Anti-aldringspotensial av substans P-basert hydrogel for lang levetid på menneskehuden

Nøkkelord:stoffet Cistanche; anti-aldringseffekt; anti-inflammatorisk effekt; absorpsjon av huden; 3D-modell av menneskelig hud;kosmetisk ingrediens

Klikk her for å få Cistanche for eldre hud

1. Introduksjon

Aldring av hudoppstår på grunn av ulike prosesser, inkludert interne (cellulær metabolisme, hormonelle endringer og genetisk mutasjon) og eksterne faktorer (toksiner, kjemikalier og ultrafiolett (UV) stråling) [1–3].Eldret huder biologisk preget av en generell nedgang av komponentene i den ekstracellulære matrisen (ECM), med uorganisert og redusert kollagen og elastin [4,5]. I tillegg, eninflammatorisk fenomener vanligvisindusert i aldrende hud, forårsakerrynker og fortykkelse av dermisogepidermis. Pro-inflammatoriske mediatorer frigjort fra inflammatoriske cellerkan øke aktiveringen av kollagenaser, kalt matrisemetalloproteinaser (MMP), og dermed føre til kollagennedbrytning [6–8]. Mange antialdringsmaterialer, som har evnen til å forbedre kollagensyntesen, har blitt foreslått de siste dagene. Et av de velkjente materialene er vekstfaktoren. Vekstfaktorer har blitt studert omfattende for hudsårheling [9]. Mange av dem, som blodplateavledet vekstfaktor (VEGF), epidermal vekstfaktor (EGF) og keratinocyttvekstfaktor, påvirker kollagensyntesen direkte via et nettverk av inter- og intracellulære signalveier [9,10]. Imidlertid har topisk påførte vekstfaktorer ikke vært veldig nyttige som antialdringsmidler på grunn av deres store molekylstørrelse, noe som begrenser deres evne til å penetrere det tette stratum corneum [11]. I tillegg til vekstfaktorer er det også utviklet mange antialdringspeptider med lav molekylvekt. For eksempel forhindrer palmitoyltripeptider kollagennedbrytning ved å forstyrre kollagenreduksjon av kollagenaser, slik som MMP1 og 3 [12]. Dessuten har kobbertripeptider, de mest godt undersøkte peptidene, vist seg å stimulere prokollagensyntese [13].

Selv om flere studier har indikert fremme av kollagensyntese av lokalt påførte vekstfaktorer og peptider, kan den enkelte effekten av kollagensyntese, uten en anti-inflammatorisk effekt, ikke være nok til å klinisk forbedre antialdringsytelsen. For mer tydelige effekter, må forbindelsen leveres inn i de dype lagene av huden. Derfor er det et sterkt behov for utvikling av nye materialer, som har den doble funksjonen kollagensyntese og anti-inflammatoriske effekter, sammen med økt hudabsorpsjon. substans Cistanche (CP), et lite peptid bestående av 11 aminosyrer, viser potensiell sårhelingsaktivitet, utøvet via induksjon av celleproliferasjon, kollagensyntese og antiinflammatoriske effekter [14–16]. Imidlertid har den terapeutiske anvendelsen av CP vært begrenset av dens lave stabilitet, noe som kan forsinke dens helbredende egenskaper [17–19]. I vår forrige studie utviklet vi en ny formulering av CP, kjent som CP-gel, som øker stabiliteten til CP under ulike lagringsforhold [20]. I tillegg til stabiliteten har CP-gel vist mer effektiv sårheling enn CP alene ved å øke keratinocytt- og fibroblastproliferasjonen. I det nåværende arbeidet har vi utvidet karakteriseringen av CP-gel og demonstrert dens fremme av kollagensyntese og anti-inflammatoriske effekter for antialdringsytelse. Hudabsorpsjon og pigmentering med CP-gel ble også undersøkt videre. Våre funn viser det høyere anti-aldringspotensialet til CP-gel fremfor CP alene, med økt hudabsorpsjonseffekt, og dermed bredere kosmetisk anvendelighet.

2. Resultater

2.1. In-vitro toksisitet av CP Gel

For at CP-gelen skal kunne brukes mot aldring, vil høye aktiviteter kombinert med lav toksisitet mot menneskelig hud være ønskelig. Derfor ble in vitro toksisitet av CP-gel evaluert ved bruk av humane dermale fibroblaster (HDF-er) og en rekonstruert 3D-hud, keraskin®-FT. Først vurderte vi de skadelige effektene av CP-gel på cellemembranen, med hensyn til den til CP alene, ved laktatdehydrogenase (LDH) -analyse ved bruk av HDF-er (figur 1A). LDH-analysen ble videre brukt, i tillegg til den forrige 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse [20], for mer nøyaktig toksisitetsmåling av CP-gel. Resultatene viste at verken CP-gel eller CP alene viste noen cellemembranskade mot HDF ved alle testede konsentrasjoner. Dessuten hadde behandling med en bærer som mangler CP ingen effekt på cellemembranen i forhold til et medium som bare inneholder PBS. For ytterligere å teste den potensielle irritasjonen på menneskelig hud på grunn av CP-gelen, brukte vi sistnevnte, i forskjellige konsentrasjoner, på hudmodellen med full tykkelse, keraskin®-FT (Figur 1B, C) i totalt 24 timer. For å sammenligne effektene på vevets levedyktighet ble 5 prosent natriumdodecylsulfat (SDS), et kjent irritasjonsmiddel, brukt som en positiv kontroll. CP-gel (1–10 µg/ml) var ikke-toksisk for keraskin®-FT, som demonstrert av MTT-analysen (Figur 1B), noe som indikerer ingen potensiell hudirritasjon sammenlignet med kontroll (PBS-behandling). I tillegg avslørte histologisk undersøkelse at keraskin®-FT ikke hadde påført noen skade i det hele tatt av CP-gel (figur 1C). De samme resultatene ble oppnådd i gruppen behandlet med CP alene (figur S1). Basert på disse resultatene ble selv en høy konsentrasjon av CP-gel (10 µg/ml CP) konkludert som ikke-toksisk, og forårsaket ingen hudirritasjon.

Figur 1, Effekt av substans Cistanche (CP) gel på levedyktigheten til HDF og in vitro rekonstruert 3D menneskelig hud, keraskin@-FT.(A) For skadelige effekter av CP gelformulering på cellemembranen ble HDF behandlet med PBS (Con; kontroll), CP alene eller CP-gel (1-10 ug/ml) i 24 timer, og cellelevedyktighet ble bestemt ved LDH-analyse. (B, C) Hudirritabilitet ble testet med CP-gel (1-10 ug/ml) på in vitro-rekonstruert 3D-hud, keraskin@-pT. Vevslevedyktighet i den CP-gelbehandlede gruppen ble analysert ved MTT-analyse (B) og histologisk undersøkelse (C), PBS ble brukt som en kontroll, og verdier representerer mear pluss SD fra tre uavhengige eksperimenter. Hver verdi ble sammenlignet med kontrollen ved å bruke Student'st-test (** p < 0.01). Målestokk=500 um. HDF, human dermal fibroblast; LDH, laktatdehydrogenaseMTT, 3-(4.5-dimetyltiazol-2-vl)-2 .5-difenyltetrazoliumbromid: PBS, fosfatsmørt saltvannSDS, natriumdodecyl sulfat.

2.2. Effect av CP Gel på produksjonen av kollagen

For å undersøke effekten av CP-gel på kollagensyntese på huden, ble HDF-er behandlet med CP-gel. Resultatene våre viste at CP-gel, inneholdende 1–10 µg/mL CP, signifikant (p < 0.01) økte type I-prokollagenproduksjonen til 128.05 ± 5.19, 145.19 ± 6.80 og 150.68 ± 16,70 prosent sammenlignet med kontrollbehandlingen (PBS) (Figur 2A). Ellers, som vist i figur 2A, ble ingen nevneverdig forskjell i type I kollagenproduksjon observert på tvers av HDF-er behandlet med 1 µg/ml CP alene. Mens CP alene hadde en viss effekt på kollagenproduksjonen ved konsentrasjoner på 5–10 µg/ml (119,96 ± 3,8 og 124,77 ± 8,87 prosent,), var denne effekten signifikant (p < 0,01) lavere enn med CP-gel.

Figur 2. Kollagenøkende effekter av CP-gel i HDF-er. Effekter av CP-gel på type 1 kollagen (A)MMP-1 (B), og TIMP-1 (C) ble målt i HDF. HDF-er ble behandlet med PBS (Con; kontroll)CP alene, eller CP-gel (1-10 ug/mL) i 24 timer, og ekspresjonen av type [procollagen, MMP-1 og TIMP{{8 }} ble målt ved å bruke henholdsvis Procollagen Type IC-peptide (PIP) EIA-settet, humant MMP{{10}} ELISA-sett og IIMP-1 ELISA-sett. PBS ble brukt som en kontroll. Verdier representerer gjennomsnittet pluss SD fra tre uavhengige eksperimenter. * p < 0.05, ** p < 0.01 vs. PBS-holdig medium uten CP, # p < 0.05# y < 0.01 vs. CP alene. HDE, human dermal fibroblast; PBS, fosfatbufret saltvann; MMP-1matriksmetalloproteinase-1; TIMP-1, vevshemmere av metalloproteinase-1; EL ISA, enzymkoblet immunosorbentanalyse.

