Anti-aldringseffekt av urolithin A på bovine oocytter in vitro

Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon

Abstrakt:Oksidativt stress og mitokondriell dysfunksjon har vært assosiert med den aldersrelaterte nedgangen i oocyttkvalitet, og strategier for forebygging av dem er for tiden etterspurt. Urolithin A (UA) er en naturlig metabolitt med pro-apoptotiske og antioksidanteffekter, i stand til å forhindre akkumulering av dysfunksjonelle mitokondrier i forskjellige gamle celler. UA har aldri blitt testet i bovine oocytter. Målet vårt var å studere effekten av UA på utviklingspotensialet til cumulus-oocytt-komplekser (COCs) og granulosaceller (GCs) uttrykk for viktige gener relatert til reproduksjonskompetanse. Nukleær modningsprogresjon, mitokondriell membranpotensial (MMP) og utviklingskompetanse for fysiologisk modne (22 timer) og in vitro-aldrede oocytter (30 timer med IVM) oppnådd fra prepubertale og voksne kvinner, enten supplert med UA eller ikke, ble vurdert. I tillegg ble mengden mRNA fra flere gener (NFE2L2, NQO1 og mt-DN5) og antall mt-ND5 DNA-kopier kvantifisert i dyrkede GC fra prepubertale og voksne kvinner, enten supplert med UA eller ikke. Vår studie bekreftet den skadelige effekten av oocyttaldring på nukleær modningsprogresjon, MMP, utviklingskompetanse og genuttrykksnivåer. UA-behandling under in vitro-modning forbedret (s<0.05) the="" maturation="" rate="" and="" subsequent="" developmental="" capacity="" of="" aged="" oocytes.="" a="" positive="" effect="">< 0.05)="" of="" ua="" on="" physiological="" maturation,="" mmp,="" and="" embryonic="" development="" was="" also="" identified.="" ua="" also="" interfered="" with="" the="" expression="" profile="" of="" nfe2l2="" and="" nqo1="" genes="" in="" gcs="" cultures.="" our="" findings="" demonstrate="" that="" ua="" supplementation="" is="" an="" effective="" way="" to="" prevent="" oocyte="" aging="" and="" improves="" the="" subsequent="" bovine="" embryonic="">

KSL01

Klikk her for å vite mer

Nøkkelord:oocytt; aldring; Urolithin A; assistert reproduksjonsteknologi

1. Introduksjon

Nedgangen i kvinnelig reproduksjonsevne er en av de første fysiologiske funksjonene som påvirkes negativt av aldring og anses derfor som et voksende helseproblem over hele verden [1,2]. I tillegg til flere patologiske problemer, tilskrives den aldersassosierte reduksjonen i kvinnelig fertilitet i stor grad en nedgang i ovariereserven av oocytter [1,3-5] forbundet med en tidsavhengig forringelse av kvaliteten deres [2]. Denne forringelsesprosessen kan oppstå på grunn av eksponering av oocytter til et gammelt ovarie-mikromiljø før eggløsning. I tillegg utsettes den kvinnelige kjønnscellen ofte for post-ovulatorisk aldring når befruktningsprosessen ikke skjer innenfor den beste optimale spennperioden, og den ubefruktede oocytten forblir i egglederen eller in vitroprior til inseminering i lengre perioder [6]Svekkelsen av oocyttkvalitet er en kritisk faktor knyttet til svikt i assistert reproduksjonsteknologi (ART) siden kvaliteten er hoveddeterminanten for embryoets utviklingspotensial etter befruktning [7,8]. Asynkron eggløsning og aldrende oocytter ble ofte rapportert å svekke suksessen til kunstig inseminasjon og embryoproduksjonsprogrammer hos hopper, storfe og sauer, noe som innebærer betydelige økonomiske tap[1,9,10]. Derfor er det av overordnet betydning å studere mekanismene bak oocyttaldring, for å designe bedre terapeutiske tilnærminger for å redde fruktbarhet hos flere arter, inkludert mennesker, og også som et verktøy for genetisk forbedring hos husdyr.cistanche wirkungSpesiell oppmerksomhet må vies til å forbedre utviklingskapasiteten til oocytter fra prepubertale storfe, som ofte brukes til å akselerere genetisk gevinst og forkorte generasjonsintervaller.

