Abstrakt

Denne studien etablerte en tynnsjiktskromatografimetode (TLC) basert på bildedigitalisering for rask, enkel og rimelig påvisning av fire store fenyletanoidglykosider (PhGs) i Cistanche. De fire PhG-ene ble ekstrahert med 50 % metanol og separert på en polyamidplate med en mobil fase bestående av metanol-kloroform-iseddik-vann (3,5:1,5:1:7, V/V/V/V). Spotbilder ble tatt under 365 nm UV-lys og digitalt analysert ved hjelp av ImageJ-programvare, som genererte integrerte gråverdier for rask kvantitativ analyse. Metoden viste utmerket linearitet forechinacosid, tubulosid A, acteosid og isoacteosid, med korrelasjonskoeffisienter (r) på henholdsvis 0,9974, 0,9931, 0,9923 og 0,9890. Gjenvinningene varierte fra henholdsvis 87,1 % til 96,5 %, 88,4 % til 109,7 %, 94,1 % til 105,1 % og 97,0 % til 115,1 %. De kvantitative resultatene oppnådd med denne metoden var i samsvar med resultatene fra høyytelses væskekromatografi (HPLC). Denne studien gir en rask og nøyaktig metode for kvantitativ analyse av fire sentrale PhG-er i Cistanche.

Nøkkelord:Cistanche tubulosa; fenyletanoidglykosider; tynnsjiktskromatografi; ImageJ; rask cistanche kvalitetsanalyse

 

Cistanche-ekstrakt med høyt innhold av echinacoside

 

 

 

 

1. Introduksjon

Cistanche er en flerårig parasittisk urt fra Orobanchaceae-familien, hovedsakelig funnet i Xinjiang, Indre Mongolia og Ningxia-regionene i Kina. Som en planteressurs med både medisinsk og spiselig verdi, har dens tørkede saftige stilker vist betydelig økonomisk potensial på tvers av flere bransjer. Blant de forskjellige Cistanche-artene,Cistanche deserticolaogCistanche tubulosaer offisielt oppført iKinesisk farmakopé, mens begge arter, sammen medCistanche salsa, er anerkjent som råstoffet "Nikujuyou" i den japanske farmakopéen. Dessuten spiller Cistanche en avgjørende rolle i å forbedre det økologiske miljøet i tørre områder, siden samplanting med vertsplanter gir betydelige økologiske og økonomiske fordeler til ørken- og halvørkenområder.

 

Cistanche-ekstrakt med et spesifikt innhold av flavonoid

I tradisjonell kinesisk medisin (TCM) er Cistanche høyt ansett som en utmerket tonic. I 2020 ble den godkjent som en ny matingrediens i Kina, noe som utvidet markedet og produktutviklingen betydelig. Cistanche brukes ikke bare til å behandle nyre-yang-mangel, uttømming av blod og essens, impotens og infertilitet og forstoppelse, men viser også et lovende potensiale for behandling av leverfibrose. Kjemiske sammensetningsstudier har identifisert fenyletanoidglykosider (PhGs) som en av de viktigste aktive komponentene i Cistanche. Disse forbindelsene - inkludert echinacosid, acteosid, tubulosid A og isoacteosid - viser et bredt spekter av farmakologiske effekter, inkludert antialdrings-, antioksidant-, anti-tretthets- og avføringsegenskaper. Echinakosid og akteosid er de offisielle markørkomponentene for kvalitetskontrollen av Cistanche i farmakopéstandarder. Tubulosid A viser betydelig antiinflammatorisk og antioksidantaktivitet, mens isoacteosid har vært assosiert med kognitiv forbedring og cytobeskyttende effekter.

