Et Oenothera Biennis-cellekulturekstrakt utstyrt med antialdringsaktivitet for huden forbedrer cellemekaniske egenskaper
Jul 06, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon
Abstrakt:Hudaldring er en meget velkjent prosess som setter en gradvis forverring av hudens mekaniske egenskaper på grunn av en nedgang i produksjonen av det ekstracellulære matrisemaskineriet og en samtidig endring i sammentrekningsprosessen. For å bremse denne progresjonen er det avgjørende å indusere ekspresjonen av flere proteiner som er i stand til å fremme dannelse av elastiske fibre og reparasjon av vev. Her er det vandige cellekulturekstraktet Oenothera bi-Ennis undersøkt fra et kjemisk synspunkt, og deretter ble det testet in vitro, i cellen og in vivo-eksperimenter som et hjelpestoff for å motvirke aldring av huden. vist at Oenothera biennis-ekstraktet var i stand til, ved å øke MYLK-genekspresjonen, å fremme matrisekollagensammentrekning, aktinpolymerisering og produksjon av essensielle ECM-proteiner.
Nøkkelord:metabolomics; molekylære nettverk; hydrofilt ekstrakt av Oenothera biennis cellekulturer; matrix kollagen sammentrekning; aldring av huden
1. Introduksjon
Hudaldring er en meget velkjent prosess indusert av endogene og eksogene faktorer. Under senescens degenererer alle kutane fysiologiske funksjoner ubønnhørlig, og denne progressive forverringen skader huden [1]. Faktisk mister huden gradvis sine mekaniske egenskaper, både på grunn av en nedgang i produksjonen av de ekstracellulære matriseproteinene og den samtidige endringen i sammentrekningsprosessen [2]. De viktigste ekstracellulære matrikskomponentene i dermis er proteiner som kollagen I og IIl, laminin, periostin, tenascin, elastin, fibronektin og proteoglykaner, da deres relative mengde og foldetilstand spiller en nøkkelrolle i interaksjonen mellom cellene og matrise, som garanterer riktig tekstur av dermis [3]. For eksempel, i det ekstracellulære rommet, spiller fibronektin en nøkkelrolle i matrisemontering da det danner en bro mellom celleoverflatereseptorer (f.eks. integriner) og kollagen, proteoglykaner og andre fokale adhesjonsmolekyler. Lamininer bidrar til strukturen til den ekstracellulære matrisen og modulerer adhesjon, differensiering, migrasjon, stabilitet av fenotypen og motstand mot apoptose. Elastin er også viktig for celleadhesjon og cellemigrasjon, og det har evnen til å delta i cellesignalering. Fibrilliner samhandler på samme måte tett med tropoelastin og integriner, og de er viktige for sammensetningen av elastiner til elastiske fibre. Fabulous er tett forbundet med kjellermembraner, elastiske fibre og andre komponenter i den ekstracellulære matrisen, og deltar i dannelsen av elastiske fibre. Tenasciner er ekstracellulære matrise(ECM)polymorfe glykoproteiner som medierer fibrotiske prosesser for å muliggjøre effektiv vevsreparasjon. [4]I tillegg er hudens kontraktile prosess også basert på virkningen av fibroblaster, de mest tallrike cellene i hudmatrisen; de setter opp riktig spenning i huden, fremmer kontaktene mellom matrisekomponentene, som igjen er ansvarlige for dermis kompakthet, tetthet og motstand. På grunnlag av deres cellulære cytoskjelettorganisasjon er det aktin-myosin-maskineriet, som bestemmer potensielle endringer i deres form og struktur. Faktisk induserer bindingen av aktin og myosin en mer kompakt cellulær konformasjon, som bringer fibrene nærmere hverandre, garanterer utviklingen av sunt og kompakt vev, og forhindrer fiberoppløsning som resulterer i rynker. Imidlertid er fibroblastens evne til å trekke seg sammen og strekke seg delvis tapt over år fordi de gamle cellene ikke lenger er i stand til å fungere korrekt og fullstendig. På grunn av en lavere mekanisk kraft går fibroblaster til en mer avrundet og forvrengt morfologi enn den langstrakte [5]. Noen bevis har indikert at syntesen av et protein kalt MYLK (Myosin Light Chain Kinase) ble betydelig redusert under aldring. MYLK har en kinaseaktivitet som utøves av fosforylering av et spesifikt myosindomene, kalt myosinregulerende lettkjede, i stand til å indusere aktinbinding og derfor fremme cellekontraktilitet [6].bioflavonoiderNår en lav aktivitet av dette proteinet ble påvist, for eksempel på grunn av et mindre proteinuttrykk, ble en tilsvarende reduksjon av matrisekollagensammentrekning [7] og aktinpolymerisasjon [8] målt. Aktin-cytoskjelettsammenstilling er ikke bare knyttet til cellebevegelsen og evnen til å trekke seg sammen, men også til produksjonen av ECM-matriseprotein gjennom aktivering av TGF-II-reseptoren (TGFBRII)[9]. TGFBRII tilhører TGF-celleoverflatereseptorkomplekset som, gjennom aktivering av Smad-transkripsjonsfaktorer, regulerer uttrykket av mange gener som koder for komponenter i ECM, inkludert kollagen, lamininer, fibronektin og proteoglykan [10]. Demontering av aktincytoskjelett nedregulerer TGF-Il-reseptoren. Denne nedreguleringen reduserer i sin tur produksjonen av kollagen og andre ECM-proteiner, noe som resulterer i tap av dermal masse og hudskjørhet.
