligheter i dermatologiske hudpleiematerialer. Glabridin er en karakteristisk isoflavonoid forbindelse isolert fraGlycyrrhiza glabraroot, velkjent innen kosmetikkindustrien som "blekingull". Det undertrykker kraftig melanogenese og modulerer samtidig kutane inflammatoriske kaskader. Fra tradisjonell medisin teoretisk perspektiv,Cistanchegir næring til nyreessens og tonifiserer yang, mens lakrisrøtter styrker milten og fjerner varmegift. Kombinert bruk samsvarer med sammensatte kompatibilitetsprinsipper for urte dermatologiske terapier.

Mekanistisk hypotese hevder at PhGs-glabridin-kombinasjon kan regulere hudpigmentering via multi-target og multi-path moduser: felles hemming av tyrosinase katalytisk funksjon for å kutte av melanin generasjon opprinnelse; slukke oppbygging av reaktive oksygenarter; begrense pro-inflammatorisk faktor over-frigjøring, for å avbryte ROS- og cytokin-mediert signalforsterkning for melanocyttaktivering. Til dags dato har få forskningsartikler systematisk rapportert synergistisk anti-hyperpigmenteringsevaluering for denne binære blandingen.

Denne artikkelen tar sikte på å utforske kombinatoriske biologiske effekter mellomCistanchefenyletanoidglykosider og glabridin. Biokjemiske in-vitro-enzymhemming og radikalfjernende screeningseksperimenter ble implementert først. Tre representative cellemodeller som etterligner pigmentavsetning, hudbetennelse og oksidativ skade ble konstruert for flerdimensjonal effektvurdering. Kombinasjonsindeksmetodikk ble brukt for å kvantifisere synergi- eller antagonismeinteraksjoner. Vi hadde som mål å bestemme det optimale masseforholdet mellom blandinger, klargjøre trippel-modus funksjonelle mekanismer og gi eksperimentell datastøtte for å utvikle naturlige synergistiske kosmetiske råmaterialer som lysner opp huden.

2. Materialer og metoder

2.1 Reagenser, cellestammer og laboratorieinstrumenter

B16F10 musemelanomcellelinje (STCC20013G-1) ble kjøpt fra Saierbio Co., Ltd. Udødeliggjort human epidermal keratinocytt HaCaT (iCell-h066) ble hentet fra iCell Bioscience Inc.CistancheFenylethanoidglykosider (PhGs) og glabridin (Gla) ble kommersielt levert av Shaanxi Tianxingjian Biochemical Technology Co., Ltd. Mushroom tyrosinase, arbutin, L-tyrosine, L-DOPA, DPPH, ABTS diammoniumcorbic acid, L-AA, X-100, DMSO og andre kjemiske reagenser av analytisk kvalitet ble hentet fra vanlige biokjemiske reagensleverandører. Forbruksvarer til cellekultur inkluderte DMEM-medium med høyt glukose, føtalt bovint serum, penicillin-streptomycin blandet løsning. ELISA-analysesett rettet mot human IL-6, TNF-, CAT og total-SOD-deteksjonssett ble anskaffet fra tilsvarende bioteknologiske produsenter.

Nøkkellaboratorieutstyr inneholdt Multiskan FC fullbølgelengde mikroplateleser, Heracell 371 CO₂-inkubator (Thermo Fisher); KQ‑200VDB ultralydsrenser; vannbad med konstant temperatur; DHG-9246A tørkeovn; KN4006B UVB ultrafiolett bestrålingsinstrument med utgangsbestråling på 8 mW/cm².

2.2 Klargjøring av prøveløsning

Stamløsninger av PhGs og glabridin ble fremstilt i pH 6,8 PBS-buffer eller 50 % (v/v) etanol-vann-løsningsmiddel, seriefortynnet til arbeidskonsentrasjoner: 0,001 g/l, 0,005 g/l, 0,025 g/l, 0,1 g/l, 0,01 g/l, 0,4 g/l, 0,4 g/l. 1,6 g/L, 2,0 g/L. Ni komposittgrupper ble konfigurert med fast total massekonsentrasjon på 0,4 g/L med varierte masseproporsjoner m(PhGs):m(Gla)=40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:40, betegnet som PhGla PhGs:1) (PhGla/1) (1:40).

For cellular‑experiment assays, powder samples were dissolved in serum‑free DMEM medium to prepare series of working‑concentration solutions.

