Acteosid avledet fra Cistanche forbedrer glukokortikoid-indusert osteoporose ved å aktivere PI3K/AKT/mTOR-veien

Abstrakt

Objektiv

Glukokortikoider er mye brukt i klinisk praksis; imidlertid kan de gi bivirkninger, som f.eksosteoporose. Acteosid(ACT) fra Cistanche har blitt brukt til å bekjempe en rekke sykdommer. Studien ble utført for å evaluere effekten av ACT i glukokortikoid-indusertosteoporose(GIOP) og dens potensielle mekanisme.

Metoder
Deksametason (Dex) ble injisert intramuskulært for å indusereosteoporosei en rottemodell, og ACT ble gitt oralt. ACT ble supplert in vivo i Dex-stimulertosteoblastiskMC3T3-E1-celler. RT-qPCR ble utført for å vurdere mRNA-nivåene avbeindannelse(Runx2, CoL1A1), og benresorpsjon (OPG og RANKL). Et kommersielt ELISA-sett ble brukt for å vurdere serum OC- og CTX-nivåer. Western blot ble utført for å vurdere proteinnivåer i PI3K/AKT/mTOR-signalveien. CCK-8-analyse og flowcytometri ble utført for å vurdere osteoblast-levedyktighet og apoptose.

Klikk her for å få Cistanche Acteoside For Treat Dex-stimulert osteoblastisk

Resultater
ACT reduserte Dex-indusert forverring av benmikrostruktur, økte serumnivåer av OC og reduserte nivåene av CTX (P< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and fremmet apoptose; denne effekten ble imidlertid sterkt dempet av ACT (P< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).

Konklusjon
ACT fraCistanchekan utøve osteoprotektive effekter ved å aktivere PI3K/AKT/mTOR-signalveien for å lindre Dex-indusert osteoporose.

Nøkkelord:Acteosid Cistancheglukokortikoider-indusertosteoporose

Introduksjon
Osteoporose (OP) er en generalisert skjelettsykdom preget av lav benmasse, ødeleggelse av benvevsmikrostruktur og ubalanse i benhomeostase [1]. OP forårsaker mer enn 8,9 millioner brudd per år og osteoporotiske brudd oppstår nesten hvert 3. sekund, og fører til livslang funksjonshemming eller død [2]. Glukokortikoider (GC) administreres vanligvis for behandling av ikke-infeksiøse inflammatoriske sykdommer (som astma og inflammatorisk tarmsykdom) samt autoimmune tilstander [3]. Langvarig GC-bruk disponerer imidlertid for mer enn 30 prosent av OP-tilfellene og mer enn 10 prosent av osteonekrosetilfellene [4]. GC-er hemmer direkte proliferasjon og differensiering av osteoblaster [5], reduserer modning og aktivitet, og induserer apoptose av osteoblaster, som igjen fører til utvikling av glukokortikoid-indusert osteoporose (GIOP) [6]. Videre tyder økende bevis på at osteoblastdysfunksjon er hovedårsaken til bentap. Derfor ser en økning i antall og funksjon av osteoblaster ut til å være hovedstrategien for å forebygge OP, spesielt GIOP.

Urtemedisiner, spesielt de basert på naturlige forbindelser, har blitt praktisert i tusenvis av år for behandling av ulike sykdommer [7]. Cistanche er en dyrebar urt registrert i den kinesiske farmakopeen som vokser i det sørlige området av den autonome regionen Xinjiang Uygur og er kjent som ørkenginseng [8]. Cistanche har vist seg å ha ulike effekter, som immunforsterkning, nyrebeskyttelse, anti-aldring, antioksidant, anti-inflammatorisk og nevrobeskyttende effekter [9].Acteosid(ACT) er et fenyletanolisk glukosid i Cistanche, som har biologiske aktiviteter, slik som hemming av neuronal apoptose [10], lindring av leverskade [11], anti-inflammasjon [12], antioksidasjon [13] , forebygging av diabetes [14], og fedme [15], samt degenerasjon av leddbrusken [16]. Videre har flere studier rapportert farmakokinetikken til ACT og bekreftet at den terapeutiske effekten eksisterer selv om den orale utnyttelsen bare er 0,12 prosent. ACT regnes som et prodrug med aktive metabolitter in vivo [17].