En av hovedårsakene til nedsatt utviklingskompetanse hos eldre oocytter er økningen i oksidativt stress, som induserer mitokondriell dysfunksjon, DNA-skade og spindeldannelsesfeil, som påvirker oocyttkvaliteten [1]. Det er godt etablert at økt produksjon av frie radikaler er en årsak til cellulær aldring ved flere kroniske sykdommer og også i reproduksjonsbiologien, noe som resulterer i dårlige fruktbarhetsresultater [12]. Ovariemikromiljøet, som inkluderer oocytter og granulosaceller (GC), gir en antioksidantforsvarsmekanisme i stand til å regulere oksidative forhold og opprettholde oksidant/antioksidantbalansen [13]. Under aldringsprosessen svekkes imidlertid effektiviteten til antioksidantforsvaret for å nøytralisere reaktive oksygenarter (ROS), og øker dermed nivået av oksidativt stress. Den nukleære faktor-E2-relaterte faktor2(Nrf2 eller NFE2L2), også kjent som Nrf2/Kelch-lignende ECH-assosiert protein 1 (Keap1)-vei, er en dominerende responskaskade aktivert av oksidativt stress[14]. Denne banen er en cellulær forsvarsmekanisme som celler har utviklet for å takle de skadelige effektene av oksidativt stress. Under normale forhold reguleres Nrf2 negativt av Keap1, holdes i cytoplasmaet og holdes på lave nivåer. Når det utsettes for oksidanter, blir Nrf2 dissosiert fra Keapl, noe som tillater translokasjon i kjernen hvor det binder seg til spesifikke DNA-sekvenser. Disse sekvensene, kalt antioksidantresponselementer (ARE), fører til transkripsjonell aktivering av cytobeskyttende gener, slik som NAD(P)H:kinon-oksidoreduktase-1 (NQO1), hem oksygenase-1 (HMOX1) , og glutamat-cysteinligase katalytisk underenhet (GCLC) [15,16]. Tidligere studier har vist at aktiveringen av Nrf2-Keapl-signalveien reduserer skade på oksidativt stress ved å øke antioksidantnivåene i humane GC og museovarier[17,18]. Imidlertid forblir dens rolle i den kvinnelige kjønnscellealdringsprosessen unnvikende, selv om det er klart fastslått at mitokondrier er hovedproduksjonsstedet for ROS under denne prosessen [9,10].

KSL02

Cistanche kan anti-aldring

Motsatt er mitokondrier involvert i flere kritiske cellulære funksjoner og er grunnleggende for å møte behovet for energiproduksjon som kreves under oocyttmodning og påfølgende embryonal utvikling [19]. Kompetent mitokondriell aktivitet har vært sterkt assosiert med høyere innhold av mitokondrielt DNA (mt-DNA) og ATP-generering [20], høyere mitokondriell membranpotensiale [21] og opprettholdelse av mitokondriekvalitet og -kvantitet gjennom mitofagi [22]. Videre har mitokondriell aktivitet blitt foreslått å være direkte korrelert med embryo-levedyktighet og bedre fruktbarhetsresultater [23]. Økende bevis støtter at aldersrelaterte mitokondrielle endringer fører til aldring av eggstokkene og deretter redusert embryolevedyktighet og implantasjonspotensial. Disse endringene inkluderer redusert mt-DNA-kopiantall, redusert ATP-generering [20], endringer i mitokondriell genuttrykk [24,mt-DNA-skade [25] og redusert mitokondriell membranpotensial [26].

KSL03

Mitokondriemålrettede terapeutiske tilnærminger førte til en enorm interesse for flere patologier assosiert med aldring på grunn av deres store potensial for å forbedre mitokondriell funksjon [27]. Innenfor dette rammeverket har Urolithin A (UA) - en naturlig metabolitt oppnådd etter inntak av mat som granateple etterfulgt av omdannelsen av tarmmikrobiotaen - blitt vist å forhindre akkumulering av dysfunksjonelle mitokondrier med alderen, indusere mitofagi og også opprettholde mitokondrie. biogenese og respirasjonskapasitet [28,29]. UA har blitt brukt som et lovende terapeutisk medikament for å forhindre noen kreftformer, slik som kolorektal og prostatakreft [30,31]. I tillegg har UA også anti-inflammatoriske [32], anti-fedme [33], antioksidant [34] og anti-aldringsegenskaper [35].sitrus bioflavonoiderEn nylig studie har fremhevet effekten av UA-tilskudd til aldrende fibroblaster i huden på aktiveringen av Nrf2-Keapl-banen, noe som forbedrer deres antioksidantkapasitet. Denne aktiveringen av Nrf2-Keapl-banen reduserer effektivt ROS-nivået, gjennom oppregulering av ekspresjonen av Nrf2 nedstrøms ARE-responsgener (SOD, NQO1, GCLC og HMOX1), noe som indikerer en lovende anti-aldringseffekt [ 35].