2.3 Biochemical In‑vitro Assays

2.3.1 Tyrosinase-hemmingsanalyse

50 μL prøveløsning, 50 μL pH 6,8 PBS og 50 μL 1 g/LL-tyrosin substratløsning ble tilsatt sekvensielt i hver brønn på 96-brønners mikroplate. Pre-inkubasjonen fortsatte under 37 graders vannbad i 10 minutter. Deretter ble 50 μL 0,4 g/L sopptyrosinase-løsning (200 U/mL) tilsatt, og inkubasjonen fortsatte ved 37 grader i 10 minutter. Arbutin fungerte som en positiv kontrollsubstans, blindkontroll tok i bruk pH 6,8 PBS-buffer. Absorbansverdien ble målt under 490 nm bølgelengde på mikroplateleser. Beregningsformel for tyrosinasehemmingshastighet:

Tyrosinaseinhiberingshastighet (%)={1 − [(A_reaction − A_reaction-control) / (A_blank − A_blank-control)]} × 100 %

Hvor: A_reaksjon: absorbans som inneholder prøve, substrat, PBS og tyrosinase; A_reaction-control: absorbans av prøve, substrat og PBS uten enzym; A_blank: absorbans av substrat, PBS og tyrosinase; A_blank-kontroll: absorbans kun for underlag og PBS-buffer.

2.3.2 Bestemmelse av DPPH-frie radikaler

DPPH-pulver ble oppløst i vannfri etanol for å fremstille 0,2 mmol/L DPPH arbeidsvæske. PhG-er, glabridin og vitamin C-referansestoff ble oppløst i 50 % etanol-vann-løsningsmiddel for å danne stamløsninger med konsentrasjonsgradient. Binære blandingsprøver med ni masseforhold ble blandet jevnt. Hver brønn mottok 100 μL prøvevæske pluss 100 μL DPPH arbeidsløsning. Etter grundig blanding ble mikroplaten holdt unna lys ved omgivelsestemperatur i 30 minutter. Absorbansavlesning ble registrert ved λ = 517 nm. Vitamin C fungerte som positiv kontroll, hver forsøksgruppe ble gjentatt i 3 biologiske replikater. DPPH-rensehastighetsformel:

DPPH-rensehastighet (%)={1 − [(A₁ − A₃) / A₂]} × 100 %

A1: absorbans av prøve + DPPH arbeidsfluid; A₂: absorbance of 50 % ethanol + DPPH working fluid; A₃: absorbance of sample solution mixed with 50 % ethanol solvent.

2.3.3 ABTS⁺-kation-radikal-rensende analyse

7,4 mmol/L ABTS-stamløsning og 2,6 mmol/L kaliumpersulfatløsning ble blandet likt, inkubert i mørke omgivelser i 12 timer for å produsere stabil ABTS⁺-arbeidsreagens. Prøveløsninger ble konfigurert etter protokoller beskrevet i avsnitt 2.3.2. 40 μL prøveløsning og 160 μL ABTS⁺ arbeidsvæske ble pipettert til mikroplatebrønner. Etter lysskjermet inkubering i 6 minutter ved romtemperatur, ble absorbansen målt ved 734 nm. ABTS⁺ formel for radikalfjernende rate:

ABTS⁺ rensehastighet (%)={1 − [(A₁ − A₃) / A₂]} × 100 %

A1: absorbans av prøveløsning pluss ABTS+ arbeidsløsning; A₂: absorbans av avionisert vann blandet med ABTS⁺ arbeidsreagens; A₃: absorbansverdi for prøveløsning blandet med rent avionisert vannløsningsmiddel.

2.4 Cellekulturprosedyrer

B16F10 melanomceller og HaCaT-keratinocytter ble dyrket i DMEM-medium med høyt glukose supplert med 10 % føtalt-bovint serum og 1 % penicillin-streptomycin. Inkubatorparametere: 37 grader, 5 % volumfraksjon CO₂, relativ fuktighet 70 %. Cellepassasje og medium forfriskning ble utført i henhold til cellulær veksttetthet observert under invertert optisk mikroskop. Celler i logaritmisk vekstfase ble samlet for påfølgende såing på 96-brønners kulturplater.