Tradisjonelle analytiske metoder for PhGi Cistanche inkluderer høyytelses væskekromatografi (HPLC), ultrahøyytelses væskekromatografi (UPLC) og væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS). Disse metodene er imidlertid avhengige av kostbar instrumentering, krever tidkrevende prøveforberedelse og krever svært dyktige operatører. Selv om nær-infrarød (NIR) spektroskopi tilbyr et raskt og ikke-destruktivt alternativ, avhenger den fortsatt av store NIR-instrumenter og er ikke lett bærbar. Følgelig er det et presserende behov for en rimelig, enkel å betjene og bærbar metode som er egnet for kvalitativ og kvantitativ analyse på stedet, spesielt for primære testapplikasjoner.

De siste årene har fremskritt innen datasynsteknologi muliggjort bildegjenkjenning og prosessering for å forbedre tradisjonelle analytiske teknikker, noe som gjør TLC til en effektiv kvantitativ metode. Denne tilnærmingen korrelerer gråverdien til prøveflekker med konsentrasjonen deres. ImageJ, en åpen kildekode bildebehandlingsprogramvare, skiller seg ut for sin brukervennlighet og allsidighet. For eksempel, Bai et al. utviklet en TLC-ImageJ-metode for kvantifisering av aminosmørsyre (GABA) i ris, og validerte gjennomførbarheten av denne tilnærmingen for bildebasert kvantitativ analyse.

I denne studien fanget vi TLC-punktbilder av fire store PhG-er i Cistanche, etablerte et lineært forhold mellom PhG-innhold og integrerte gråverdier, og oppnådde kvantitativ analyse av alle fire forbindelsene. Denne tilnærmingen tilbyr en ny løsning for rask, lavkostdeteksjon på stedet og har et bredt brukspotensial.

Om Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd.- verdens største Cistanche-foredlingsselskap, med en Cistanche-dyrkingsbase på 200 000 mål, en GMP-fabrikk som er i stand til å behandle 20 000 tonn fersk Cistanche årlig, og over 14 patenter relatert til Cistanche-ekstraksjonsteknologier, inkludert avansert membranseparasjonsteknologi. Vi spesialiserer oss på Cistanche-ekstrakter med opprinnelse fra Hotan, Xinjiang, og produktene våre oppfyller internasjonale kvalitetsstandarder i USA og EU. Det viktigste er at vi fokuserer påCistanche tubulosaekstrakt, som naturlig inneholder et høyere innhold av fenyletanoidglykosider, inkludert echinacoside, acteosid, tubulosid A og isoacteosid, noe som gjør det til det overlegne valget for nutraceutical og funksjonell mat.

 

Cistanche-ekstrakt med et spesifikt innhold av akteosid

2. Materialer og metoder

2.1 Instrumenter og reagenser

Utstyr:1000T multifunksjonell kvern (MinYe Industry and Trade Co., Yongkang, Kina); AB135-S analytisk balanse (Mettler-Toledo, Sveits); GAMAG LINOMAT 5 halvautomatisk spotter (CAMAG, Sveits); UV-lampe (CAMAG, Sveits); 1200-serien HPLC-system (Agilent, USA); Advanced-III-18W ultrarent vannsystem (Tang's Kangning Technology, Chengdu, Kina); polyamid TLC-plater (10 cm × 10 cm, 10 cm × 20 cm; Sijia Biochemical Plastics, Taizhou, Kina); to-trau fremkallingskammer (200 mm × 200 mm).

Reagenser:Metanol (analytisk klasse, Beilian Fine Chemicals, Tianjin, Kina); metanol og acetonitril (kromatografikvalitet, Sigma-Aldrich, Shanghai, Kina); iseddik (analytisk karakter, Zhiyuan Chemical Reagents, Tianjin, Kina); maursyre og kloroform (analytisk kvalitet, Damao Chemical Reagents, Tianjin, Kina); ultrarent vann. Referansestandarder for echinakosid, tubulosid A, akteosid og isoakteosid (renhet større enn eller lik 98 %, Yinglai Technology, Beijing, Kina).

Eksempler:Ferske Cistanche-prøver ble hentet fra Xinjiang, Kina, og behandlet av Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd. Totalt 51 batcher avCistanche tubulosaog 8 partier avCistanche deserticolable samlet, skåret i skiver, tørket, malt til pulver og forseglet for lagring.