Zhang et al. viste en potensiell beskyttende effekt av ACT på ovariektomi-indusert bentap hos rotter [18]. ACT modulerer IGF-1/PI3K/mTOR-signalveien for å forhindre bentap hos diabetiske rotter [19]. PI3K/AKT/mTOR-veien har blitt rapportert å ha kritiske regulatoriske roller i ulike sykdommer, inkludert GIOP [20]. Naringin lindrer GIOP ved å regulere PI3K/AKT/mTOR-signalveien [21]. I tillegg regulerer denne signalveien osteoblastdifferensiering [22], bendannelse [23] og bruddheling [24]. Imidlertid er den potensielle rollen til ACT på GIOP og om den reguleres av moduleringen av PI3K/AKT/mTOR-signalveien ukjent.

Denne studien hadde som mål å forstå de beskyttende effektene av ACT i en GIOP-rottemodell og osteoblaster in vitro og å belyse de underliggende molekylære mekanismene.

Materialer og metoder
Forsøksdyr
Førti 8-uker gamle Sprague-Dawley (SD) hannrotter som veide 280–340 g ble hentet fra Shanghai Laboratory Animal Center (CAS, Shanghai, Kina). Pleieprosedyrene til forsøksdyrene ble utført etter protokollen godkjent av The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University Animal Ethics Committee. Og studien ble utført i samsvar med retningslinjene for ARRIVE. Dyrene ble holdt i dyresentre fri for patogener, 24 ± 2 grader, 12 timers lys og mørke sykluser, 50 ± 5 prosent fuktighet, og med fri tilgang til mat og vann.

GIOP modellkonstruksjon
Etter 7 dager med adaptiv fôring ble rottene tilfeldig delt inn i kontroll- og modellgrupper ved bruk av tilfeldig talltabellmetoden, Dexamethason (Dex, Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA) 5 mg/kg to ganger i uken i 6 uker ble injisert intramuskulært for å indusere OP hos rotter i modellgruppen [25]. Rotter i kontrollgruppen (n = 10) ble injisert med en lik mengde saltvann. Ingen signifikante endringer i kroppsvekt ble observert hos rottene i begge grupper etter 6 uker. Deretter ble rottene i modellgruppen delt inn i modellgruppen, ACT lavdosegruppen (Model pluss ACT-L) og ACT høydosegruppen (Model pluss ACT-H). ACT (HPLC 98 prosent) ble oppnådd fra Baoji Herbest Bio-tech., Ltd. (Baoji, Kina), og behandlet med en vandig løsningsmiddelsuspensjon. En dose på 50 mg/kg/d og 100 mg/kg/d ACT ble administrert oralt til rotter i henholdsvis lav- og høydosegruppene (8 rotter per gruppe), og ble fortsatt i 8 uker. Blant dem ble utvalgsstørrelsen beregnet basert på en tidligere studie [26]. Tatt i betraktning et tosidig signifikansnivå på 0,05 [95 prosent konfidensintervall ( = 0.05)], 80 prosent kraft og en effektstørrelse på 0,5, estimerte kraftanalyse en nødvendig prøvestørrelse på 6 dyr per gruppe forutsatt at en relevant effektnivå på 30 prosent osteoporose. Videre, med en frafallsrate på 20 prosent, ble 8 dyr per gruppe (totalt 32 rotter) ansett som ideelle.

Rotteserumprøver
Etter 8 uker ble rottene bedøvet med 10 prosent kloralhydrat (400 mg/kg, intraperitonealt, Solarbio, Beijing Kina), blod ble samlet fra abdominalaorta, koagulert ved romtemperatur og sentrifugert ved 3500 rpm/min i 10 minutter. Serumet ble lagret i 1,5 ml sentrifugerør inntil videre bruk.