2.5 Etablering av tre cellulære funksjonsmodeller

2.5.1 UVB-indusert B16F10-pigmenteringsmodell

Etter 1 times forbehandling med tilsvarende prøvemedium, ble cellelagets overflate dekket med PBS-buffer. UVB-bestrålingsintensitet ble satt til 8 mW/cm², bestrålingsavstand 3 cm, bestrålingsvarighet 110 s. Normal gruppe mottok identisk medium uten UVB-stråleintervensjon. Modellkontrollgruppen oppnådde PBS-forbehandling etterfulgt av lik dose UVB-eksponering uten prøvetilskudd.

2.5.2 LPS-mediert HaCaT inflammatorisk aktiveringsmodell

HaCaT-celler ble pre-inkubert med testprøve-DMEM-medium i 24 timer. Etterpå ble lipopolysakkarid LPS-løsning supplert for å nå en sluttkonsentrasjon på 20 ug/ml, og samkulturen varte i ytterligere 24 timer. Modellgruppeceller ble utfordret av LPS uten prøveforbehandling. Normal gruppe opprettholdt ordinær komplett-medium dyrking.

2.5.3 AAPH-utløst HaCaT-oksidativ-stressmodell

Celler mottok 24-timers prøvepreinkubasjon. AAPH-reagens ble tilsatt til kulturmediet, sluttkonsentrasjon 25 mmol/L, fortsatt 24-timers inkubering. Modellkontrollgruppen ble stimulert av AAPH uten prøveintervensjon. Normalkontrollgruppen vokste under vanlig middels tilstand.

Alle cellulære modellgrupper inneholdt tre tekniske replikatbrønner.

2.6 Cytotoksisitetstest (CCK-8-metoden)

Cellesuspensjon ble justert til tetthet 1 × 10⁴ celler/mL og inokulert til 96-brønners mikroplater. Etter cellevedheng ble gradientkonsentrasjonsprøvemedium administrert, og inkubasjonen fortsatte i 24 timer, 48 timer, 72 timer. CCK-8-deteksjonsreagens blandet med ferskt DMEM-medium (volumfraksjon 10 %) erstattet gammelt medium, inkubasjonen fortsatte i 60 minutter. Mikroplate-leser målte absorbans ved 450 nm bølgelengde. Beregningsformel for relativ cellelevedyktighetsprosent:

Cellelevedyktighet (%)=[(A_sample − A_blank) / (A_0 − A_blank)] × 100 %

A_prøve: absorbans av brønnholdige celler, CCK-8-reagens og prøvemedium; A_blank: absorbans for kulturmedium pluss CCK-8 uten utsåede celler; A_0: absorbans av celler og CCK-8-reagens dyrket med blankt medium (ingen testprøver).

2.7 Intracellulær tyrosinase-aktivitet kvantifisering

Etter 48 timers modelletableringsbehandling ble cellesupernatanten kastet. Cellemonolag ble vasket to ganger med pH 7,4 PBS. 50 μL 1 % Triton X-100 lyseringsløsning ble tilsatt per brønn. Mikroplate ble frosset ved -80 graders kjøleskap i 30 minutter, deretter tint under romtemperatur for full cellemembranbrudd. Forvarmingsbehandling ved 37 grader varte i 5 min. L-DOPA-substrat (10 mmol/L, 10 μL) ble supplert. Mikroplate ble inkubert i 1 time inne i CO2-inkubator. Absorbansen ble påvist ved 475 nm for å beregne relativ intracellulær tyrosinase-aktivitet.

2.8 Intracellulær måling av melanininnhold

NaOH-spaltningsmetoden ble tatt i bruk for påvisning av melanininnhold. Etter 72-timers modellintervensjon ble kultursupernatanten fjernet, celler skylt to ganger med PBS-buffer. 100 μL 1 mol/L NaOH vandig løsning inneholdende 10 % DMSO ble tilsatt. Mikroplate ble inkubert inne i 90 graders ovn i 60 minutter for fullstendig melaninoppløsning. Absorbansen ble lest ved 490 nm for å beregne relativ melanininnholdsprosent.

2.9 Påvisning av inflammatoriske faktorer og antioksidant-enzymindikatorer

Etter 48 timers modellbehandling ble HaCaT-celler skrapet og samlet, sentrifugert for å høste cellesupernatant. Kommersielle ELISA-sett ble brukt for kvantitativ bestemmelse av IL-6- og TNF-pro-inflammatoriske-cytokinkonsentrasjoner. For antioksidant-enzymtesting ble cellepelleter utsatt for gjentatte fryse-tine-sykluser for å oppnå cellefragmentering. Sentrifugeringstilstand: 12 000 r/min, 4 grader, 10 min. Supernatantfraksjon ble samlet for å analysere SOD-vitalitet og CAT-enzyminnhold i henhold til settets driftsspesifikasjoner.