Bildeanskaffelse:iPhone 15 Pro (12MP oppløsning, F2.2 blenderåpning, 2× optisk zoom).Programvare for digitalisering av bilder:F Color Picker (Deweibo) og ImageJ (versjon 1.54p, National Institutes of Health, USA).

2.2 Eksperimentelle metoder

2.2.1 Utarbeidelse av referansestandardløsninger

Echinacosid, tubulosid A, acteosid og isoacteosid referansestandarder ble nøyaktig veid, oppløst i 50% (V/V) metanol og fortynnet til volum i 10 ml kolber for å oppnå stamløsninger i konsentrasjoner på 1,003, 1,007, 1,004, og 1,000 mg/l.

Alikvoter av hver stamløsning (echinacosid 2 ml, tubulosid A 0,5 ml, acteosid 1 ml, isoacteosid 0,5 ml) ble overført til en 10 ml kolbe, fortynnet til volum med 50 % metanol og filtrert gjennom en 0,22 μm som inneholdt en blanding av 2 referanseløsninger, 200 mm membran. henholdsvis 52,40, 101,12 og 51,14 ug/ml.

2.2.2 Klargjøring av testprøveløsninger

Cistanche-prøver ble skåret i skiver, tørket og malt for å passere gjennom en 0,425 mm sikt. C. tubulosa-pulver (0,5 g) eller C. deserticola-pulver (1,0 g) ble nøyaktig veid, blandet med 30 ml 50 % metanol, sonikert i 40 minutter og veid på nytt for å kompensere for vekttap. Løsningen ble filtrert gjennom en 0,22 μm membran for å oppnå testprøveløsningen.

2.2.3 TLC-utvikling av løsningsmiddelvalg

Basert på løsemiddelpolaritet, elueringsstyrke og foreløpige eksperimentelle resultater, ble tre utviklende løsningsmiddelsystemer evaluert:

System 1: Metanol-iseddik-vann (2:1:7, V/V)

System 2: Metanol-kloroform-iseddiksyre-vann (2:1,5:1:7, V/V)

System 3: Metanol-kloroform-iseddik-vann (3,5:1,5:1:7, V/V)

Alikvoter (5 μL hver) av den blandede referansestandardløsningen og testprøveløsningen ble påført som bånd på polyamid-TLC-plater. Etter utvikling ble platene tørket, og retardasjonsfaktorene (Rf-verdier) ble beregnet.

2.2.4 Bildeinnhenting og -behandling

TLC-plater ble fikset og undersøkt under 365 nm UV-lys. En iPhone 15 Pro montert på et stativ ble brukt til å ta bilder fra en jevn vinkel og høyde. F Color Picker og ImageJ-programvare ble brukt for digital kvantitativ analyse, og konverterte TLC-bilder til RGB-verdier, toppområder og integrerte gråverdier. Bakgrunnssubtraksjon og bildeinversjon ble utført ved bruk av ImageJ. Bildene ble deretter konvertert til 8-bits gråtoner, re-invertert og kontrastjustert for visualisering. Målbånd ble valgt for integrasjonsanalyse ved bruk av grå verdier for kvantifisering.

 

Cistanche-ekstrakt spesifikasjonsliste

Besøk Cistanche World Shop

 

 

 

 

3. Resultater og diskusjon

3.1 Valg av utviklende løsemiddel

Rf-verdiene til de fire PhG-ene ble systematisk sammenlignet på tvers av de tre utviklende løsningsmidlene som ble testet. Løsemiddelsystem 1 og 2 viste utilstrekkelig polaritet, noe som resulterte i flekker som ikke migrerte utover halve platehøyden og dårlig separasjon. Løsningsmiddelsystem 3 (metanol-kloroform-iseddik-vann, 3,5:1,5:1:7, V/V/V/V) ga skarpe og klart adskilte flekker med Rf-verdier på 0,67 (echinacoside), 0,38 (tubulosid A), 0,28 (acteoside), (acteoside), (acteoside). Derfor ble System 3 valgt for alle påfølgende TLC-analyser.

