Anastatinderivater lindrer myokardiskemi-reperfusjonsskade via antioksidative egenskaper

For ytterligere informasjon, kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt:(±)-Anastatin A og B er flavonoider isolert fra Anastatica hierochuntica. I en tidligere studie ble tjuefire di- og tri-substituerte nye derivater av anastatiner designet og deres foreløpige antioksidantaktiviteter ble evaluert. I denne studien ble den beskyttende effekten av myokardiskemi-reperfusjon (I/R) og den systematiske antioksidantkapasiteten til 24 derivater studert videre. Forbindelse 13 var den mest potente blant alle forbindelsene som ble studert, noe som økte overlevelsen av H9c2-celler til 80,82 prosent. Antioksidantevnen til forbindelse 13 ble evaluert i jernreduserende antioksidantkraft, 2,2'-azino-bis (3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre) radikalfjerning og 2,2-difenyl{ {20}}picrylhydrazyl-analyser. Det ble observert at forbindelse 13 signifikant reduserte infarktområder og forbedret histopatologiske og elektrokardiogramforandringer hos rotter med myokard-I/R-skade. Videre reduserte forbindelse 13 lekkasjehastigheten av serumlaktatdehydrogenase, kreatinkinase og malonyldialdehyd fra rottemyokardvev og økte nivået av glutation- og superoksiddismutaseaktiviteter ettermyokard I/R-skadehos rotter. Til sammen konkluderte vi med at forbindelse 13 hadde potente kardiobeskyttende effekter mot myokard-I/R-skade både in vitro og in vivo på grunn av dens omfattende antioksidantaktiviteter.

Nøkkelord: flavonoidderivater; H9c2-celler; hypoksi/reoksygenering; kardiobeskyttende effekter

Klikk her for å få mer produktinformasjon

1. Introduksjon

Iskemisk hjertesykdom (IHD) er en ledende dødsårsak på verdensbasis [1]. Rettidig restaurering av blodstrømmen kan effektivt forbedre det kliniske resultatet av sykdommen; reperfusjon er imidlertid ikke uten risiko på grunn av omfanget av cellulær skade forårsaket av selve reperfusjonen. Derfor er det ekstremt viktig å utvikle effektive terapeutiske strategier mot myokardiskemi-reperfusjon (I/R) skade [2]. Mekanismen for myokard I/R-skade er svært komplisert; det inkluderer apoptose, oksidativt stress [3], kalsiumoverbelastning [4] og betennelse [5].Oksidativt stresskan føre til apoptose gjennom forskjellige signaltransduksjonsveier, inkludert signalregulert kinase (ERK), c-Jun aminoterminal kinase (JNK), aktivering av p53 (tumorprotein p53) og p66shc-variant. Dessuten kan overdreven produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) forårsake irreversibel skade på cellemembraner og cellulære molekyler, slik som DNA, nukleinsyrer, protein, lipider, og starte kjedereaksjoner, som ytterligere skader myokardvev. Oksidativt stress [6], som er forårsaket av en ubalanse mellom dannelse av frie radikaler og fjerning av ROS, spiller en viktig rolle i patogenesen av I/R-skade I. Derfor er strategier som beskytter myokardiet mot oksidativt stress høyt vurdert i behandlingen. av myokard I/R-skade. Derfor, på grunn av deres potensielle frie radikaler-fjernende evner, er antioksidantbaserte strategier fordelaktige i behandlingen av I/R-skader.

I kliniske studier pleide antioksidanter å reduseremyokard I/R-skadeer hovedsakelig delt inn i to typer: enzymer og ikke-enzymer. Enzymer som katalase og glutationperoksidase reduserer konsentrasjonen av hydrogenperoksid for å forhindre celleskade; ikke-enzymatiske antioksidanter som vitamin E, vitamin C, -karoten, etc., svekke vevets oksidative stressrespons for å redusere vevsskade og fremme funksjonell reparasjon. Imidlertid har bruken av begge for tiden visse begrensninger. Den store molekylmassen til enzympreparater bidrar ikke til absorpsjon [8]. Det er også visse problemer med stabiliteten til ikke-enzymene, noe som fører til dårlig stabilitet av legemidler, og derfor oksideres de lett [9].Flavonoider, som en slags ikke-enzymatiske antioksidanter, har det blitt rapportert å ha en rekke potente egenskaper, inkludert antioksidant, anti-kreft, antiapoptotisk og kardiovaskulær beskyttelse [10]. De forhindrer dannelsen av svært reaktive oksider og hemmer oksidative reaksjoner ved å rense ROS, slik som hydrogenradikaler og peroksynitritt. Anastatin A og B [11] er flavonoider med hepatobeskyttende aktivitet. Anastasius A og B er aktive komponenter i Anastatica hierochuntica (undertype Anastatica, familien Brassicaceae). For tiden er det svært få rapporter om kjemisk syntese og strukturelle modifikasjoner av anastatin A og B. I 2003 ble aktive forbindelser fra Anastatica hierochuntica isolert og avslørt å ha hepatobeskyttende effekter mot D-galaktosamin-indusert cytotoksisitet i primære dyrkede musehepatocytter. Nakashima og Eman har også vist at forbindelsene utøver in vitro antioksidant- og antikreftaktiviteter. Imidlertid forblir de farmakologiske effektene av anastatinene A og B og deres derivater, så vel som prosedyrer for deres syntese, uklare. Derfor hadde vi som mål å syntetisere anastatinene A og B og noen av deres derivater og evaluere dem for antioksidantaktiviteter i en hypoksi/reoksygenering(H/R) modell, som er effektiv for å studere myokard I/R-skade [12].

I en tidligere studie syntetiserte vi anastatinene A og B og deres analoger og evaluerte deres antioksidantkapasitet ved å bruke en cellekulturmodell av H2O2 (hydrogenperoksid)-indusert oksidativ skade13. Våre tidligere resultater viste at anastatinene A og B har potente hepatobeskyttende aktiviteter som ser ut til å være relatert til deres antioksidantevner.

I denne studien ble anastatinene A og B og 24 av deres derivater syntetisert og evaluert for antioksidantegenskaper ved å bruke reduserende kraft og radikalfjernende tester. I tillegg ble en enkel H9c2-cellemodell av H/R og en rottemodell for myokard I/R-skade brukt for å evaluere de kardiobeskyttende effektene av forbindelsene.

2. Resultater

2.1.H/R-modelletablering

Konsentrasjonen av Na2S, O4-behandling ble vurdert som vist i figur 1A, og overlevelsesraten for H9c2-celler ble redusert med økende Na2S2O4-konsentrasjon. Under 4 mM av Na, S, Oa, sank cellelevedyktigheten til mindre enn 50 prosent (henholdsvis 13,7,25 og 43,4 prosent ved reoksygeneringstiden på 2,1 og 0 timer) , og nivået av cellelevedyktighetsreduksjon var lavere. Derfor ble en 4 mM konsentrasjon av Na2S2O4 brukt for å etterligne hypoksisk behandling. Figur 1B viser at 4 mM Na2S2O4-behandling i 2 timer uten reoksygenering (0 timer) reduserte cellelevedyktigheten betydelig, og forble stabil. Under betingelse av 4 mM konsentrasjon av NazS2O4 i 2 timer med etterligning av hypoksi, reduserte 2 timer med reoksygenering celleoverlevelse til 17,37 prosent (Figur 1C). Som det er tydelig vist i figur 1D, reverserte 10 μM resveratrol den reduserte cellelevedyktigheten forårsaket av H/R, som var kraftigere enn den samme konsentrasjonen av gallussyre (74,34 vs. 60,44 prosent for gallussyre).

Som et resultat ble hypoksi/reoksygeneringsmodellen etablert ved å bruke Na2S, O4 ved en sluttkonsentrasjon på 4 mM i 2 timer med etterlignende hypoksi etterfulgt av kultur i normal DMEM (Dulbeccos modifikasjon av Eagles medium)/høy glukose for å etterligne reoksygeneringsskade . Resveratrol ved en sluttkonsentrasjon på 10 μM ble brukt som positiv kontroll.

2.2. Anastatiner og deres derioatioer forbedrer levedyktigheten til H9c2-celler som er utsatt for H/R-behandling

Først undersøkte vi effekten av anastatinene A og B (Figur 2A, B) og deres derivater på levedyktigheten til H9c2-celler i en MTT(3-(4,5)-dimetyltiahiazo(-z-y1){{ 10}},5-di-fenyletrazoliumromide) analyse [13]. Forbindelsene 20a, 21a, 22a, 20b, 22b, 20c, 20c', 21c, 22c, 10 og 11 var ikke signifikant cytotoksiske for H9c2-celler (figur 3A, B, tabell S2). Anastatin A og B, deres derivater og resveratrol (positiv kontroll) reverserte hypoksi-indusert celleskade (figur 4). I modellgruppen ble cellelevedyktigheten redusert til 20,31 prosent , som ble økt til 82,68 prosent av resveratrol, og anastatin A og forbindelsene 22b, 22c, 24b, 24c, 13 og 14 økte celleoverlevelsesraten til mer enn 70 prosent ( henholdsvis 71.49,71.00,76.50, 73.24,77.57, 80.82 og 77.13 prosent). Derfor hadde forbindelse 13 (figur 2C) den sterkeste beskyttende effekten blant anastatinderivatene fra H/R-skade og ble brukt i de påfølgende eksperimentene.

2.3. Forbindelse 13 lindrer H/R-indusert celleskade og oksidativt stress

For å utforske antioksidantkapasiteten til forbindelsen, treoksidativt stressindikatorer, LDH (laktatdehydrogenase), GSH (L-Glutation) og SOD (superoksiddismutase), ble valgt for å evaluere antioksidantkapasiteten til forbindelser. LDH er det stabile cytoplasmatiske enzymet som er tilstede i myokardceller, som raskt frigjøres fra celle til cellekulturmedium ved myokardcellemembranskade. Jo mer alvorlig skaden er, desto høyere nivå av LDH i kulturmediet. Figur 5A demonstrerte at 2 timers hypoksi etterfulgt av 2 timers reoksygenering økte LDH-frigjøringen signifikant (478,98 U/L vs. 55,84 U/Lin den blanke gruppen, p<0.001), which="" was="" inhibited="" by="" resveratrol="" (284.07="" u/l="" vs.="" the="" model="" group=""><0.01) and="" compound="" 13(276.61="" u/l="" vs.the="" model="" group,=""><0.001).gsh can="" act="" as="" a="" hydrogen="" donor="" for="" glutathione="" catalase="" (cat),="" eliminating="" o2-="" and="" its="" derivatives="" in="" the="" organism,="" thereby="" cells="" are="" protected="" from="" oxidant="" damage.="" additionally,="" sod="" can="" catalyze="" the="" disproportionation="" of="" superoxide="" anions="" and="" protect="" cells="" from="" damage.="" as="" shown="" in="" figure="" 5b,="" c,="" compound="" 13="" significantly="" increased="" gsh="" release="" and="" sod="" activity=""><0.01）. it="" increased="" gsh="" level="" to="" 39.93="" μmol/gprot="" which="" was="" higher="" than="" the="" level="" in="" the="" model="" group="" （18.2="" μmol/gprot）="" but="" slightly="" lower="" than="" that="" in="" the="" resveratrol="" group.="" additionally,="" it="" reversed="" h/r-induced="" reduction="" in="" sod="" activity="" by="" increasing="" sodlevel="" from="" 12.00="" u/mgprot="" to="" 22.98="" u/mgprot.="" these="" findings="" demonstrate="" that="" compound="" 13="" has="" a="" protective="" effect="" on="" h9c2="" cells="" subjected="" to="" h/r="">

2.4. Antioksidantkapasitet for forbindelse 13

Vitamin C(Vc) was used as an antioxidant control in order to evaluate the antioxidant effects of resveratrol and compound 13 intuitively. FRAP assay was used to evaluate the reducing power of the compound that can transfer ions from Fe3+ into Fe2+ to determine the antioxidant capacity of compounds. The results of the experiment showed that the reducing power of compound 13 was 354.80 mg/mmol, significantly stronger than the values obtained for the positive control Vc (127.47 mg/mmol) and resveratrol (261.91 mg/mmol) (Figure 6A).ABTS (2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)and DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) are stable free radicals insolvent, but when a radical scavenger is added to the solvent, the result is a reduction in the number of free radicals and the degree of reduction in the number of free radicals is directly proportional to the antioxidant capacity. Figure 6B, C show the ABTS and DPPH radical scavenging abilities of compound 13. The results indicate that compound 13 had the strongest scavenging activity on ABTS and DPPH with EC50 values of 1.38 and 0.07 mM, respectively. The antioxidant capacities of the compounds tested in all three antioxidant assays followed the same trend: compound 13>resveratrol. Derfor kan antioksidantkapasiteten til forbindelse 13 være høyere enn for andre typiske antioksidanter.

2.5. Effekter av anastatinderivat 13 på myokard I/R-skade hos rotter

2.5.1. Effekter av forbindelse 13 på oksidativt stress og antioksidantenzymaktiviteter

Nivået av myokardskade ble vurdert ved å påvise den oksidative stressmarkøren og antioksidantenzymaktivitetene. Effektene av forbindelse 13 på MDA (malondialdehyd)-aktivitet i myokardvev, samt nivåene av LDH, CK(kreatinkinase), GSH og SODin-serum, ble vurdert. Som vist i figur 7, resulterte I/R-skade i en økning i nivåene av LDH (Figur 7A) og CK (Figur B) og en signifikant reduksjon i GSH (Figur 7C) og SOD-aktiviteter (Figur 7D) (p<0.001). the="" level="" of="" mda(figure="" 7e)increases="" after="" i/r="" injury,="" which="" is="" a="" critical="" diagnostic="" marker="" of="" i/r="" injury.="" however,="" pretreatment="" with="" a="" positive="" control="" drug="" and="" different="" concentrations="" of="" compound="" 13="" significantly="" alleviated="" these="" injuries.="" ldh="" activity="" obtained="" for="" the="" i/r="" model="" group="" was="" 771.37="" u/ml,="" which="" was="" remarkably="" decreased="" to="" 416.129="" u/ml="" under="" resveratrol="" treatment.="" in="" the="" high-and="" low-dose="" 13="" groups,="" ldh="" activity="" decreased="" to="" 408.05="" and="" 462.81="" u/ml,="" respectively="" similar="" trends="" were="" observed="" for="" other="" myocardial="" injury="" markers,="" including="" the="" level="" of="" ck,="" gsh,="" sod,="" and="" mda="" release.="" these="" results="" indicated="" that="" compound="" 13="" exerted="" protective="" effects="" against="" oxidative="" stress-induced="" i/r="" injury="" in="" a="" dose-dependent="">

2.5.2. Effekter av forbindelse 13 på endringer i elektrokardiogram (EKG) og hjertefrekvens

Typiske EKG (elektrokardiogram) endringer indusert av myokardial I/R skade er vist i figur 8. Sammenlignet med normal EKG(Figur 8A), kan myokard I/R skade forårsake ORS (del av den elektrokardiografiske bølgen) amplitudeøkning (Figur 8B); QRS-bølge og ST-bølgefusjon (Figur 8C); ST-segment (intervallet mellom S-bølgen og T-bølgen) høyde (figur 8D); og ST-segmentinversjon (Figur 8E). Etter 15 minutter med LAD-ligering ble QRS-amplitude signifikant økt fra rundt 0,5 mV til 1,2 mV i modellgruppen (Figur 9A), mens en lavere QRS-amplitudeøkning ble observert i alle behandlingsgruppene (fra rundt 0,4 mV til 1,0,8 og 0,6 mV for henholdsvis resveratrol-, lavdose-13- og høydose-13-gruppen)(Figur 9B-D ). I tillegg ble en lignende trend observert ved ligeringen på 30 min. Under reperfusjonen begynte QRS-amplituden å avta; QRS-bølgen i modellgruppen forble imidlertid den høyeste i hele perioden. Etter 20 min reperfusjon ble QRS-amplituden i modellgruppen redusert til ca. {{30}},8 mV, verdien i behandlingsgruppen var ca. 0,6, 0,5, 0,5 mV for resveratrol, lavdose 13 og høydose 13 gruppen, henholdsvis. Samlet sett reduserte behandlingen av resveratrol, lav dose 13 og høy dose 13 patologisk QRS-amplitudeøkning sammenlignet med modellgruppen under både iskemi og den tidlige reperfusjonsprosessen, noe som kan tilskrives deres myokardbeskyttende aktivitet.

Sammen med overvåking av EKG ble endringene i hjertefrekvensen påvist nøye. Som vist i tabell S3, reduserte 30 minutter med ligering hjertefrekvensen dramatisk i alle grupper, mens ingen signifikante forskjeller ble oppdaget mellom noen av behandlingsgruppene og modellgruppene. Etter 2 timer med reperfusjon økte hjertefrekvensen, men ingen signifikante endringer ble funnet blant noen av gruppene.

2.5.3. Effekter av forbindelse 13 på infarktområde og histopatologiske endringer

For å evaluere nivået av myokardskade ble hjertevev farget med TTC (2,35-trifenyltetrazoliumklorid) og histopatologiske endringer ble oppdaget. Som vist i figur 10, i den falske gruppen, ble det ikke observert endringer i myokardiet etter TTC-farging, mens en skala på omtrent 30 prosent av hvite infarktområder ble observert i I/R-gruppen. I resveratrolgruppen og lavdose 13-gruppene ble infarktområdene betydelig redusert til rundt 10 prosent, og infarktområdet i høydose-13-gruppene ble minimert til rundt 5 prosent. Figur 10 viser resultatet av HE (hematoxylin-eosin) fargeundersøkelse: forstørrelse av hjerteceller, delvis oppløste membraner og kjerner, og inflammatorisk celleinfiltrasjon ble observert i vevssnitt fra modellgruppen. Imidlertid lindret forbehandling med forbindelse 13 disse histopatologiske endringene betydelig. Resultatene av TTC-farging og HE-farging indikerte at forbindelse 13 kan redusere I/R-indusert myokardinfarkt på en doseavhengig måte.

3. Diskusjon

Med sikte på den potensielle antioksidantaktiviteten til anastatinene A og B, syntetiserte laboratoriet vårt 24 derivater av anastatiner og utførte en foreløpig analyse av cytotoksisiteten til forbindelser mot PC-12 og deres cytobeskyttende aktivitet i HO,-indusert oksidativ skade [13] . I denne studien gjennomførte vi hovedsakelig den dyptgående biologiske evalueringen av 13 av de 24 derivatene med de sterkeste antioksidantaktivitetene.

I denne studien ble myokard I/R-skade etablert i H9c2-celler gjennom induksjon med H/R-behandling. Resultatene av studien indikerte at anastatinene A og B og deres undersøkte derivater forbedret levedyktigheten til H9c2-celler etter H/R-behandling. Forbindelse 13 ble funnet å være den mest potente blant de 26 forbindelsene som ble studert og ble derfor valgt for videre evaluering. Aktivitetene til LDH (en markør for celleskade), SOD og GSH (oksidative stressmarkører) ble påvist i supernatantene til H9c2-celler etter H/R-behandling. Vi fant at forbehandling med testforbindelsene signifikant reduserte LDH-nivåer og økte SOD- og GSH-nivåer i cellene. Dermed antok vi at anastatinderivater hadde kardiobeskyttende aktivitet som kan tilskrives deres evne til å undertrykke oksidativt stress. DPPH- og ABTS-analysene brukes til å evaluere den radikalfjernende kraften til forbindelsen [14]. Som et resultat hadde forbindelse 13 høy antioksidantkraft, og den fanget ABTS og DPPH ved lave EC50-verdier, noe som ytterligere indikerer undertrykkelse av oksidativt stress. LAD-ligering er en vanlig metode som brukes for å etablere myokardiale I/R-modeller. Ved å vurdere amplituden til QRS-komplekset før iskemi, etter iskemi og etter reperfusjon fant vi at forbehandling med forbindelse 13 kan lindre ventrikulær arytmi betydelig under iskemi og tidlig reperfusjon. Videre påvirket forbindelse 13 også infarktområdene og histopatologiske endringer av hjerteinfarkt. Disse resultatene, sammen med funnene om at forbindelse 13 undertrykte oksidativt stress og økte nivåene av antioksidantenzymer i rotteserum på en doseavhengig måte, viste at forbindelse 13 hadde en potent effekt mot myokardskade.

Avslutningsvis hadde anastatinderivater kraftige antioksidantegenskaper, med forbindelse 13 som viste den høyeste antioksidantaktiviteten blant de testede forbindelsene. Mekanismene som er ansvarlige for effekten av anastatinderivater på oksidativt stressrelaterte signalveier må fortsatt diskuteres. Astaxanthin (en undertype av karotenoid) kan rense ROS og lindre ytterligere iskemi/reperfusjonsskade [15]. Legemidler med potensial til å forhindre ROS-generering kan være lovende ved oksidativt stressrelaterte sykdommer [4] som celleterapi og hjerte- og karsykdommer. Videre undertrykker ROS den hypoksiske induksjonen av hypoksi-induserbar faktor-1 (HF-1) målgenekspresjon, som er rapportert å ha en kardiobeskyttende effekt på iskemi-reperfusjonsskade [16]. Vi antar at ROS- og HIF{10}}-regulatorisk protein kan spille en avgjørende rolle i den kardiobeskyttende effekten av forbindelse 13. Tournefolic acid B (TAB), som er avledet fra kinesisk urtemedisin, beskytter mot myokard I/R-skade [17 ]. Studien avslørte de viktige rollene til TAB i endoplasmatisk retikulum (ER) stress, apoptose og PI3K(fosfatidylinositol 3 kinase)/AKT(proteinkinase B)-veier i behandlingen av myokard I/R-skade. Andre veier, slik som mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK)-banen [18] og AMPK (Adenosin 5'-monofosfat-aktivert proteinkinase) signalvei [19], kan også være involvert i myokard I/R-skade. Derfor er neste trinn å starte med ROS- og HIF-1-regulatoriske proteiner og bruke TAB-medierte veier for å utforske mekanismene som gjør at 13 utøver en antioksidanteffekt og beskytter myokardial I/R. Dessuten bør eksperimentene på cellenivå i denne studien også utføres i humane cellelinjer.

4. Materialer og metoder

4.1.Cellekultur

Rottekardiomyocytt H9c2-cellelinje ble kjøpt fra Nanjing Kebai Biotechnology Company (Nanjing, Kina). Celler ble dyrket i DMEM/høy glukose (Hyclone, USA) og supplert med 10 prosent FBS (Lanzhou Minhai Biological Engineering co.LTD, Lanzhou, Kina) og 1 prosent penicillin/streptomycin (Hyclone, Marlborough, MA, USA) i en fuktet inkubator på 37 grader med 5 prosent CO2.

4.2. Cellelevedyktighetsanalyse

Cellelevedyktighet ble målt ved å bruke MTT-analysen. H9c2-celler ble sådd i en 96-brønnplate ved 1 × 10* celler/brønn i 24 timer. Etterpå ble cellene behandlet med anastatin A og B, og deres derivater i 48 timer eller forbehandlet med anastatiner A og B, og deres derivater etterfulgt av H/R-behandling. Deretter ble MTT (20 μL/brønn) tilsatt og dyrket ved 37 grader i 4 timer. Absorbansen ble målt ved 578 nm ved å bruke en mikroplateleser (Tecan, Infinite 50). Cellelevedyktigheten i den blanke gruppen ble ansett som 100 prosent.

4.3. Hypoxia/Reoxygenation(H/R) Model and Drug Administration

4.3.1.H/R-modell

NazS, O4 ble brukt for å etterligne den hypoksiske tilstanden, som reagerer med [20] oksygen og reduserer oksygenspenningen. En rekke syv konsentrasjoner av 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 eller 6 mM ble utført for å bestemme de optimale konsentrasjonene av Na2S, O4. For å velge optimal hypoksitid ble kulturer på 0,5, 1,2, 3 eller 4 timer utført etter behandling med Na2S2O4-løsning. Kulturen under normalt DMEM/høyt glukosemedium i 0, 1, 2, 3 eller 4 timer ble utført for å etterligne reoksygeneringstiden [21].

4.3.2. Legemiddeladministrasjon

For medikamentadministrering ble anastatinene A og B og deres derivater (kjemiske strukturer i tabell S1) delt inn i to grupper: anastatiner A og dens derivater, og anastatiner B og dens derivater. Resveratrol, som ble rapportert å ha en kardiobeskyttende effekt gjennom sin antioksidantaktivitet, ble brukt som en positiv kontroll. For å bestemme konsentrasjonen av den positive kontrollen, ble resveratrol og en annen antioksidantforbindelse, gallussyre (3-100 μM), evaluert ved å bruke en MTT-analyse der cellene ble behandlet i 48 timer 【22】. Generelt ble H9c2-celler forbehandlet med anastatin A og B og deres derivater (10 uM sluttkonsentrasjon) samt 10 uM resveratrol i 30 minutter før H/R-behandling.

4.4.Evaluering av antioksidantkapasitet

4.4.1. Ferri-reduserende antioksidantkraft (FRAP)-analyse

FRAP-analysen ble utført i henhold til Oivuans metode 【23】. Totalt 25 μL 1 prosent kaliumferricyanid K3Fe（CN）6 ble pipettert og 10 μL av forbindelse 13, vitamin c(askorbinsyre, Vc) og resveratrol(0.{{8} } mM) pluss 1 × PBS (pH=6.6) ble lagt til. Blandingen ble holdt i 50 graders vannbad i 20 minutter etterfulgt av rask isavkjøling. Deretter ble 25 μL 10 prosent trikloreddiksyre (TCA), 0,1 prosent jernklorid (FeCl) og destillert vann tilsatt i rekkefølge. Blandingen ble overført til en 96-brønnplate og absorbansen ble analysert ved 650 nm. Vc-løsning (20-200 ug/mL) ble brukt til å bygge en standardkurve. Antioksidantevnene ble beregnet fra den lineære kalibreringskurven og representert som Vc-ekvivalenter.

4.4.2.ABTS-metoden

ABTS-radikaloppfangningsaktiviteten [24] ble utført i henhold til Sugahara et al. og Re et al. ABTS-løsningen ble fortynnet for å justere absorbansen spektrofotometrisk ved 650 av 0.70±0.02 nm, og ABTS-fjernende aktiviteter ble målt iht. følgende formel, E=((Acontrol-Ablank)-(A2 -A1)/(A control-Ablank))× 10, der Kontroll er absorbansen til kontrollreaksjonen som inneholder 130 μL ABTS · pluss arbeidsløsning og 5,5 μL prøvefortynningsmiddel (DMSO), og Ablank er absorbansen til 130 μL natriumacetatbuffer og 5,5 μL DMSO. A er absorbansen til 130 μL ABTS pluss arbeidsløsning (natriumacetatbuffer) og 5,5 μL av forbindelse 13(0.02-20 mM), og Az er absorbansen til 130μL natriumacetatbuffer og 5,5 μL (forbindelse 13) 0,02-20 mM). Alle blandinger ble vortexet i 30 s og inkubert ved romtemperatur i 10 minutter etterfulgt av måling av absorbansen ved 650 nm. ECs0 ble beregnet ved å bruke den lineære sammenhengen mellom forbindelseskonsentrasjonen og sannsynligheten for prosentandelen av ABTS-hemming.

4.5. Iskemi-reperfusjonsmodell

4.5.1.Dyrestell

Sprague Dawley (SD) rotter ble hentet fra PLA Military Academy of Medical Sciences Laboratory Animal Center (Beijing, Kina). Femti SD-hannrotter som veide fra {{0}} g ble akklimatisert i én uke under romtemperatur på 23± 1 grad med en 12 timers lys/mørke-syklus og mat og vann ble gitt. Rotter ble delt inn i fem grupper: den blanke gruppen (rotter fikk ingen behandling, men falsk operasjon), modellgruppen (rotter fikk vehikelbehandling og MI/R-operasjon), resveratrolgruppen (rotter fikk 200 mg/kg resveratrol og MI/R) operasjon), lavdose 13-gruppen (rotter fikk 100 mg/kg forbindelse 13 og MI/R-operasjon), og høydose 13-gruppen (rotter fikk 200 mg/kg forbindelse 13 og MI/R-operasjon). Forbindelser ble formulert i 0,5 prosent natriumkarboksymetylcellulose og dosert som en suspensjon ved 1 ml/kg oralt én gang daglig i syv dager. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med National Institutes of Health-veiledningen for stell og bruk av laboratoriedyr og godkjent av den akademiske komité ved Tianjin University of Science and Technology.

4.5.2. Eksperimentell protokoll

Sprague Dawley-rotter ble bedøvet med 20 prosent uretan (0,8 ml/100 g), og vi utførte deretter myokardiskemi ved venstre anterior descending (LAD) ligering. Hjertet ble eksponert gjennom et venstre thoraxsnitt og plassert på en 4-0 silkesutur for å utføre regional iskemi i 30 minutter med iskemi etterfulgt av 2 timers reperfusjon. Beviset for myokardiskemi ble bekreftet av ST-segmentheving og QRS-amplitudeøkning. Under eksperimentet ble rottene holdt på en ventilator DW3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Beijing, Kina). Hjertefrekvens og EKG ble overvåket gjennom det biologiske signalinnsamlingssystemet MD3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Beijing, Kina). Etter å ha overvåket iskemi/reperfusjonsprosessen, ble rottene ofret og blodprøver og hjertehomogenater ble brukt til å oppdage myokardskade ved bruk av kommersielle detektivsett.

4.5.3. TTC-farging og HE-farging

Omfanget av det iskemiske området ble kvantifisert ved trifenyltetrazoliumklorid (TTC)-farging. Hjerteprøvene ble frosset umiddelbart ved {{0}} grader i 10 minutter og fem skiver av tynne 1 til 2 mm skiver ble laget. Deretter ble skivene plassert i 1 prosent TTC-fosfatbuffer (pH=7.0) og farget ved 37 grader i 20 minutter, og ble fiksert i formalin. Bilder ble tatt med et digitalkamera, og prosentandelen av infarktområdet (TTC-negativ) og risikoområdet (TTC-positivt) ble målt ved hjelp av ImageJ-programvare [25]. For HE-farging ble det infarkterte området skåret ut og fiksert i 10 prosent formaldehyd og deretter innebygd i parafin. Etter det ble vev farget med HE (hematoxylin-eosin) og undersøkt under et lysmikroskop. Dehydrerte innebygde seksjoner og tetningsseksjoner ble bestilt av Tianjin YiSheng Yuan Biotechnology Company (Tianjin, Kina).

4.6. Spektrofotometriske kommersielle sett

Kommersielle sett brukt i denne forskningen ble kjøpt fra Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd. (Beijing, Kina) og Nanjing Jiancheng Bioengineering Company (Nanjing, Kina). I rotteserum og cellesupernatant, myokardskademarkør, laktatdehydrogenase (LDH ), kreatinkinase (CK), glutation (GSH) og superoksiddismutase (SOD) aktiviteter ble evaluert. Malondialdehyd (MDA) aktiviteter ble målt ved bruk av rottehjertehomogenat. Alle kommersielle sett ble utført etter produsentens instruksjoner.

4.7. Statistikkprosess

Alle forsøkene ble gjentatt minst tre ganger. De eksperimentelle dataene ble behandlet med GraphPad Prism7-programvare, og det eksperimentelle resultatet for hver gruppe ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (x± s). T-testen ble brukt til å sammenligne den statistiske signifikansen mellom gruppene. P<0.05 was="" recorded="" as="" statistically="">

Referanser

1. Uzdensky, AB; Demyanenko, S. Histonacetylering og deacetylering ved iskemisk hjerneslag. Nevral Regen. Res. 2021, 16, 1529–1530. [CrossRef] [PubMed]

2. Li, H.; Yin, A.; Cheng, Z.; Feng, M.; Zhang, H.; Xu, J.; Wang, F.; Qian, L. Dempning av Na/K-ATPase/Src/ROS-amplifikasjonssignalvei med pNaktide forbedrer myokardiskemi-reperfusjonsskade. Int. J. Biol. Macromol. 2018, 118, 1142–1148. [CrossRef] [PubMed]

3. Levin, RM; Xia, L.; Wei, W.; Schuler, C.; Leggett, RE; Lin, ADY Effekter av Ganoderma Lucidum skall-brudd spore på oksidativt stress av kanin urinblæren ved bruk av en in vivo modell av iskemi/reperfusjon. Mol. Celle. Biochem. 2017, 435, 25–35. [CrossRef] [PubMed]

4. Tan, Z.; Liu, H.; Song, X.; Ling, Y.; Han, S.; Yan, Y.; Yan, J.; Wang, S.; Wang, X.; Chen, A. Honokiol etterbehandling forbedrer myokardiskemi/reperfusjonsskade ved å øke autofagisk effluks og redusere intracellulær ROS-produksjon. Chem. Biol. Samhandle. 2019, 307, 82–90. [CrossRef] [PubMed]

5. Hausenloy, DJ; Yellon, DM Myokardiskemi-reperfusjonsskade: Et forsømt terapeutisk mål. J. Clin. Undersøk. 2013, 123, 92–100. [CrossRef]

6. Yu, C.; Li, D.; Li, Z.; Yu, D.; Zhai, G. Effekt av sacubitril/valsartan på betennelse og oksidativt stress i doxorubicin-indusert hjertesviktmodell hos kaniner. Acta Pharmaceut. 2021, 71, 473–484. [CrossRef]

7. Wang, Y.; Che, J.; Zhao, H.; Tang, J.; Shi, G. Platycodin D hemmer oksidativt stress og apoptose i H9c2-kardiomyocytter etter hypoksi/reoksygeneringsskade. Biochem. Biofys. Res. Commun. 2018, 503, 3219–3224. [CrossRef]

8. Pavlovic, M.; BNáfrádi Rouster, P. Svært stabil enzym-etterlignende nanokompositt av antioksidantaktivitet. J. Colloid Interface Sci. 2019, 543, 174–182. [CrossRef]

9. Qi, HZ; Wangi, WZ; He, JY Antioksidativt system av Deinococcus radiodurans. Res. Microbiol. 2019, 171, 822–831. [CrossRef]

10. Shao, L.; Shao, Y.; Yuan, Y. Pinocembrin-flavanon hemmer cellelevedyktighet i PC-3 human prostatakreft ved å indusere cellulær apoptose, ROS-produksjon og cellesyklusstans. Acta Pharmaceut. 2021, 71, 669–678. [CrossRef]