2.10 Analyse av kombinasjonsindeks (CI).

Chou-Talalay kombinasjonsindeks (CI) algoritme ble implementert for å bedømme synergistisk/additiv/antagonistisk interaksjon mellom PhGs og glabridin innenfor tyrosinasehemming og antioksidantanalyser:

CI=D₁/DX₁ + D₂/DX₂

D₁ and D₂: individual mass‑concentration of PhGs and glabridin inside compound solution, when reaching fixed biological‑effect level X. DX₁ and DX₂: required mass‑concentration for single PhGs or glabridin to produce identical X‑level biological effect. CompuSyn software completed CI‑value computation. Evaluation criteria: CI >1 representerer antagonistisk interaksjon; CI ≈ 1 betyr additiv effekt; CI< 1 indicates significant synergistic‑enhancement effect.

2.11 Statistisk analyse

Eksperimentelle måleresultater ble uttrykt som middelverdi ± standardavvik (gjennomsnitt ± SD). GraphPad Prism 9.5.0 programvare utførte statistisk beregning. Enveis variansanalyse (ANOVA) ble brukt for multi-gruppe sammenligning. P-verdi< 0.05 was regarded as statistically significant difference; P < 0.01 marked significant difference; P < 0.001 stood for extremely significant statistical difference.
 

3. Resultater og diskusjon

3.1 In vitro tyrosinasehemmende ytelse av PhG-, Glabridin- og binære blandingsprøver

Half‑inhibitory concentration IC₅₀ values for single‑component PhGs PBS solution, glabridin PBS solution and positive‑control arbutin were (2.192 ± 0.038) g/L, (1.376 ± 0.025) g/L and (0.101 ± 0.003) μg/mL respectively. In‑vitro tyrosinase‑suppressing potency sequence: arbutin > glabridin >PhGs.

Ved en total konsentrasjon på 0,4 g/L for sammensatt PBS-løsning ga PhGs/Gla (10:1), PhGs/Gla (5:1), PhGs/Gla (1:1) en tyrosinaseinhiberingsgrad på 88,06 %, 92,93 %, 94,37 %. Både 5:1 og 1:1 forhold overgikk inhiberingseffektiviteten for enkeltkomponent PhGs (36,92 %) og enkeltkomponent glabridin (92,71 %) ved samsvarende total massekonsentrasjon. 1:1-gruppen oppnådde en hemmingsstørrelse som var sammenlignbar med positiv kontroll-arbutin. I henhold til CI-verdiberegningsresultater: m(PhGs):m(Gla) fra 40:1 til 1:1 generert CI< 1, confirming obvious synergistic enhancement on tyrosinase‑suppression. Conversely, proportion series from 1:5 up to 1:40 gave CI >1, manifesterer antagonistisk interaksjon.

Fenoliske hydroksylgrupper utgjør den funksjonelle kjernedelen for tyrosinaseinhiberende kapasitet. PhG-er inneholder orto-dihydroksyfenyl-strukturelle fragmenter som er i stand til å chelatere kobberioner i tyrosinase-katalytisk-aktiv lomme, og hindrer substrat-enzymbinding. Glabridin-isoflavan-skjelett bærer 2-OH- og 4-OH-grupper på B-ringen, strukturelt analogt med L-tyrosin / L-DOPA aromatisk hydroksyl-substituert ring, noe som muliggjør konkurrerende okkupasjon av enzymaktivt stedsdomene. Etter blanding av blandinger øker den kumulative fenol-hydroksylmengden; i mellomtiden kan to molekyler feste seg til distinkte bindingssteder av tyrosinaseprotein, og i fellesskap forsterke hemmende effektivitet.