Faktisk har mange kosmetiske ingredienser som mål å stimulere syntesen av flere nøkkelfaktorer som er ansvarlige for å opprettholde den korrekte kompaktheten av dermal matrisen og en god hudsammentrekning. I dette scenariet er ekstraktene avledet fra arten Oenothera biennis (nattlyr), som tilhører familien Onagraceae, av stor interesse på grunn av innholdet av bioaktive forbindelser som fettsyrer, fenoler, triterpener og flavonoider, som allerede har blitt testet i behandling av ulike hudpatologiske sykdommer [11]. Noen av disse metabolittene er i sin tur rapportert å undertrykke betennelsesmediatorer som interleukin 1 (IL-1), interleukin 6 (IL-6), cytokiner og tumornekrosefaktor (TNF-)[12 ]. Dessuten beskyttet ekstrakter av Oenothera biennis luftdeler HaCaT-celler fra H, O,-indusert DNA-skade og celledød ved å blokkere cellulær skade på grunn av oksidativt stress gjennom en mekanisme som involverte ROS-eliminering og Nrf2/HO-1-signalvei [ 1. 3]. Videre har Oenothera biennis olje, som er rik på lipider, blitt foreslått som en god fuktighetskrem for eksempasienter takket være dens evne til å enkelt trenge gjennom huden [14]. Dessverre kan ekstraktpreparater av dyrkede planter, engasjert i kosmetikk, inneholde noen ulemper: for det første kan de være forurenset av giftige eller allergifremkallende stoffer som plantevernmidler, gjødsel eller forurensninger; da er plantene utsatt for uforutsigbar stress og sesongmessige forhold eller variasjoner i næringstilgjengelighet, noe som kan indusere syntesen av uventede metabolitter. I tillegg kan ekstraktene inneholde patogene mikroorganismer, som reduserer kvaliteten på sluttproduktene. Alle disse ulempene konvergerer i sin tur til risikoen for å ha et variabelt innhold av sekundære metabolitter og lav reproduserbarhet. For å overvinne disse svakhetene, blir bruken av plantecellekulturer i kosmetikk mer populær og veldig mye verdsatt, siden den overvinner mange av de ovennevnte ulempene [15].
I denne studien har et hydrofilt ekstrakt av Oenothera biennis cellekulturer (ObHEx) blitt fullstendig preget av avanserte massespektrometriske-baserte tilnærminger, assistert av bioinformatikk, og testet i flere biokjemiske og biologiske analyser. Blandingen inneholder bioaktive forbindelser av hovedsakelig lignaner og triterpener, som arjunolsyre og asiatisk syre, som tidligere har vært assosiert med pro-kollagen I-produksjon i humane fibroblaster [16,17]. Ekstraktet ble undersøkt for sin evne til å øke uttrykket av MYLK, fremme matrix kollagensammentrekning, aktinpolymerisering og produksjon av TGF-regulerte ECM-proteiner, som favoriserer sammentrekningen av dermis, og dermed bremser hudens aldring.
2. Resultater
2.1.Kvalitativ og kvantitativ analyse av det vannløselige ekstraktet av Oenothera Biennis cellekultur
UPLC-MS/MS-analyse av ObHEx ble utført og høyoppløselige spektrometriske data ble utnyttet for den kjemiske karakteriseringen ved bruk av Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS), et nettbasert massespektrometrisystem som hjelper til med identifisering og merking av naturlige produkter (NPS)[18]. Den tar sikte på å være en åpen tilgangskunnskapsbase for fellesskapsomfattende organisasjoner og for deling av rå, bearbeidede eller kommenterte fragmenteringsmassespektrometridata (MS/MS). Spesielt ble GNPS-spektralbiblioteksøk og en funksjonsbasert molekylært nettverk (FBMN)-jobb utført: den første analysen tillot oss å identifisere naturlige forbindelser, sammenligne MS/MS-spektrene deres med de til strukturelt karakteriserte metabolitter, den andre til grupperelaterte NP-er i et nettverk siden lignende MS/MS-fragmenteringsmønstre ble vist av strukturelt like molekyler [19]. Som vist i figur 1 og tabell 1, ble mange NPS utvilsomt identifisert som tilhørende flere klasser av sekundære metabolitter, hovedsakelig lignaner (Salvador til side og liriodendron) og triterpener (muriatinsyre, ariunolsyre, asiatisk syre og hederagenin). Kjemiske arter som ikke ble identifisert av GNPS ble tildelt i henhold til litteraturen.
Som et eksempel på bruken av GNPS er nettverket avledet fra FBMN-analyse blitt rapportert i figur 2a, som viser at ObHEx inneholdt mange andre ukarakteriserte triterpener relatert til muriatinsyre (18, m/z 503.3389, RT 21.89 min: muriatinsyreidentifikasjon har blitt bekreftet gjennom en sammenligning med dens analytiske standard). For eksempel ble forskjellige tidligere ukarakteriserte arter ved m/z 701 og 665 identifisert som glykosylerte former relatert til muriatinsyre eller dens isomerer, henholdsvis hydrert eller ikke med to molekyler H2O
Videre rapporterte ioner ved m/z 729, 703, 699,687,685, 683 henholdsvis avledet fra glykosylering pluss to molekyler H, O av arter ved m/z531, 505,501, 489,487 og 485: deres entydige identifisering har vært univokalisk. de er alle ment å være triterpener, som er relatert til muriatinsyre eller dens congenere, på grunn av deres MSMS-fragmenteringsvei. Nylig ble mange triterpener med m/ 501 og 485 isolert fra en annen art av Oenothera, Oenothera Maritima, og deres struktur har blitt belyst på grunnlag av spektroskopiske data, og dermed godt korrelert med våre resultater [20].