KSL04

Flere studier har blitt utført med mål om å forsinke eggstokkaldring, og følgelig forbedre oocyttkvalitet og fruktbarhetsresultater. På grunn av bidraget fra oksidativt stress til aldringsprosessen i eggstokkene, så vel som mitokondriell dysfunksjon, har tilskudd med antioksidanter vist seg som en lovende terapi [36,37]. Det er imidlertid ukjent om Urolithin A-tilskudd kan gjenopprette skaden som oppstår under eggstokkaldring, noe som bidrar til å forhindre infertilitetsproblemer. Derfor var målet med denne studien: (1) å demonstrere at aldring kan endre utviklingspotensialet for cumulus-oocyttkomplekser (COC) og GCs uttrykk for viktige gener involvert i Nrf2-signalveien; (2) for å bestemme om UA kan redde kvinnelig fertilitet som demonstrerer en anti-aldringseffekt i gamle COCs og GCs; og (3) for å evaluere UA-effekt på ekspresjonsnivået til gener involvert i Nrf2-signalveien så vel som på oocyttkvalitet.

2. Materialer og metoder

2.1. Eksperimentelt design

Denne studien ble godkjent av Animal Care Committee of the National Veterinary Authority (N-grad 08965DGAV), i henhold til EUs retningslinjer (nr.86/609/EEC). For å undersøke effekten av aldring på endringen av oocyttkvalitet og den potensielle antialdringseffekten av UA, en modell som bruker p-piller samlet inn fra prepubertale og voksne kyr underkastet in vitro aldring (30 timers modning) eller til fysiologisk modning (22 h) prosesser ble brukt.

2.1.1.Forrige analyse—dose-respons-studie

En tidligere analyse for å bestemme konsentrasjonen av UA som bør brukes under den bovine COC-modningsprosessen ble utført basert på en dose-respons-studie i fire økter. Siden UA aldri har blitt testet i bovine oocytter, ble tidligere doser brukt med suksess for forebygging og lindring av noen kreftformer og for å demonstrere antialdringseffekten av UA i forskjellige cellelinjer [28,39]. P-piller oppnådd fra prepubertale og modne voksne kyr (n=978) ble valgt og deretter tilfeldig delt inn i fem grupper for å teste forskjellige doser av UA: kontroll, 1,10,25 og 50 uM under fysiologisk in vitro-modning. Etter modningsperioden ble noen oocytter (n=154) farget for å bestemme den kromosomale konfigurasjonen og modningsstadiene. De gjenværende modne oocyttene ble underkastet in vitro-inseminering med frossen/tint sæd. Presumptive zygoter ble dyrket, og spaltnings- og blastocysthastigheter ble bestemt på henholdsvis dag 2 og dag 7 av kulturen. Basert på de oppnådde resultatene, nemlig fraværet av skadelige effekter og fremme av modning og blastocystutvikling, ble konsentrasjonen på 1 uM UA valgt.

2.1.2.Eksperiment1

I dette eksperimentet, utført i seks økter, både p-piller fra prepubertal (gjennomsnittsalder=9 måneder,n=660) og voksen (gjennomsnittsalder =39måneder,n=674) kyr ble samlet for å vurdere oocyttkvaliteten og utviklingspotensialet til gamle og fysiologisk modne oocytter samt UA-effekt for å redde kvinnelig fertilitet. P-piller ble tilfeldig delt inn i 8 grupper: (1) kontroll prepubertale gruppe, p-piller fra prepubertale kalver modnet i 22 timer (n=148);(2)UA prepubertale gruppe, p-piller fra prepubertale kalver modnet i medium supplert med 1 uM av UA i 22 timer (n=155);(3)kontroll i alderen 30 timer prepubertal gruppe, p-piller fra prepubertale kalver i alderen gjennom 30 timer av in oitro modning (n=149);(4)UA i alderen 30 timer prepubertale gruppe, p-piller fra prepubertale kalver som er lagret in vitro i 30 timer i modningsmedium supplert med 1 uM UA(n=144);(5) kontroll voksengruppe, p-piller fra voksne kyr modnet i 22 timer (n=155 );(6) UA voksen gruppe, COC fra voksne kyr modnet i medium supplert med 1 uM UA i 22 timer (n=129);(7) kontroll i alderen 30 timer voksen gruppe, COC fra voksne kyr i alderen til og med 30 timer in oitro-modning (n=148); og (8) UA i alderen 30 timer voksen gruppe, COC fra voksne kyr aldret in oitro i 30 timer i modningsmedium supplert med 1 uM UA(n=138).cynomorium fordelerEtter de respektive in vitro-modningsperiodene ble oocytter inseminert med tint kapasitert oksesæd. Deretter ble embryonal utvikling vurdert, og evaluerte både frekvensen av spaltede og produserte embryoer, så vel som deres kvalitet.