3.2 Radikalfjernende antioksidantaktivitet i testprøver

DPPH‑scavenging IC₅₀ data: PhGs (21.135 ± 1.164 μg/mL), glabridin (55.537 ± 5.230 μg/mL), Vitamin C positive reference (2.852 ± 0.252 μg/mL). DPPH radical‑quenching‑ability ranking: Vitamin C > PhGs >glabridin. PhG er rikelig i koffeoylgruppe- og 3,4-dihydroksyfenyletanolgrupper, med konjugerte dobbeltbindingssystemer som styrker friradikal-nøytraliserende ytelse. Glabridin flavonoidrammeverk leverer også hydroksylgrupper og utvidet konjugert ringarkitektur for stabilisering av uparrede elektroner fra reaktive oksygenarter.

Tre lovende sammensatte grupper PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) ga utmerket DPPH- og ABTS⁺-fjernende ytelse. ABTS⁺-fjerningshastigheten nådde nesten 100 %, noe som indikerer nesten fullstendig eliminering av kationfrie radikaler. Ulike masseforhold produserer varierte molekylære interaksjonstilstander mellom to molekyler, noe som fører til ulikheter i hydroksylgruppeeksponeringsstatus og resulterer i divergens av antioksidantsynergistisk størrelse.

3.3 Cytotoksisitet Evaluering av PhGs, Glabridin og Blandede Preparater

CCK-8 cytotoksisitetstesting viste at PhG innenfor konsentrasjonsområdet 62,5 ~ 500 ug/mL og glabridin 6,25 ~ 25 ug/mL ikke utløste åpenbar levedyktighetsreduksjon for B16F10 og HaCaT cellelinjer. Under 25 ug/mL total massekonsentrasjon, opprettholdt tre forbindelsesforholdsgrupper PhGs/Gla (1:1, 5:1, 10:1) høy cellelevedyktighet, og viste ingen påvisbar cytotoksisk effekt mot begge cellestammene. Følgelig ble 25 ug/mL valgt som sikker arbeidskonsentrasjon for påfølgende cellulær funksjonsevaluering. For grupper med enkeltmiddel ble lav-/middels-/høy dose PhG definert som 125 ug/mL, 250 ug/mL, 500 ug/mL; glabridin lav-/middels-/høy dose: 6,25 ug/mL, 12,5 ug/ml, 25 ug/ml.

3.4 Påvirkning på intracellulær tyrosinase-aktivitet og melanininnhold i UVB-stimulerte B16F10-celler

Etter UVB-bestrålingsbehandling viste B16F10-modellgruppen statistisk signifikant økning i intracellulær tyrosinaseaktivitet og melaninakkumulering (P< 0.001), verifying successful construction of cellular pigmentation‑model. Both single‑agent PhGs and glabridin reduced tyrosinase‑activity and melanin level following concentration‑dependent tendency.

Ved samlet totalkonsentrasjon på 25 ug/ml viste sammensatte grupper overlegne biologiske resultater i forhold til motparter med én komponent. Blant tre forhold ga PhGs/Gla (1:1) optimal effekt: gjenværende intracellulær tyrosinaseaktivitet kun 23,80 %, det relative melanininnholdet falt til 30,90 %. Statistisk sammenligning viste signifikant forskjell sammenlignet med 5:1 og 10:1 sammensatte grupper. Andelen 1:1 manifesterte fremtredende synergistisk-amplifikasjon for å begrense melaninbiosyntesen inne i melanocyttceller.

UVB-bestråling provoserer melanocytt-intrinsisk melanogen signaleringskaskade, oppregulerer MITF-transkripsjonsfaktoruttrykk og induserer ytterligere tyrosinaseproteinoveruttrykk. Våre cellulære eksperimentresultater validerte at PhGs kombinert med glabridin effektivt kunne reversere UVB-indusert tyrosinaseaktivering og kutte ned melaningenerering.

3.5 Anti-inflammatorisk effekt mot LPS-utfordrede HaCaT-keratinocytter

LPS-stimulering økte sterkt IL-6- og TNF-pro-inflammatorisk-cytokinsekresjon i HaCaT-modellgruppe (P< 0.001), proving inflammatory‑model replication success. Individual PhGs and glabridin suppressed cytokine release in concentration‑dependent manner.

When comparing three compound ratios at 25 μg/mL, anti‑inflammatory potency sequence was PhGs/Gla (1:1) > PhGs/Gla (5:1) >PhGs/Gla (10:1). 1:1-formuleringen genererte maksimal reduksjon for IL-6 og TNF-frigjøring, og overskred den hemmende effekten oppnådd ved separat påføring av PhGs eller glabridin.