Cistanche kan anti-aldring
FBMN-analyse ga også informasjon om metabolittene ved m/z 617.3862 (MS2-ioner ved m/z 453,145 og 119) tilstede i molekylære nettverk vist i figur 2b og ikke rapportert i litteraturen for Oenothera-arter. Denne m/z-verdien og dens fragmentering samsvarer med 2-OEp-coumaroyl apostolic acid eller dens isomerer, og beviser i det minste tilstedeværelsen av triterpen coumaroyl og også caffeoyl estere i ekstraktet. Faktisk viste MS-spektra av arter ved m/z 649 (RT 25.72 og 27.19) tilstedeværelsen av ioner ved m/z 179, 161 og 135 på grunn av spaltningen av koffeinsyredelen, mens MS2-spektrene til de andre artene rapportert i figur 2b ved m/z 633(RT 26.88,27.20,28.12 og 28.43),649 (RT24.18,24.65,24.83) og 661 (RT 30.28) viste ioner ved m/z 145 og 119, for kumaroyldel.
After, the content of some identified lignans and triterpenes was determined. Ouantifi-cation methods were validated as reported in Table2. All calibration curves showed good linearity (R>0.9911) innenfor de testede områdene. Dessuten indikerte deteksjonsgrensen (LOD) og kvantifiseringsgrensen (LOO) at de brukte metodene var preget av høy sensitivitet. De oppnådde resultatene fra den kvantitative analysen (tabell 3) viste at liriodendron og hederagenin var de viktigste representerte henholdsvis lignan og triterpen.
2.3.Analyse av MYLK-genekspresjon i HDF
Aktiviteten til ObHEx ble testet i HDF på uttrykket av MYLK-genet, som koder for kinasen som er ansvarlig for lettkjedefosforyleringen av myosin (figur 3a). Resultatene indikerte at behandlingen med ekstraktet ved begge konsentrasjonene økte MYLK-genekspresjonen med omtrent 50 prosent, tilsvarende den positive kontrollen TGF-.
2.4. Analyse av sammentrekningskapasiteten til en kollagenmatrise
For å evaluere aktiviteten til ObHEx på den kontraktile kapasiteten til kollagenfibre, brukte vi HDF dispergert i kollagengelskiver [21]. Som vist i figur 3b induserte ekstraktet, ved den lavere konsentrasjonen, en betydelig økning i sammentrekningen av kollagenskiven, noe som tyder på en potensiell effekt på kollagenfastheten. Behandlingen med ML7(1-(5-jodonaftalen-1-sulfonyl)-1H-heksahydro-1,4-diazepin), en MYLK-hemmer, avskaffet denne økningen, noe som indikerer at både ekstraktet og TGF- virker gjennom MYLK for kollagendiskkontraksjon.
2.5. Måling av aktinpolymerisasjonsnivå
Kapasiteten til ObHEx til å stimulere aktinpolymerisering ble undersøkt ved å måle nivået av polymerisert aktin i cellene, behandlet med ekstraktet og den positive kontrollen TGF-, alene og i nærvær av ML7. Som vist i figur 3c ga behandlingen med begge konsentrasjonene av ekstraktene en økning i mengden polymeraktin med omtrent 50 prosent, sammenlignet med 33 prosent av TGF-.kjøpe cistancheIgjen opphevet pre-inkubasjonen med ML7com denne effekten fullstendig, noe som tyder på involvering av MYLK i polymeriseringen av aktinfilamenter.
2.6. Analyse av TGF RII/SMAD Pathway i HDF
For å verifisere om økningen i aktinpolymerisering og kollagenkontraksjon av celler behandlet med ObHEx også var assosiert med aktivering av signaltransduksjonsveien mediert av TGF RII, observerte vi først ekspresjonen av TGF RII-genet og transfekterte deretter HDF med SMAD {{ 0}}luciferasereporterplasmid og evaluerte økningen i luciferaseaktivitet som respons på ObHEx-behandling. Resultatene, rapportert i figur 3d,e, indikerte at behandlingen med ObHEx ved 0,002 prosent og 0,006 prosent økte ekspresjonen av TGF RII på en måte som ligner på TGF- brukt som positiv kontroll, og parallelt, luciferaseaktiviteten knyttet til SMAD ble økt med henholdsvis 80 og 40 prosent. En betydelig signalreduksjon ble oppnådd når cellene ble behandlet med ML7, noe som også viser at denne aktiviteten var knyttet til MYLK.
2.7. Analyse av Pro-Collagen I, Tropoelastin og Periostin
Som en konsekvens av TGF RII-signaltransduksjonsaktivering, analyserte vi syntesen av de viktigste ekstracellulære matriseproteinene som prokollagen type I, tropoelastin og periostin i HDF behandlet med ObHEx ved 0.002 prosent. Som vist i figur 3f, økte ObHEx produksjonen av de angitte proteinene med henholdsvis omtrent 98 prosent, 75 prosent og 51 prosent, tilsvarende den positive kontrollen TGF-. Målingene ble utført ved hjelp av ELISA-analyse, ved bruk av spesifikke antistoffer mot pro-kollagen I, tropoelastin og periostin.