I tillegg, i dette eksperimentet, ble p-piller fra hver gruppe hentet for å vurdere deres nukleære modningsstadium (kontroll prepubertal gruppe,n=7;UA prepubertal gruppe, n =7; kontroll i alderen 30 timer prepubertal gruppe, n{ {3}}; UA i alderen 30 timer før puberteten, n=6; kontroll voksengruppe,n=16;UA voksen gruppe,n=21;kontroll i alderen 30 timer voksen gruppe, n{ {9}}; UA i alderen 30 timer voksen gruppe,n=18). Det mitokondrielle membranpotensialet (MP) av p-piller ble også evaluert (kontroll prepubertal gruppe, n=10; UA prepubertal gruppe, n{ {13}};kontroll i alderen 30 t prepubertal gruppe,n=9;UA i alderen 30 t prepubertal gruppe,n=9;kontroll voksen gruppe, n=15; UA voksen gruppe, n{ {19}}; kontroll i alderen 30 t voksengruppe,n=10;UA i alderen 30 t voksengruppe,n=14).

2.1.3.Eksperiment2

Siden GC-ene spiller en viktig rolle i follikulær vekst og oocyttutvikling, ble et andre eksperiment utført i fem økter for å studere effekten av alder og UA på uttrykket av NFE2L2, NQO1 og mt-ND5 ytterligere. Antall kopier av mt-ND5-genet ble også evaluert. GC-er ble oppnådd etter sentrifugering av follikkelvæsken aspirert fra eggstokkene fra prepubertale (gjennomsnittsalder=10 måneder) og voksne kyr (gjennomsnittsalder =62måneder). Disse cellene ble dyrket under følgende betingelser: (1) prepubertal kontroll, dyrking av GC fra prepubertale kalver; (2) prepubertale UA, kultur av GC fra prepubertale kalver supplert med 1 uM UA; (3) voksenkontroll, kultur av GC fra voksne kyr; og (4) voksen UA, kulturen av GC fra voksne kyr supplert med 1 uM UA. Etter GC-sammenløp på den 5. kulturdagen ble de hurtigfrosset i flytende nitrogen, og senere ble DNA og RNA ekstrahert, noe som muliggjorde den påfølgende kvantifiseringen av NFE2L2-, NQO1- og mt-ND5 mRNA-transkripter og også mt-ND5-kopier.

2.2. Oocyttinnsamling og in vitro-modning

Eggstokker fra voksne og prepubertale kyr (tidligere analyse, n {{0}} og eks. 1, n=1334) ble samlet inn på et lokalt slakteri, og holdt ved 35-37 grad, i et fosfatbufret saltvann (PBS) supplert med 0.15 prosent av bovint serumalbumin (w/v, BSA) supplert med 0,05 mg ml-l kanamycin. På laboratoriet ble eggstokkfollikler på 2-8 mm i diameter aspirert med en 19-målernål. Bare p-piller med minst tre lag med kompakte cumulusceller og en homogen ooplasme ble vasket og valgt for modning i henhold til det eksperimentelle designet.ørkenhyasintModning ble utført i en inkubator ved 38,8 grader, 5 prosent CO2 i fuktet luft i 22 eller 30 timer i et modningsmedium bestående av vevskulturmedium 199 (TCM) med 10 prosent av føtalt bovint serum, 0,2 mM natrium pyruvat, 10 ng mL-l epidermal vekstfaktor og 10 μL mL-l gentamicin【40】.