Forklaring av molekylær mekanisme: PhG-fenol-hydroksyl-delen fjerner inflammatorisk-utløsende frie radikaler; PhG-er kan dessuten forstyrre NF-κB og MAPK intracellulære signalkaskader for å begrense pro-inflammatorisk gentranskripsjon. Glabridin hemmer fosforylering av stressaktivert kinase JNK og p38, og blokkerer nedstrøms inflammatorisk signaloverføring. Enkelt stoff kan bare delvis undertrykke aktivering av inflammatorisk signalvei. Binær kombinasjon intervenerer samtidig flere noder i inflammatorisk-signaleringsnettverk, og oppnår synergistisk anti-inflammatorisk ytelse.

Kutan betennelse fungerer som kritisk oppstrømsdriver for PIH-forekomst. Inflammatoriske cytokiner utskilt av keratinocytter fungerer som parakrine signalerende budbringere, og stimulerer tilstøtende melanocytter for å akselerere melaninproduksjon og melanosomoverføring. Effektiv demping av epidermal betennelse er avgjørende for å forebygge og forbedre hyperpigmenteringslesjoner. Derfor gir den anti-inflammatoriske fordelen med PhGs-glabridin-forbindelsen ekstra verdi for bruk av anti-pigmenterende kosmetisk materiale.

3.6 Antioksidant-enzymregulerende kapasitet under AAPH-indusert oksidativ-stresstilstand

AAPH oksidativt-stress modellgruppe viste tydelig nedgang i intracellulær SOD og CAT antioksidant-enzym vitalitet (P< 0.001). Treatment with PhGs or glabridin alone could partially restore SOD and CAT activity. Among compound‑ratio groups, PhGs/Gla (1:1) displayed most powerful capability to elevate SOD and CAT enzyme level inside HaCaT cells.

Hud utsatt for ultrafiolett stråling genererer store mengder reaktive oksygenarter. Overflødig ROS oksiderer ikke bare direkte melaninsyntese-relaterte biomolekyler, men aktiverer også flere melanogene signalveier. Endogent antioksidant-enzymsystem (SOD, CAT) utgjør en viktig forsvarsbarriere for å eliminere intracellulær ROS. Når oksidativt stress overvelder den iboende antioksidantkapasiteten, akselererer ROS-akkumulering pigmenteringsprogresjonen. PhGs-glabridinforbindelsen fjerner ikke bare frie radikaler direkte via kjemiske fenol-hydroksylreaksjoner, men reparerer også cellulær antioksidant-enzymsystemfunksjon, og lindrer skade på oksidativt stress fra to dimensjoner. Ulike masseforhold endrer molekylært interaksjonsmønster mellom to naturlige molekyler, noe som resulterer i uoverensstemmelser i den endelige antioksidantregulerende effekten.

3.7 Omfattende mekanismediskusjon for synergistisk anti-hyperpigmentering

Hudhyperpigmenteringspatologiske prosesser danner et komplekst signalnettverk: UVB-bestråling virker på både melanocytter og omkringliggende keratinocytter. Keratinocytter frigjør ROS og pro-inflammatoriske cytokiner. Disse biosignalene aktiverer melanocytter ytterligere, oppregulerer tyrosinaseaktivitet, øker melaninbiosyntesen og letter melanosomtransport mot epidermale keratinocytter, noe som til slutt fører til synlig pigmentavsetning på hudoverflaten. Følgelig kan enkeltmåls tyrosinaseinhibering ikke fullstendig reversere patologisk pigmentering. Multi-path intervensjonsstrategi bør integrere melanogenese-hemming, anti-inflammasjon og antioksidantbeskyttelse.

Våre eksperimentelle resultater viste at PhGs kombinert med glabridin realiserer multimodal intervensjon mot hyperpigmentering:

Direkte undertrykke tyrosinase-katalytisk aktivitet inne i melanocytter for å hemme melaninbiosyntesekilden;

Hemmer pro-inflammatorisk-cytokin-oversekresjon fra keratinocytter, kutte av parakrine inflammatoriske stimuleringssignaler mot melanocytter;

Eliminer overflødig reaktiv-oksygen-arter og gjenvinn endogen SOD/CAT-antioksidant-enzymaktivitet, og reduserer oksidativt-stress-mediert pigmentamplifikasjon.