2.8. Analyse av MYLK, Fosfo-Myosin, Kollagen I og Tropoelastin på Ex-Vivo hudeksplantater
Som vist i figur 4a-c produserte ObHEx en betydelig økning i produksjonen av MYLK og fosforylert myosin i humane hudeksplantater.
Kollagen I og tropoelastin-induksjon ble også analysert i hudeksplantater forbehandlet med ObHEx og deretter behandlet med hydrokortison i 8 dager for å simulere kronologisk aldring [22]. Behandlingen med hydrokortison reduserte mengden av kollagen I og tropoelastin med mer enn 100 prosent, og tilstedeværelsen av 0,002 prosent ObHEx gjenopprettet mengden tropoelastin med nesten 91 prosent og kollagen med 120 prosent, sammenlignet med askorbat brukt som en positiv kontroll (figur 4d-f). Dette antyder en potensiell anti-aldringseffekt av ObHEx, spesielt effektiv for å øke fastheten i huden ved å virke på de dermale matrikskomponentene.
2.9.Atomic Force Microscopy (AFM) i hudeksplantater
For å samle inn mer informasjon om hudens biomekaniske egenskaper fremmet av behandlingen med ObHEx, evaluerte vi elastisitet, en iboende mekanisk egenskap til hudprøver når det gjelder deres Youngs moduli [23]. Som beskrevet i avsnitt 4, for å beregne elastisitetsmodulen, både på behandlede og ubehandlede hudprøver, samlet vi kraftkurver med et Atomic Force Microscope (AFM) og tilpasset dem med Hertz-modellen [24,25]. Som vist i figur 5, hadde behandlingen av hudprøvene med ekstraktet lavere Youngs modulverdier sammenlignet med ubehandlede prøver, noe som tyder på en forbedring av hudens elastiske egenskaper. Spesielt viste ubehandlede hudprøver en gjennomsnittlig Youngs modulverdi på 0.37±0.15 GPa, mens hudprøver behandlet med ObHEx viste en lavere gjennomsnittsverdi på 0.{{11 }}7±0,02 GPA. Youngs modulverdier for hudprøvene var i samsvar med litteraturen [26-28].
3. Diskusjon
Plantecellekulturer utgjør den mest lovende tilnærmingen for bærekraftig produksjon av plantesekundære metabolitter av kommersiell interesse, og tilbyr en kontinuerlig tilførsel av materiale ved hjelp av storskala kultur og utgjør et bærekraftig og miljøvennlig system [29,30]. Ekstrakter fra plantecellekulturer har funnet lovende anvendelser i helsevesenet og kosmetikksektoren, ettersom de gir noen relevante fordeler;(i)de inneholder metabolitter biosyntetisert under kontrollerte vekstlaboratorieforhold;(i) de stammer fra standardiserte produksjonsprosesser, som garanterer samme kvalitative og kvantitative egenskaper for den oppnådde arten;(ii) ekstraktene er fri for forurensninger som mikroorganismer, ugressmidler, plantevernmidler og soppdrepende midler;(iv) de er uavhengige av geografiske eller miljømessige svingninger og plantearten kan bevares for fremtidig generasjoner. I denne konkurransen ble et Oenothera biennis cellekultur vannholdig ekstrakt (ObHEx) undersøkt som en lovende kilde til bioaktive molekyler utstyrt med antialdringsaktivitet. Faktisk har ObHEx blitt undersøkt av høyoppløselige UPLC-MSMS-analyser kombinert med bioinformatikktilnærminger for å oppnå en bred strukturell karakterisering. Sammensatt karakterisering har blitt realisert hovedsakelig ved å bruke GNPS for å fremskynde identifiseringsprosessen, sammenligne MS/MS-spektrene med de til strukturelt karakteriserte metabolitter, og videre avsløre nye uventede arter, gruppering lignende NP-er i et nettverk. Dessuten ble retensjonstid, nøyaktige massemålinger og MS2-analyser også sammenlignet med standarder, og alle data ble matchet med litteraturen. Bioaktive lignaner og triterpener, som Salvador til side, liriodendron, my-anthemic acid, arjunolsyre, asiatisk syre og hederagenin ble identifisert. Liriodendron [31] og muriatinsyre [32] viste sterk antioksidantaktivitet, mens hederagenin viste hudantialdringsegenskaper på grunn av en reduksjon av cellulær oksidasjon og aktivering av proteasomfunksjon [33]. Imidlertid ble arjunolsyrer og asiatiske syrer ansett som hovedansvarlige for noen av de følgende testede aktivitetene, siden de stimulerer kollagen I-syntese. Faktisk har det blitt demonstrert at ObHEx forbedret hudens biomekaniske egenskaper, som for det meste avhenger av den relative mengden av de forskjellige komponentene i ECM og på hvordan fibroblastene er i stand til å trekke seg sammen og gi riktig spenning til de dermale fibrene.cistanchFaktisk fremmer ObHEx kollagenmatrisekontraksjon og aktinpolymerisering ved å øke uttrykket av MYLK-genet, og øker sammentrekningskraften til dermale fibroblaster. Montering av aktincytoskjelett oppregulerer TGF-type II-reseptor og, i samsvar med stimulering av TGF-/Smad-signalering, øker nivåene av TGF-regulerte ECM-proteiner. Faktisk induserer ObHEx produksjonen av type I kollagen, periostin og tropoelastin. Derfor gjør alle disse egenskapene det til en god, lovende kandidatingrediens som kan brukes i kosmetiske formuleringer for å bekjempe det aldersassosierte tapet av hudens fasthet og elastisitet. Denne antakelsen ble støttet av resultatene oppnådd i AFM-analysen, som viste at behandlingen av hudskiver med ObHEx ga en forbedring av hudens mekaniske egenskaper, oppdaget som en reduksjon i Youngs modul, noe som indikerer en betydelig reduksjon i hudens stivhet og stivhet.