I ettertid. vurderte nivåene av assosiert med kollagennedbrytning i CPwegel-behandlede HDE-er. Resultatene våre viste at CP-gel som inneholdt 1-10 ug/mL CP signifikant (p < 0.01) hemmet MMP-1-nivåene til 62.88 pluss 6.54, 59.54 pluss 8.35 og 57.44 pluss 7,69 prosent sammenlignet med kontroll HDF-ene (PBS-behandling) (figur 2B). Som forventet hemmet CP alene, som inneholdt 1-10 ug/mL CP, også nivåene av MMP-1 til 80,18 pluss 2,88, 78,48 pluss 6,19 og 79,84 pluss 15,08 prosent, selv om disse effektene var betydelig lavere enn de av CP gel. I HDF-er behandlet med CP-gel, ved CP-konsentrasjoner på 1-10 ug/mL, var ekspresjonsnivåene av vevsinhibitor av metalloproteinase (IIMP)-1, som forårsaker hemming av MMP-1, økt til 113,41 pluss 4,74, 116,76 pluss 3,31 og 115,8 pluss 10,13 prosent sammenlignet med kontrollbehandlingen (PBS) (Figur 2C). Disse resultatene sammen antydet at CP-gel kan akselerere type I-prokollagenproduksjon ved å hemme MMP-1 og forbedre TIMP-1-ekspresjonen i HDF-ene. Sammenlignende analyse av CP-gel og CP alene viste at CP-gel var mer effektiv til å indusere kollagenproduksjon enn CP alene.

2.3. Efficacy av CP Gel ved hudbetennelse

For å undersøke effektenav CP-gel på ekspresjonen av inflammatoriske cytokiner, undersøkte vi om CP-gel hadde en anti-inflammatorisk rolle ved å redusere IL-1 alfa eller -6 og øke IL-10 eller transformerende vekstfaktor (TGF) )-beta 1 i SDS-induserte humane epidermale keratinocytter (HEK). PBS-behandlede celler ble ansett som negative kontroller mens SDS-stimulerte celler fungerte som positive kontroller. Som vist i figur3En, 24-t behandling med CP-gel (5µg/ml CP i CP-gel) betydelig (p < 0.01) reduserte det SDS-induserte uttrykket av IL-1 alfa og IL-6. På den annen side, CP gel betydelig (p < 0.01) økte det SDS-induserte uttrykket av IL-10 og TGF-beta 1 (figur3B). Disse resultatene tyder på en anti-inflammatorisk effektav CP-gel på HEK-ene.

Figur 3. Antiinflammatorisk effekt av CP-gel i SDS-stimulerte HEK-er. HEK-er ble inkubert samtidig med 0.0015 prosent SDS og CP-gel i 24 timer. Cellekultursupernatantene ble høstet og nivået av inflammatoriske faktorer ble målt med ELISA-sett. Relativ fold økning av pro-inflammatoriske faktorer, IL-1 alfa og IL-6 (A), og antiinflammatoriske faktorer, IL-10 og TGF-beta 1 (B), ble påvist som beskrevet i de eksperimentelle prosedyrene; PBS ble brukt som en kontroll. Alle verdier representerer gjennomsnittet pluss SD fra tre uavhengige eksperimenter. ** p < 0,01 vs. PBS-holdig medium uten CP.# p < 0,01 vs. kun SDS-behandlede HEK-er. HEK, human epidermal keratinocytt; SDS, natriumdodecylsulfat; ELISA, enzymkoblet immunosorbentanalyse; PBS, fosfatbufret saltvann; IL, interleukin.IGF, transformerende vekstfaktor.

2.4. Hudabsorpsjonsegenskaper til CP Gel in vitro

For å evaluere den potensielle kliniske anvendelsen av CP-gel for antialdringsegenskaper, undersøkte vi CP-gelens evne til å bli absorbert i stratum corneum (SC), det ytterste hudlaget, og komme inn i epidermis og dermis. For å adressere dette aspektet ble CP-gel inneholdende 5 ug/ml fluorescein-isotiocyanat (FITC)-merket CP påført topisk på en rekonstruert 3D-hud, keraskin@-FT (Figur 4A). Som vist i figur 4B, etter 1 time med påføring, demonstrerte hudseksjonene behandlet med FlTC-merket CP-holdig gel en betydelig grønn fluorescens gjennom epidermis, sammen med defusert fluorescens i hudvevet, noe som tyder på evnen til CP-gelen kan absorberes inn i SC og blir internalisert i epidermis og dermis. Etter 6 og 24 timer ble en veterinær mer fremtredende grønn fluorescens observert i epidermis og dermis på hudseksjoner behandlet med CP-gel. Derimot ble ingen signifikant fluorescens observert når bare PBS ble påført topisk.

Figur 4. Hudabsorpsjon av CP-gel i in vitro-rekonstruert 3D-hud, keraskin@-FI. (APBS eller CP-gel (inneholder FITC-merket CP) ble påført på stratum corneum av keraskin@-FTB) Fluorescensbilder demonstrerte graden av absorpsjon av CP-gel. PBS (ubehandlet) eller CP-gel som inneholder FITC-merket CP) ble påført lokalt i den angitte varigheten. Frosne deler av hudproblemer ble observert under et fluorescensmikroskop. Målestokk=1 mm

Spør om mer:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp pluss 86 15292862950