m(PhGs):m(Gla) = 1:1-forholdet viste optimal omfattende synergistisk ytelse på tvers av biokjemisk enzymhemming, radikalfjerning, melanocyttpigmentmodell, keratinocyttbetennelsesmodell og oksidativt stressmodell. Dette forholdet overgikk 5:1 og 10:1 grupper i nesten alle testindikatorer. Synergi kan stamme fra komplementære molekylær-strukturelle egenskaper: PhGs og glabridin har distinkte fenolskelettrammeverk, som interagerer med forskjellige målproteiner (tyrosinase, inflammatorisk-signalerende kinaser, antioksidant-enzym-relaterte veier). Etter blanding av blandinger, optimaliseres eksponeringsstatus for fenol-hydroksyl gjennom intermolekylær interaksjon, noe som øker den generelle biologiske aktiviteten.

For kosmetikkindustriens praktiske perspektiv, gir synergistiske botaniske sammensatte råmaterialer to store fordeler. For det første muliggjør synergistisk effekt reduksjon av nødvendig dose for hver enkelt aktive ingrediens, og reduserer formuleringskostnadene; For det andre matcher flerveis funksjonsprofil den komplekse patologiske mekanismen for klinisk observert hudhyperpigmentering som PIH og melasma, og tilbyr et teoretisk grunnlag for å utvikle høyeffektive naturlige hudopplysende kosmetiske formler.

4. Konklusjon

Denne forskningen evaluerte systematisk synergistisk anti-hyperpigmentering bioaktivitet avCistanche deserticola-avledetfenyletanoidglykosider (PhGs) kombinert med glabridin (Gla). Biokjemisk in vitro-screening og tre representative cellulære modeller ble brukt for flerdimensjonal effektkarakterisering. De viktigste eksperimentelle konklusjonene er oppsummert som følger:

Innenfor in vitro biokjemiske analyser for tyrosinaseinhibering og friradikal-fjerning, presenterte sammensatte formuleringer m(PhGs):m(Gla) = 1:1, 5:1, 10:1 gunstig hemmende ytelse og synergistisk-interaksjon. Under totalkonsentrasjon 0,4 g/L i pH 6,8 PBS, nådde tyrosinase-hemmingshastighetene 94,37 % (1:1), 92,93 % (5:1), 88,06 % (10:1). DPPH-radikalfjernende rater: 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %. ABTS⁺‑radikalfjernende rater: 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %.

Ved sikker arbeidskonsentrasjon 25 ug/ml, PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) DMEM-løsninger viste ingen cytotoksisitet mot B16F10 melanomceller og HaCaT humane keratinocytter. Blant disse gruppene oppnådde PhGs/Gla (1:1) best integrert effekt: intracellulær tyrosinaseaktivitet ble redusert til 23,80 %, melanininnhold redusert til 30,90 %. Det genererte sterkest hemming av IL-6, TNF-inflammatorisk-cytokinfrigjøring og maksimal restaurering for SOD og CAT antioksidant-enzym vitalitet. Masseforholdsgruppen 1:1 viste en åpenbar synergistisk-forsterkende effekt som var overlegen enkeltmiddelgrupper og andre sammensatte forholdsgrupper.

PhGs og glabridin binær blanding utøver en anti-hud-hyperpigmenterende effekt gjennom trippelveier: undertrykker melaninbiosyntesen, lindrer epidermal betennelse og motvirker skade på oksidativt stress. Det optimale synergistiske-masseforholdet m(PhGs):m(Gla) = 1:1. Denne studien gir eksperimentell bevis og teknisk støtte for å utvikle naturlige, planteavledede multifunksjonelle kosmetiske råmaterialer for hudopplysende og antipigmenteringsapplikasjoner.

Anerkjennelser

Dette arbeidet ble støttet økonomisk av National Natural Science Foundation of China (Grant No. 82160772). Vi takker Xinjiang Key Laboratory of Clinical Drug Research for støtte fra eksperimentell plattform.

Referanser

[1] Nautiyal A, Wairkar S. Håndtering av hyperpigmentering: Nåværende behandlinger og nye terapier[J]. Pigment Cell & Melanoma Research, 2021, 34(6):1000-1014.

[2] Yardman-Frank J M, Fisher DE. Hudpigmentering og dens kontroll: Fra ultrafiolett stråling til stamceller[J]. Experimental Dermatology, 2021, 30(4):560-571.

[3] Neagu N, Conforti C, Agozzino M, et al. Melasmabehandling: En systematisk oversikt[J]. Journal of Dermatological Treatment, 2022, 33(4):1816-1837.

[4] Hossain M R, Ansary TM, Komine M, et al. Diversifiserte stimuli-induserte inflammatoriske veier forårsaker hudpigmentering[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(8):3970.

[5] Song X, Ni M T, Zhang Y, et al. Sammenligning av de hemmende evnene til epigallocatechin-3-gallate og gallocatechin gallate mot tyrosinase og deres kombinerte effekter med kojinsyre[J]. Food Chemistry, 2021, 349(1):129172.

[6] Zolghadri S, Beygi M, Mohammad TF, et al. Målretting mot tyrosinase ved hyperpigmentering: Nåværende status, begrensninger og fremtidige løfter[J]. Biochemical Pharmacology, 2023, 212:115574.

[7] Cicero A L, Delevoe C, Gilles-Marsens F, et al. Eksosomer frigjort av keratinocytter modulerer melanocyttpigmentering [J]. Nature Communications, 2015, 6:7506.

[8] Serre C, Busuttil V, Botto J M. Intrinsic and extrinsic regulering av human hud melanogenese og pigmentering [J]. International Journal of Cosmetic Science, 2018, 40(4):328-347.

[9] Irfan M, Shafeeq A, Siddiqui U, et al. En mekanistisk tilnærming for toksisitet og risikovurdering av tungmetaller, hydrokinon og mikroorganismer i kosmetiske kremer[J]. Journal of Hazardous Materials, 2022, 433:128806.

[10] Zheng Y, Du X S, Zhang L, et al. Hydrokinon-indusert hudirriterende reaksjon kan oppnås ved å aktivere mastceller via mas-relatert G-proteinkoblet reseptor X2[J]. Experimental Dermatology, 2023, 32(4):436-446.

[11] Meng H, Liu X K, Li J R, et al. Bibliometrisk analyse av effekten av ginseng på huden [J]. Journal of Cosmetic Dermatology, 2022, 21(1):99-107.

[12] Liu F, Qu L K, Li H, et al. Fremskritt i biomedisinske funksjoner av naturlige blekingsstoffer i behandlingen av hudpigmenteringssykdommer [J]. Pharmaceutics, 2022, 14(11):2308.

[13] Wang T T, Zhang D, Wang Y J, et al. Synergistisk hudpleie av Lonicera japonica polyfenoler og etanolekstrakt av Vaccinium vitis-idaea L.[J]. Fine Chemicals, 2023, 40(3):627-637.

[14] Wu Y, Liu Q, Tang W, et al. Anvendelse av komplekser av Salvia miltiorrhiza flyktig olje og løvetannekstrakt i kosmetikk[J]. Fine Chemicals, 2022, 39(3):562-568.

[15] Chen JR, Zhu XY, Cui HY, et al. Variasjoner av aktive ingredienser og antioksidantaktivitetsanalyse av Cistanche deserticola fra forskjellige raser og deler i Xinjiang-provinsen[J]. Food Industry Science and Technology, 2024, 45(21):227-233.

[16] Xiao L Y, Yao J, Miao Y Y, et al. Tubuloside B, isolert fra Cistanche tubulosa, et lovende middel mot M1 makrofagaktivering via synergistisk målretting mot Mob1 og ERK1/2[J]. Biomedisin og farmakoterapi, 2022, 153:113414.

[17] Xu H H. Studie på fenyletanoidglykosidene av Herba cistanches transdermal levering og hemmende effekter på melaninsyntese i B-indusert pigmentering hos brun marsvin[D]. Urumqi: Xinjiang Medical University, 2020.

[18] Huang J, Xie C, Pan Z. Synergistisk bleking, antioksidant og anti-inflammatorisk aktivitet av glabridin, resveratrol og poldatin kompleks[J]. Flavor Fragrance Cosmetics, 2024(3):99-107 233.

[19] Wang S Q, Zhu Y Z, Zheng X B. Studie og anvendelse av Chou-Talalay-metoden for kombinasjon av antitumormedisiner[J]. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy, 2013, 30(4):449-453.

[20] Pillaiyar T, Manickam M, Namasivayam V. Hudblekingsmidler: Medisinsk kjemiperspektiv av tyrosinasehemmere[J]. Journal of Enzyme Inhibition & Medicinal Chemistry, 2017, 32(1):403-425