4. Materialer og metoder
4.1. Plantevevskulturer og ekstraktpreparering
Oenothera biennis-planter ble levert av GEEL Floricultura ss og var av italiensk opprinnelse (unngået bruk av Nagoya-protokollen). Cellekulturer ble oppnådd fra blader av Oenothera biennis-planter ved å indusere spredning av meristematiske celler på solide agarplater inntil man oppnår hard hud. Cellene ble overført til det flytende vekstmediet (Gamborg B5, supplert med 24 diklorfenoksyeddiksyre (1 mg/L), adenin (1 mg/L) og kinetin (0.01 mg/L)). Deretter , ble cellene dyrket som suspensjonskulturer under orbital risting. Så snart kulturene på ca. 150 g/l var oppnådd, ble cellene samlet og lysert i en fosfatbuffer (PBS) ved pH 7,4 for å fremstille et vannløselig ekstrakt, som ble lyofilisert. Pulveret ble oppløst i vann eller cellekulturmedier i passende konsentrasjoner for testing.
4.2. UPLC-MSMS-analyse for kjemisk karakterisering
ObHEx(5{{10}} mg/mL) ble tilberedt og underkastet en bifasisk butanol/vann-ekstraksjon. Butanolfraksjonen ble tørket og oppløst i metanol (10mg/ml) før UPLC-MS/MS-analysen. Det ble utført på et Q-Exactive Classic Mass Spectrometer fra Thermo-Scientific (Waltham, MA, USA) utstyrt med et Thermo ScientificTM UltiMateTM 3000 UPLC-system. Alle de kromatografiske kjøringene ble utført ved bruk av en Phenomenex Luna③C18 100 A (150×2,0 mm, partikkelstørrelse 3 μm) kolonne ved 40 grader C og en strømningshastighet på 0,200 ml/min. Injeksjonsvolumet var 5 μL. Den mobile fasen besto av A (vann fra ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, Storbritannia med 0,1 prosent eddiksyre) og B (100 prosent acetonitril fra ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, UK) ved bruk av en gradienteluering av5 prosent B ved 0-5min.,5-14 prosent B ved5-8 min.,14-32 prosent B ved 8-11 min., 32-95 prosent Bat {{ 26}}min,95-98 prosent Bat32-33 min,98 prosent B ved 33-38min,98-5 prosent Bat38-39 min, og 5 prosent B ved { {34}} min. Alle MS- og MSMS-analysene ble utført i ESI negativ modus med kappegassstrømningshastigheten på 30 (vilkårlige enheter), hjelpegassstrømningshastigheten på 5 (vilkårlige enheter), sprayspenningen på 3,2 kV, og kapillærtemperaturen og den ekstra gassvarmertemperaturen på 300 grader. Data ble innhentet med en Full MS/dd-MS2 (Top5)-modus. Full MS-innstillinger var: oppløsningen på 70.000, AGC-målet på 1×106, maksimal IT på 200ms, og kan variere fra 100 til 800 m/z.dd-MS2-innstillinger var: oppløsning på 17.500, AGC-mål på 2×105, maksimum IT på 65 ms, isolasjonsvindu på 1,5 m/z og NCE på 35.
innhentede ble manuelt verifisert. mzXML-data ble behandlet med Mzmine 2.53 før funksjonsbasert molekylært nettverk (FBMN)-jobben på GNPS. Massedeteksjonstrinnet ble utført ved bruk av tyngdepunktmassedetektoren mens støynivået ble holdt på 5 × 1{{10}}3. Automated Data Analysis Pipeline (ADAP) kromatogrambygningen ble realisert med følgende innstillinger: min gruppestørrelse i et antall skanninger på 5, gruppeintensitetsterskel på 5 × 1{{20}}³, min høyeste intensitet på 5× 10 pluss ,m/z toleranse på 0.01 m/z eller 10 ppm. Kromatogramdekonvolusjonen ble oppnådd ved bruk av Wavelets(ADAP) som en algoritme, S/N-terskel på 3, min funksjonshøyde på 1 × 105, koeffisient/arealterskel på 5, toppvarighetsområde på 0.{{ 18}}.00 min, og RT wavelet-område på 0.00-0.05. Kromatogrammer ble deisotopert ved bruk av isotop topper grouper-algoritmen med en m/z-toleranse på 0,001 m/z eller 5,0 ppm og en RT-toleranse på 0,10 min. FBMN-jobben ble utført ved bruk av foreldremassetoleranse på 0,02 Da og en MS4-fragmentiontoleranse på 0,02 Da. Kanter ble filtrert for å ha en poenggrense på 0,7 og minimum 2 matchede topper. Dessuten ble det maksimale antallet nabonoder for hver node satt til 10.