3.2 Metodevalidering

3.2.1 Valg av kalibreringskurve og bildebehandlingsmetode

Blandede referansestandardløsninger ved fem konsentrasjonsnivåer ble fremstilt, og 5 μL av hver ble analysert ved TLC. Bilder ble behandlet ved bruk av ImageJ, og kalibreringskurver ble konstruert ved å plotte konsentrasjon (x, ug/mL) mot integrert gråverdi (y). De lineære områdene var 21–210 ug/ml for echinakosid, 5,2–52 ug/ml for tubulosid A, 10,1–101 ug/mL for akteosid og 5,2–52 ug/ml for isoakteosid.

Tre bildedigitaliseringsmetoder ble sammenlignet:

– ved å bruke ImageJ til å måle gjennomsnittlig punktgråverdi × pikselområde (Ctrl + M).

Toppområde– generering av konturplott og måling av punkttoppareal ved hjelp av stavverktøyet.

RGB-verdier– bruk av F Color Picker for å oppnå R-, G-, B-kanalintensiteter ved punktsenteret, med optimaliserte kombinasjoner (2G+B for echinacosid, R for tubulosid A, 2R+G for acteosid og isoacteosid).

Blant disse metodene ga den integrerte gråverditilnærmingen de høyeste korrelasjonskoeffisientene (r Større enn eller lik 0,9890), noe som indikerer overlegen nøyaktighet for TLC-bildedigitalisering.

3.2.2 Begrensninger for deteksjon og kvantifisering

LOD og LOQ ble beregnet som LOD=3.3σ/S og LOQ=10σ/S (hvor σ=standardavvik for skjæringspunktet og S=helning av kalibreringskurven). LOD-verdiene var 0,041 ug/bånd (echinakosid), 0,005 ug/bånd (tubulosid A), 0,008 ug/bånd (akteosid) og 0,011 ug/bånd (isoakteosid). De tilsvarende LOQ-verdiene var henholdsvis 0,138, 0,017, 0,026 og 0,037 ug/bånd.

3.2.3 Presisjon, stabilitet og repeterbarhet

Det relative standardavviket (RSD) for integrerte gråverdier for de fire PhG-ene varierte fra 0,56 % til 2,4 % for presisjon, 0,76 % til 2,2 % for stabilitet og 0,61 % til 1,9 % for repeterbarhet, noe som tyder på god metodeytelse.

3.2.4 Gjenoppretting

Gjennomsnittlig utvinning varierte fra 87,1 % til 96,5 % (echinakosid), 88,4 % til 109,7 % (tubulosid A), 94,1 % til 105,1 % (akteosid) og 96,9 % til 115,1 % (isoakteosid), noe som viser tilfredsstillende nøyaktighet.

3.3 Reell prøveanalyse: TLC-ImageJ vs. HPLC

TLC-ImageJ-metoden ble brukt for å kvantifisere de fire PhG-ene i 51 batcher avCistanche tubulosaog 8 partier avCistanche deserticola. Kvantitative resultater ble validert mot HPLC-analyse ved bruk av parede t-tester, som ikke viste noen statistisk signifikante forskjeller mellom de to metodene for alle fire PhGs i C. tubulosa og for echinacoside og acteosid i C. deserticola (P > 0,05).

Resultatene bekreftet at TLC-ImageJ nøyaktig kan kvantifisere ikke bare farmakopémarkørkomponentene (echinacosid og acteosid), men også tubulosid A og isoacteosid, som vanligvis ikke er inkludert i rutinemessig kvalitetskontroll. Den gode avtalen mellom TLC-ImageJ og HPLC validerer gjennomførbarheten av denne raske analytiske tilnærmingen for Cistanche-kvalitetsanalyse.

3.4 Fordeler med TLC-ImageJ-metoden for Cistanche-kvalitetsanalyse

TLC-ImageJ-metoden tilbyr flere viktige fordeler:

Ingen ekstra fargetrinn– flekker er direkte synlige under 365 nm UV-lys som blå fluorescens.