Benmineraltetthetsvurdering
Benmineraltetthet (BMD) ble brukt av et DAX beintetthetsmeter for små dyr (Ranzhe Instrument Equipment Co., Shanghai, Kina). Kort fortalt ble rottene plassert i liggende stilling og baklemmene ble plassert utover. Høyre lårben på rottene ble skannet i henhold til produsentens instruksjoner, og BMD-verdiene ble registrert [27].

Benmorfologisk analyse
På slutten av eksperimentet ble rottene avlivet ved intraperitoneal injeksjon av overflødig klorhydrat, og lårbenene ble fiksert i 70 prosent etanol. Deretter ble skanninger utført på et VivaCT 40μCT-system som beskrevet i tidligere studie og benvolum/totalvolum (BV/TV), beintrabekulært antall (Tb.N), bentrabekulær tykkelse (Tb.Tn) og bentrabekulær separasjon (Tb.Sp) ble vurdert [28]. For eutanasi ble SD-rotter bedøvet etter benmorfologianalysen ved en intraperitoneal injeksjon av 10 prosent kloralhydrat (350 mg/kg).

Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA)
Kommersielle ELISA-sett ble brukt for påvisning av nivåer av osteokalsin (OC, E-EL-R0243c, Elabscience) og C-terminalt telopeptid (CTX, E-EL-R1405c, Elabscience) i serumet til rotter. Kort fortalt ble reagensene fjernet ved 18-25 grad for å ekvilibrere og klargjøre løsningen for vasking og standardarbeid. Enzymplater Platene ble satt opp med standard-, blank- og prøvebrønner. Omtrent 100 μL prøvefortynningsløsning ble tilsatt til brønnene, inkubert i 90 minutter ved 37 grader og erstattet med et biotinylert antistoff i 60 minutter ved 37 grader. Etter vasking ble den enzymbindende arbeidsløsningen tilsatt og inkubert i 30 minutter. Substratløsningen (90 μL) ble tilsatt og inkubert i 15 minutter med beskyttelse mot lys. Når den blå gradienten dukket opp i standardbrønnene, ble 50 μL av termineringsløsningen tilsatt og endringen i OD450 ble analysert.

Omvendt transkripsjon-kvantitativ sanntids-PCR (RT-qPCR)
TRlzol LS-reagens ble tilsatt til serumet til rotter og ACT-behandlede MC3T3-E1-celler, og totalt RNA ble ekstrahert ved inkubering ved romtemperatur etterfulgt av tilsetning av kloroform. RNA-konsentrasjon og renhet ble bekreftet ved å måle A260/280-absorbans i et Nanodrop ND-1000-spektrofotometer. SuperScript II Revers Transcriptase-settet ble brukt for revers transkripsjon av RNA til cDNA. Deretter ble cDNA påført som en mal, en primer ble tilsatt, og SYBR-Green PCR-mastermikssettet ble blandet og supplert med ddH2O til 20 μL, og PCR-amplifikasjonsreaksjonen ble utført ved bruk av Applied biosystems AMI7500 Fast Real-time PCR system (ABI, CA, USA). GAPDH ble brukt som en intern referanse for normalisering, og de relative ekspresjonsnivåene ble beregnet ved bruk av 2−ΔΔCt-metoden og utført i triplikater. Primersekvensen for Runt-relatert transkripsjonsfaktor 2 (Runx2), kollagen type I 1 (CoL1A1), reseptoraktivator for nukleær faktor-KB-ligand (RANKL), osterix og osteoprotegerin (OPG) er presentert i tabell 1.

Western-blot-analyse
RIPA-lysat inneholdende 1 prosent proteasehemmer ble tilsatt til cellene, og totalt protein fra hver gruppe ble samlet etter lysering av cellene ved å riste i 5 minutter ved 4 grader. BCA-analysesett ble brukt for å kvantifisere konsentrasjonen av proteiner i hver gruppe. Etter dette ble proteinprøvene blandet med 10 prosent natriumdodecylsulfat (SDS) buffer i likt volum og kokt i vannbad ved 95 grader i 5 minutter for proteindenaturering. En 12 prosent SDS-polyakrylamid vertikal gel ble fremstilt, og etter at gelen størknet, ble det tatt prøver av 30 ug protein for 120 mA 90 min gelelektroforese-separasjon. Proteinet ble deretter overført til PVDF-membranen ved 90 V i 120 minutter. Etter forsegling med 5 prosent bovint serumalbumin ble PVDF-membranen kuttet basert på molekylvekten til markøren og målproteinbåndet og inkubert med det tilsvarende primære antistoffet over natten ved 4 grader. Kanin polyklonale antistoffer mot p-AKT, p-mTOR og p-PI3K ble fortynnet til forholdet 1:1000 (Proteintech, Wuhan, Kina). TBST ble vasket i 30 minutter og inkubert med det tilsvarende pepperrotperoksidase-merket sekundært antistoff ved romtemperatur i 1 time. Blotten ble visualisert ved bruk av forbedrede kjemiluminescensreagenser. Tettheten av proteinbånd ble kvantifisert ved bruk av bilde J. GAPDH ble brukt som en kontroll for å beregne relative proteinnivåer.

Cellekultur og gruppering
Muse-pre-osteoblaster MC3T3-E1 ble kjøpt fra Chinese Tissue Culture Collections (CTCC, Kina) og dyrket i -MEM som inneholder 10 prosent føtalt bovint serum og 100 U/ml penicillin og 100 mg/ml streptomycin i en fuktet inkubator ved 37 grader og 5 prosent CO2. For beindifferensieringskultur ble osteogent induksjonsmedium laget ved å blande 10 mM- -glyserofosfat og 50 mg/ml askorbinsyre (Sigma-Aldrich) med -MEM og tilsatt til MC3T3-E1-cellene for å indusere deres differensiering. Mediet ble skiftet etter 3 dager. Kulturer i 14 dager ble brukt for alkalisk fosfatase (ALP) levedyktighet. Videre ble cellene forbehandlet med PI3K-hemmeren LY294002 (10 μM) i 30 minutter, etterfulgt av behandling med Dex og ACT.

Cellelevedyktighetsanalyse
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-analysen ble utført for å vurdere levedyktigheten til osteoblaster behandlet med ACT. MC3T3-E1-cellene ble inokulert i 96-brønners plater med 5 × 103 celler/brønn. En mengde på 1 μM Dex ble vurdert basert på tidligere studier [29] og co-inkubert med gradientkonsentrasjoner av ACT (10-8, 10-7, 10-6 og 10-5 M). Kulturmediet i 96-brønnplatene ble erstattet etter tilsetning av et blandemedium og CCK-8-reagens i forholdet 10:1. Etter fortsatt inkubering i 1 time ved 37 grader ble endringen i OD450 vurdert.

Deteksjon av osteoblastapoptosenummer
MC3T3-E1-cellene som ble utsatt for forskjellige behandlinger ble fordøyd ved bruk av EDTA-fritt trypsin og samlet ved sentrifugering. Etter vask med en 1 × bindingsbuffer, ble 5 μL Annexin V-FITC tilsatt og inkubert ved romtemperatur i 5 minutter, supplert med 5 μL PI og ført gjennom et 200-mesh nylonnett. Prøvene ble analysert ved bruk av FACScan flowcytometrisystem.

ALP-aktivitetsanalyse
MC3T3-E1-cellene ble inokulert i 24-brønnplater, og ACT og Dex ble tilsatt etter plastering. Cellekulturmediet ble erstattet med et osteogent differensieringsmedium for dyrking. Etter bruk av lysis av celler ved cellelyseløsning (P0012J, Beyotime Biotechnology), ble supernatanten samlet ved sentrifugering, og standardkurven ble plottet. Et ALP-sett (P0132S, Beyotime Biotechnology) ble brukt for å evaluere ALP-aktivitet og OD450 ble beregnet.

Statistisk analyse
Etter å ha utført tre uavhengige eksperimenter i tre eksemplarer, ble dataene analysert ved hjelp av GraphPad Prism 6.0 programvare og uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. ANOVA ble brukt for å sammenligne statistiske forskjeller mellom flere grupper. P-verdi < 0.05 ble ansett som statistisk forskjellig.