4.4. Kvantitativ analyse av lignaner og triterpener
De samme UPLC-forholdene rapportert for den kvalitative analysen ble brukt for den kvantitative analysen av lignaner, mens de for triterpener ble optimalisert for å skille to par isomerer, arjunolsyre og asiatisk syre. Analysen ble utført på et Q-Exactive Classic Mass Spectrometer som tidligere beskrevet. Separasjonen ble utført av en Phenomenex Kinetex⑧EVO C18 300 A（150×2,1 mm, partikkelstørrelse 5 μm）. Den mobile fasen besto av A(5 mM vandig ammoniumacetatløsning, pH 9.00 justert med ammoniumhydroksid) og B(100 prosent acetonitril) ved bruk av en gradienteluering på 17-28 prosent B ved 0-18 min, 28-65 prosent B ved 18-22 min, 65-75 prosent B ved 22-26min,75-95 prosent ved {{17 }}, 5min, 95 prosent ved 26,5-30 min, 95-17 prosent ved 30-30,1 min,17 prosent ved 30,1-42 min. Strømningshastigheten var 0,450 ml/min og injeksjonsvolumet var 5 uL. For både lignaner og triterpener ble data innhentet med en Full MS-SIM og PRM-modus. Fulle MS-SIM-innstillinger var: oppløsningen på 70.000, AGC-mål på 3×106, maksimal IT på 200 ms, og kan variere fra 200 til 800 m/z for lignaner og fra 400 til 850 m/z for triterpener. PRM-innstillinger var: oppløsningen på 70.000, AGC-mål på 2×10 grader, maksimal IT på 100 ms, isolasjonsvindu på 1,0 m/z og NCE på 35 for lignaner og 50 i det av triterpener.cistanche AustraliaVi kjøpte Salvador til side (#{{0}}XS172930) fra Biosynth Carbosynth (Staad, St. Gallen, Sveits), liriodendron (#SMB00181) og arjunolsyre (#SMB00119) fra Sigma -Aldrich(St. Louis, MO, USA), asiatisk syre (#0027) fra Extrasynthese (Genay, Lyon, Frankrike) og hederagenin(#89706) fra PhytoLab GmbH & Co.KG(Vestenbergsgreuth, Bayern-Mittelfranken, Tyskland). Myrianthic acid var en gave fra prof. Maria Valeria D'Auria, University of Napoli. Kalibreringskurvene ble oppnådd ved å injisere standardløsninger i konsentrasjonsområdet 0,25-25 μM for lignaner og 0,1-25 uM for triterpener. Både ren Salvador til side og liriodendron viste to LC-MSMS-topper, sannsynligvis på grunn av den kjemiske likevekten etablert i løsningen. Deteksjonsgrensen (LOD) og grensen for kvantifisering (LOO) for standarder ble bestemt på grunnlag av signal-til-støy (S/N)-forholdet.
4.5. Hudcellekulturer og eksplantater
Humane dermale fibroblaster (HDF) ble opprettholdt i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) supplert med 10 prosent av føtalt bovint serum (FBS; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) )i 95 prosent luft, 5 prosent CO, og fuktet atmosfære ved 37 grader. Hudeksplantater, hentet fra huden til friske kvinnelige donorer (i alderen 44-47) ved kirurgisenteret Villa Cinzia (Napoli, Italia), ble dyrket i 24-transwell-plater i DMEM/FBS pluss antibiotika i luft- væskeforhold ved 37 grader i5 prosent CO2 fuktet luft. Alle givere hadde gitt sitt skriftlige informerte samtykke til bruk av hudvevet, ifølge Helsinki-erklæringen.
4.6. Cytotoksisitetstest
Cytotoksisitetstester var basert på bruk av MTT-forbindelsen [{{0}}(45-dimetyltiazolyl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid][34]. Cellene ble dyrket i 96-brønnplater i DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) kulturmedium, supplert med 10 prosent føtalt bovint serum, i omtrent 8 timer. Etter behandling med ObHEx mellom 0.05 prosent og 0,0004 prosent (500 ug/mL og 4 ug/mL) i 48 timer, ble cellene vasket i PBS og inkubert med 100 μL/brønn av "reaksjonsbuffer" inneholdende ∶ 10 mM Hepes, 1,3 mM CaCl2, 1 mM MgSO, 5 mM glukose og 0,5 mg/mL MTT kolorimetrisk substrat i buffer PBS ved pH 7,4. Etter 3 timers inkubering ved 37 grader C i 5 prosent CO, ble 100 μLof oppløseliggjørende løsninger inneholdende 10 prosent Triton-X100, 0,1 N HCl i absolutt isopropanol tilsatt til hver brønn. Etter 16 timers inkubering ble den kolorimetriske reaksjonen målt ved 595 nm med Victor3 plateleser (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).
4.7. Analyse av uttrykket av MYLK- og TGF6RII-genet i HDF
Per brønn ble 1×10 grad av HDF dyrket i 6-brønnplater i DMEM ved 2 prosent FBS, etter 24 timer ble FBS ytterligere fortynnet til 0,5 prosent, og cellene ble behandlet med 0.002 prosent og 0.006 prosent konsentrasjoner av ObHExand TGF- 2.5ng/mL, etterfulgt av en inkubasjon på 2 timer for MYLK og 48 for TGFRII. For RNA-ekstraksjon ble "GenEluteM Total RNA Purification"-settet kjøpt av selskapet Merck (Darmstadt, Tyskland) brukt. Etter de angitte behandlingene ble cellene vasket med PBS, samlet i lyseringsbuffer og utsatt for ekstraksjonsprosedyren som rapportert. Prøvene ble behandlet med DNase I (Ambion, Austin, TX, USA) ved 37 grader i 30 minutter for å fjerne den genomiske DNA-kontaminanten. Fra hver prøve ble 2 μL lastet på gel 1 prosent agarose i nærvær av denaturerende ladefarge med det formål å kvantisere mengden RNA i referanse til en spesifikk markør for RNA (ThermoScientific, Waltham, MA, USA). GeneTools (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) har blitt brukt som programvare for kvantisering. Deretter ble 300 ng totalt RNA retro-transkribert ved bruk av enzymet revers transkriptase (ThermoScientific, Waltham, MA, USA). Semikvantitativ RT-PCR ble utført ved å bruke som interne standarder paret med universelle primere 18S primer/konkurrent (Ambion, Austin, TX, USA). PCR-produktene ble separert på 1,5 prosent agarosegel, sett ved bruk av Reliance-verktøyet (PerkinElmer, Waltham, MA, USA), og analysert ved densitometri ved bruk av Genetools-programvaren. Sekvensene til primerne som ble brukt for amplifikasjon var følgende: MYLK FW: ATCAAACTGTCAAGTTCAG, MYLK Rv: AGGCACTGCGTGCAGTCCA, TGFBR2 FW: GTCACTGACAACAACGGT, TGFBR2 RV: ATGTCAGAGCGGTCATCT.
4.8. Analyse av sammentrekningskapasiteten til en kollagenmatrise
Når det gjelder HDF-celler, ble 2.0× 10 grader resuspendert i 5x DMEM-vekstmedium (Gibco, Waltham, MA, USA) i en 24-brønnplate og en 2 mg/ ml oppløsning av kollagen fra bovin hud (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ble tilsatt til hver brønn. pH i løsningen ble justert til 7,2. Platen ble inkubert ved 37 grader C i 45 minutter for å tillate størkning av kollagengelen. DMEM supplert med 10 prosent FBS og/eller ML7 25 uM, som MYLKprotein-hemmer, ble lagt til senere. Etter 16 timer ble ML7 fjernet og ObHExat konsentrasjonen på 0,002 prosent i DMEM med 2 prosent FBS ble tilsatt. TGF- 2,5 ng/ml ble brukt som en positiv kontroll. Den dannede kollagenskiven ble umiddelbart løsnet fra brønnen ved å bruke en steril mikrospatel for å fremme sammentrekningen. Områdene på disken for hver behandling ble målt ved tiden 0 og 5 timer og analysert ved hjelp av Image-programvare.
4.9. Analyse av graden av aktinpolymerisering
Deretter ble 1,5×10 grad av HDF-celler per brønn dyrket i en 24-brønnplate og neste dag ble mediet tilsatt 2 prosent FBS og Cytochalasin B, som er en hemmer av aktin polymerisasjon, ved 2 μM i 3{{1{{20}}}} min. Etter 30 minutter, på cellene, ble ObHEx (0,002 prosent og 0,006 prosent) tilsatt sammen med TGF- 2.5 ng/mL, brukt som en positiv kontroll, og ML7 25μM, som en negativ kontroll av MYLKenzymet. Etter 30 minutters behandling ble cellene fiksert med 4 prosent paraformaldehyd (PFA) i bufferfosfat i 30 minutter på is. Cellene ble vasket med PBS og permeabilisert med en løsning av fosfatbuffer og Triton-X100 ved 0,2 prosent i 30 minutter. Deretter ble cellene inkubert med en løsning av 0,4 μM falloidin konjugert med rhodamin (Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) i 1 time i mørket.cistanche fordelerVed tidspunktet 0 og etter 18 timer ble fluorescensen målt ved 540/570 nm ved bruk av Victor3 plateleser (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). 4.10.Analyse av SMAD2 Pathway
HDF-celler ble sådd med en tetthet på 3×103 i 96-brønnplater og ble etter 16 timer transfektert med X-tremeGeneTM HP DNA-transfeksjonsreagens (Roche Diagnostics, Basel, Sveits) med Smad2-reportervektor i henhold til produsentens instruksjoner. Etter 24 timer ble cellene behandlet med ObHEx eller TGF- 2.5 ng/mL, alene eller i kombinasjon med ML7 25 μM i 24 timer. På slutten av inkubasjonen ble cellene vasket med PBS og aktiviteten til luciferase ble bestemt ved å bruke SteadyGlo Luciferase-analysesystemet (Promega Corporation, Madison, WI, USA) i Multiwell Plate Reader Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA , USA).
4.11. Analyse av syntese av pro-kollagen I, tropoelastin og periostin
Per brønn ble 8×103 HDF dyrket i 96-brønnplater og behandlet med 0.002 prosent av ObHEx eller TGF 2,5 ng/ml. Etter 24 timer ble cellene behandlet for ELISA ved bruk av monoklonalt primært antistoff anti-prokollagen type I(sc-166572, Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), etterfulgt av inkubasjon med det sekundære anti-muse-antistoffet merket med peroksidase(170-6516, Biorad, Hercules, CA, USA). Supernatantene av cellene ble belagt på en annen plate for påvisning av tropoelastin og periostin ved bruk av anti-tropoelastin kaninantistoff (ab21600, Abcam, Cambridge, U eller anti-periostin museantistoff(sc-398631, Santa-Cruz Biotechnology , Dallas, TX, USA), etterfulgt av inkubasjon med sekundært antistoff anti-kanin merket med peroksidase (170-6515, Biorad, Hercules, CA, USA). Den kolorimetriske reaksjonen ble utviklet ved å tilsette 100 μL av en vandig løsning av OPD(O-fenylendiamin),0,35 mg/ml i 50 mM sitratbuffer og 0,012 prosent hydrogenperoksid(H2O2). Etter 30 minutter ble absorbansen målt ved 490 nm ved bruk av multiple-leseren Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).