Høy gjennomstrømning– 8–10 prøver kan analyseres samtidig på en enkelt TLC-plate.

Rask analyse– fullfør kvantitativ analyse innen 30 minutter.

Bærbar og rimelig– krever bare grunnleggende TLC-utstyr og en smarttelefon, noe som eliminerer avhengigheten av faste laboratoriefasiliteter.

Allsidig– gjelder for flere PhG-er utover farmakopémarkører, noe som muliggjør omfattende kvalitetsanalyse.

TilCistanche tubulosaekstraktleverandører som Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., gir denne metoden et praktisk verktøy for rask prosess- og sluttproduktkvalitetsanalyse, og sikrer konsistent PhG-innhold på tvers av partier for å møte de høye standardene som forventes av den ernæringsmessige, funksjonelle mat- og farmasøytiske industrien i det amerikanske og europeiske markedet.

 

 

4. Konklusjon

Denne studien etablerte en TLC-bildedigitaliseringsmetode for rask kvantitativ analyse av fire store fenyletanoidglykosider i Cistanche: echinakosid, tubulosid A, acteosid og isoakteosid. Metoden er på linje med de fysisk-kjemiske egenskapene til målforbindelsene, krever ingen ekstra farging og muliggjør samtidig analyse av 8–10 prøver på en enkelt TLC-plate innen 30 minutter. De kvantitative resultatene oppnådd med denne metoden samsvarer med resultatene fra HPLC, og validerer dens nøyaktighet og pålitelighet.

Metoden er spesielt godt egnet for primære testapplikasjoner og feltbasert kvalitetsanalyse, siden den er avhengig av bærbart, rimelig utstyr og reduserer avhengigheten av laboratorieinfrastruktur. Den har allerede blitt implementert i Cistanche-dyrking, prosessering og forskningsanlegg i Xinjiang, Kina, og demonstrerer dens praktiske nytte.

 

Wecistanche fabrikk for dyrking og bearbeiding av cistanche

 

Supportive Service Of Wecistanche-For mer informasjon om samarbeid
E-post:wallence.suen@wecistanche.com

 

Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., verdens største Cistanche-behandlingsselskap, er stolte av å bruke og markedsføre denne avanserte, men likevel tilgjengelige kvalitetsanalysemetodikken. Med vår 200 000 mål store Cistanche-base, GMP-sertifiserte produksjonsanlegg og toppmoderne membranseparasjonsteknologier, leverer vi premiumCistanche tubulosaekstrakter med naturlig høyere nivåer av fenyletanoidglykosider, opp til bransjeledende spesifikasjoner. Våre produkter oppfyller amerikanske og EUs internasjonale kvalitetsstandarder og er egnet for et bredt spekter av bruksområder, inkludert TCM-avkok, funksjonell mat, helseprodukter, kosttilskudd, farmasøytiske produkter og kosmetikk.

Ettersom den globale etterspørselen etter Cistanche-tilskudd fortsetter å vokse – med markedet anslått til å nå 1,13 milliarder dollar innen 2033, drevet av økende forbrukerinteresse for naturlig anti-aldring, kognitiv helse og vitalitetsprodukter – blir viktigheten av pålitelige, raske kvalitetsanalysemetoder avgjørende. TLC-ImageJ-metoden som presenteres her gir en praktisk løsning for produsenter, leverandører og reguleringsorganer for å sikre konsistent produktkvalitet, og dermed støtte den fortsatte utvidelsen av Cistanche-industrien i USA, Europa og utover.

 

 

Referanser

[De originale referansene er bevart og tilpasset for den engelske oversettelsen.]

Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd.

Nettsted: www.xjcistanche.com

Spesialiserer seg på høy-fenyletanoid-glykosidCistanche tubulosaekstrakter

Sertifisert med SC, HACCP, SOCA, NOP (US Organic Program) og International Organic Crop Improvement Association (OCIA) sertifiseringer

USA og EU-markedet