2.3. Granulosa-celleinnsamling og -kultur

Granulosaceller ble oppnådd fra den gjenvunnede follikkelvæsken etter sentrifugering i 1 0 min ved 200x g[41]. Pelleten ble suspendert i 1 ml kulturmedium (TCM199 pluss 10 prosent serum) for å utføre en ny sentrifugering i 5 minutter. Den nye pelleten ble resuspendert i 1 mL kulturmedium enten supplert med 1 uM UA eller ikke i henhold til den eksperimentelle designen og homogenisert med en sprøyte festet til en 19G-nål, minst 30 ganger for å løsne cellene. Etter evaluering av GC-levedyktighet (trypanblått fargestoff, 0,4 prosent w/v), ble cellene sådd i en konsentrasjon på 2×105 levedyktige celler ml-1 og dyrket i fem dager ved 38,8 grader ,5 prosent CO2 i en fuktet atmosfære til sammenløp. Hver 48. time ble kulturmediet tømt ut og forfrisket med et nytt. For DNA- og RNA-ekstraksjon ble GC-er samlet og vasket ved sentrifugering ved 200 x g i 10 minutter. Cellepelleter ble resuspendert i 1 mL PBS, øyeblikkelig hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 grader.

2.4. Oocytt kjernefysisk modning

Nukleære modningsstadier ble vurdert etter 22 eller 30 timers in vitro-modning.Metode for utvinning av flavonoid pdfDenuderte oocytter ble fiksert i en eddiksyre/etanol (1:3, v/v) løsning og holdt ved 4 grader i 48 timer. Deretter ble oocytter farget med 1 prosent aceto-lacmoid-løsning, montert i et Neubauer-kammer og observert under et fasekontrastmikroskop (Olympus BX41). Oocytter ble klassifisert som følger: Germinal vesikkel (GV), kondenserende kromosomer I (CCI), kondenserende kromosomer II (CCII), Diakinesis, Anafase-I/Telofase-I (AI/TI) og MII (Metafase-II) . Kun oocytter med synlig kromatinfarging ble tatt i betraktning [42].

2.5. Vurdering av mitokondriell membranpotensial

For å måle mitokondriell membranpotensial (MP), en indikator på mitokondriell aktivitet, ble mitokondrier farget med 5, 6, 6'-tetraklor-1, 1', 3, 3'tetraetylbenzimidazolkarbocyaninjodid (JC-1 , Invitrogen, Waltham, MA, USA). Denuderte oocytter ble inkubert med 5 ug mL-l JC-1 [37] i et modningsmedium i 30 minutter ved 38,8 grader og 5 prosent CO2 i fuktet luft i mørket. Oocytter ble vasket to ganger i PBS og umiddelbart overført til et forhåndsoppvarmet objektglass og observert under et fluorescensmikroskop (Olympus BX51) ved bruk av det blå fluorescensfilteret (BP 470-490 objektiv UPlanFI 20×/0,50). Mitokondriell membranpotensial ble deretter beregnet som forholdet mellom den målte rød/grønn fluorescens ved bruk av Image]-programvaren (National Institute of Health, Bethesda, MD, USA). 2.6.In vitro fertilisering og embryokultur

In vitro-fertilisering ble utført med frossen-tint sæd fra en holstein-frisisk okse, tidligere underkastet kapasitering ved bruk av Percoll-gradient-metoden (45 og 90), i en konsentrasjon på 2 x 10 grader spermatozoer mL-4.COC og spermier ble co-inkubert i 20 timer ved 38,8 grader og 5 prosent CO2 i fuktet luft. Presumptive zygoter ble deretter overført til dråper av syntetisk oviductal fluid (SOF) medium supplert med BME og MEM aminosyrer, glutamin, glutation og BSA [40]. Etter 48 timer etter insemineringen ble spaltningshastigheten (spaltede embryoer per totalt inseminert oocytter) passert, og spaltede embryoer ble opprettholdt i SOF supplert med BSA og 10 prosent av føtalt bovint serum (FBS). Embryoer ble dyrket i 12 dager [41,43] for å vurdere blastocystutviklingshastigheten (ved dag 7,9 og 12; D7-embryoer per spaltede embryoer) og klekkede embryoer (klekkede embryoer per D7-embryoer) og deres kvalitet [43]. Dag 7 embryoer ble klassifisert som grad 1 (god kvalitet), 2 (god kvalitet) og grad 3 (dårlig kvalitet) [4].