4.12. Ex Vivo-tester
ImmunoHistoFluorescens (IHF) av MYLK og fosforylert myosin ble evaluert i hudeksplantater fra {{0}} år gamle donorer. Humane hudeksplantater ble kuttet med stansebiopsi-kyretter på 8 mm og dyrket i 24-brønnplater i DMEM med 10 prosent FBS og antibiotika. De oppnådde slagene ble behandlet med 0.002 prosent og 0,006 prosent av ObHEx i 24 timer. De ble inkubert i 15 prosent sukrose, deretter i 30 prosent sukrose, og til slutt frosset. Deretter ble 10 μm seksjoner oppnådd ved bruk av CM1520 kryostat (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland). Objektglass med kryoseksjoner ble hydrert i 30 minutter i PBS og plassert i en "blokkerende" løsning (6 prosent BSA, 5 prosent serum, 20 mM MgCl, 0,2 prosent Tween) i 1 time. Kryoseksjoner ble inkubert med det primære anti-MYLK-kaninantistoffet (1:100, GeneTex, Irvine, CA, USA) og antistoffets primære anti-fosfo-myosin (1:100, LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA) i 16 timer kl. 4 grader. Objektglassene ble vasket med PBS i 30 minutter og deretter inkubert med det sekundære anti-kanin Alexa-Fluor 546 antistoffet (1:1000; A11035 ThermoFisher, Waltham, MA, USA) i 1 time. Kjernene ble farget med DAPI(4',6-5 diamidino-2-fenylindol)1 ug/ml i PBS i 10 min. Bildene ble tatt med et fluorescensmikroskop og analysert med ImageJ-programvaren. For IHF av tropoelastin og kollagen I ble hudeksplantater fra 36-år gamle kvinnelige donorer brukt. Hudbiopsier ble oppnådd som beskrevet ovenfor og forhåndsbehandlet med 0,002 prosent og 0,006 prosent av ObHEx i 24 timer. Stress med hydrokortison ved 10 ug/ml i 8 dager ble tilsatt i nærvær av ObHEx. Etterpå ble biopsier frosset som beskrevet ovenfor og seksjonene ble inkubert med det primære antistoffet anti-tropoelastin kanin (1:1000 ab21600, Abcam, Cambridge, Storbritannia) og anti-kollagen I (1:100 C2456 Merck, Darmstadt, Tyskland) for 16 timer ved 4 grader. Lysbildene ble analysert som beskrevet ovenfor, og bildene ble innhentet og analysert med ImageJ-programvaren.
4.13. Atomic Force Microscopy (AFM) i hudeksplantater
Elastisiteten til hudprøver ubehandlet og behandlet med ObHEx ble evaluert for å sikre deres Youngs moduli ved en metode i nanometrisk skala basert på Atomic Force Microscopy (AFM), utviklet ikke bare for biologiske prøver, men også for uorganiske. Disse tilnærmingene er basert på Hertzs modellers antakelser og betraktet prøven og utkragingen som to fjærer i en serie i en AFM-eksperimentsetting. Kort fortalt, hud eks-plante behandlet med 0.006 prosent av ObHEx og ubehandlede hudprøver ble kuttet med kryostat i skiver på 10 um i tykkelse. Prøver ble lagret ved 12 grader, deretter vasket med PBS og undersøkt ved en fast temperatur og relativ fuktighet på henholdsvis 22 grader og 55 prosent. Hver prøve ble undersøkt av en NanoScope IIA AFM in Force Spectroscopy Single Mode ved å bruke en pyramideformet spiss (RESP-20) med en fjærkonstant på 0,9 N/m. For å beregne Youngs modul ble ti kraftkurver i ti forskjellige punkter av samme prøveoverflate innhentet. Hver kraftkurve er en kurve for avbøyning (Volt) versus forskyvning (nm) og kan konverteres til kurver for kraft (N) versus separasjon (nm). Faktisk rapporterer hver kraftkurve laste- og lossekurver. De representerer spissens trend med hensyn til prøven: når spissen er langt fra prøven når de kommer i kontakt og spissen begynner å bøye seg, og når den beveger seg bort igjen. Bare den første delen av disse kurvene kan undersøkes. Hver av disse delene av kurvene var tilpasset en standard Hertzian-modell, spesielt den typiske Hertzequation for en pyramidespiss, for å trekke ut elastisitetsmodulen kjent som Youngs modul i GPa.
4.14. Statistisk analyse
Alle verdiene som ble rapportert var gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter, som hver ble utført i tre eksemplarer. Stjernene indikerer statistisk signifikans beregnet i samsvar med t-testen: *betyr verdi Mindre enn eller lik 0.05;** p-verdi Mindre enn eller lik 0. 01;***p-verdi Mindre enn eller lik 0,001.
Denne artikkelen er hentet fra Metabolites 2021, 11, 527. https://doi.org/10.3390/metabo11080527 https://www.mdpi.com/journal/metabolites