2.7.DNA- og RNA-ekstraksjon og kvantifisering

Totalt DNA og RNA ble isolert fra GCs ved å bruke High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Basel, Sveits) og PureLinkTM RNA Mini Kit (InvitrogenTM, Waltham, MA, USA), i henhold til produsentens instruksjoner. Disse protokollene inkluderte bruk av spinnkolonner som ble brukt til å isolere høykvalitets totalt DNA og RNA og DNase som en behandling for å fjerne genomisk DNA fra RNA [40]. Etter ekstraksjon ble prøvene lagret ved -80 grad. Konsentrasjonen og kvaliteten på DNA og RNA ble bestemt ved hjelp av et NanoDropTM One/OneC spektrofotometer (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA).

2.7.1. Komplementær DNA-syntese

Syntese av komplementært DNA (cDNA) fra RNA-isolater ble utført ved bruk av Xpert cDNA Synthesis Mastermix-settet (GRiSP, Porto, Portugal, i henhold til produsentens instruksjoner. RNA ble omvendt transkribert ved bruk av 500 ng ekstrahert RNA fra hver prøve for å utføre cDNA-syntese, som ble utført ved bruk av en termosykler (T100 Thermal Cycler, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). De resulterende cDNA-ene ble lagret ved -20 grad til bruk for videre analyser. 2.7.2.Primer Design

For denne studien ble primere for målrettet (NFE2L2 og NQO1) og et endogent kontrollgen (6-aktin) designet ved å bruke Primer-BLAST-programvaren til National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www. .ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/, åpnet 6. mars 2020). Sekvenser av primere for referansegenene og målgenene er avbildet i tabell 1. I tillegg ble mt-ND5-genet brukt i dette arbeidet, og detaljer om mt-ND5-primere ble hentet fra en tidligere studie [45].

2.7.3. Kvantitativ omvendt transkripsjonspolymerasekjedereaksjon

Sanntids PCR-analyser ble utført ved bruk av Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X med ROX i en QuantStudio 3 termosykler (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA), ved bruk av cDNA i en konsentrasjon på 25 ng uL-l. Vurderingen av mitokondriell DNA (mt-DNA) kopinummer av ND5-genet ble utført ved qPCR gjennom det tidligere ekstraherte DNAet, ved bruk av samme utstyr som for kvantifisering av gener. Hver optimalisert reaksjon ble utført, bestående av Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X med ROX, primer (fremover og bakover) av hvert målgen, prøve (cDNA/DNA) og RNase-fritt vann som utgjør et totalt volum på 10 μL. Prøvene ble analysert i duplikat og reaksjoner som inneholdt vann i stedet for mal ble inkludert som negative kontroller. Prøvene ble utsatt for en amplifikasjonsprotokoll som besto av en innledende syklus ved 95 grader i 2 minutter med denatureringsfase, etterfulgt av 40 denatureringssykluser ved 95 grader i 55 s, 40 annealingssykluser i 30 s ved 60 grader (avhengig av smeltetemperaturen til primersekvenser), og forlengelsesfase ved 72 grader i 30 s og til slutt en siste forlengelsesperiode ved 72 grader i 10 minutter.

For kvantifisering av genuttrykk ble den relative kvantifiseringsmetoden brukt. Denne metoden for relativ kvantifisering av genuttrykk ble utført med ekspresjonsnivåene til målgenene som ble undersøkt, som ble normalisert med husholdningsgenene, ved CT-sammenligningsmetoden. Ettersom amplifikasjonen med RT-qPCR ble utført i duplikat, ble gjennomsnittlige CT-verdier for hvert gen bestemt og ekspresjonsnivåene ble beregnet ved å bruke følgende formel:

hvor △Ct=Ct målgen -Ct endogent kontrollgen.

For kvantifisering av mt-DNA antall kopier ble den relative kvantifiseringen normalisert mot enhetsmassemetoden brukt. Denne metoden ble utført med CT-verdiene til GC-er behandlet med UA (kalt som en test), som ble normalisert med kontrollprøver (for tiden betegnet som kalibrator). Ettersom mt-ND5-kopitallet ble vurdert ved qPCR og utført i duplikat, ble de gjennomsnittlige CT-verdiene for testene og kalibratorprøvene bestemt, og forholdene ble beregnet ved å bruke følgende formel: