Antioksidant- og antialdringspotensialet til en peptidformulering (Gal2–Pep) konjugert med gallisk syre Ⅱ

3. Resultater og diskusjon

3.1. Syntese og konjugering av gallussyre med peptid

De syntetiserte peptidene TPPTTP, galloyl-TPPTTP (Gal-Pep) og Gal2-Pep ble oppnådd og renset ved bruk av semi-preparativ RP-HPLC. Fig. 1a og skjema 1 viser konjugasjonsstrategien for gallussyre med KTPPTTP som Gal2–Pep. I SPPS-metoden inkluderer urenhetene som genereres under peptidsyntese vanligvis sideragerte peptider, aminosyrebeskyttende grupper og løsningsmidler som brukes til syntese og rensing. HOBt som brukes i peptidsyntese er kjent for å hemme racemisering og forbedre effektiviteten av peptidsyntese.17–19 For å fjerne aminosyrebeskyttende grupper og løsningsmidler brukt til syntese, utførte vi vask flere ganger med løsningsmidler som DMF og DCM under peptidsynteseprosessen. Selv etter det siste vasketrinnet er urenheter inkludert aminosyrebeskyttende grupper fortsatt tilstede i spormengder. For å møte peptidrenheten på mer enn 90 prosent rapportert av flere forskere, ble 20–22 semi-prep HPLC utført som et poleringstrinn for å oppnå det endelige peptidet med 99,2 prosent renhet som et resultat av HPLC-analyse (se fig. S1†). Det rensede peptidproduktet ble analysert med Q-TOF for å bekrefte deres vellykkede syntese (fig. 1b-d).

KSL11

Klikk her for å få mer informasjon om Cistanche Treat Anti-Aging

3.2. Cellelevedyktighetsanalyser

For å undersøke cytotoksisiteten til de syntetiserte peptidene, ble HaCaT og humane dermale fibroblastceller behandlet med forskjellige konsentrasjoner av GA, TPPTTP, Gal-Pep og Gal2-Pepi 24 timer og analysert ved hjelp av CCK-8-analyser. Det var confirmed detde syntetiserte peptidene hadde ingen toksisk effektpå de behandlede cellene,med cellelevedyktighet på minst 88 prosent for alle prøver og allekonsentrasjoner testet (fig. 2a og b), som indikerer at TPPTTP,Gal–Pep og Gal2–Pep er egnet for bruk i kosmetikkapplikasjonerkationer. I tillegg var det confirmed av MTT, LDH og Griessreagensanalyse somnalt peptid forårsaket ikke toksisitet i HAog F og innflammatisk respons i rå 264.7. (Fig. S2–S4†).

3.3. Antioksidantaktivitet av syntetiserte peptider

Mekanismene involvert ialdring av hudeninkludereROS aktivitet, mitokondrielle DNA-mutasjoner, forkorting av telomerer og hormonelle endringer, spesielt hos kvinner.23 ROS fungerer som cellesignalmolekyler for mange cellulære prosesser, for eksempel differensieringog spredning.24 Imidlertid kan overdreven ROS føre tilspaltningen og unormal binding av kollagen- og elastinkjederog øke uttrykket av MMP-1, et enzym som brytesned kollagen, og akselererer dermed aldring og celleapoptose. DerFor det er det viktig å fjerne ROS fra hudceller for å fremme anti-aldringeffekter. I denne studien konfirmed antioksidantaktiviteten tilde syntetiserte peptidene gjennom DPPH- og DCF-DA-analyser.Fig. 3a viser resultatene av den radikale fjerningsaktivitetenav de syntetiserte peptidene som målt ved bruk av DPPH-analyse.

TPPTTP hadde ingen radikalfjernende aktivitet ved noen konsentrasjon, mens GA, Gal–Pep og Gal2–Pep viste høyere radikalfjernende aktivitet på en konsentrasjonsavhengig måte.

KSL02

Ispesielt, Gal2–Pep viste den mest effektiveantioksidantaktivitet; ved en konsentrasjon på 10mM, GA, Gal–Pep og Gal2–Pephadde en radikal renseaktivitet på 13,6 prosent , 24,23 prosent og 26.0 prosent ,hhv. Dette indikerer at bindingen av TPPTTP til GA gjør detikke hemme den radikale renseaktiviteten. Fig. 3b confirms denstabilitet av prøvene som konfirmed ved å vurdere deres radikalerensende aktivitet ved lagring ved romtemperatur. GA beholdtdens radikale renseaktivitet i opptil en uke, men afteh to uker, denne aktiviteten gikk ned med mer enn 60 prosent . På den andrehånd, Gal–Pep og Gal2–Pep opprettholdt sin renseaktiviteti over to uker. Spesielt Gal2–Pep hadde et radikalt skavengasjerende aktivitet på 50 prosent selv i sin fjerde uke. Disse resultateneantyder at binding av GA til TPPTTP stabiliserer dens radikale fjerningaktivitet. Noen studier har vist at askorbinsyre er stabilisertved å binde det med peptider.12,25 Vi tror at GA kan være stabilisert ved å binde det med et peptid på samme måte.

Deantioksidanteffekt av peptideneble også testet ved bruk av DCF DA-analyser i nærvær av intracellulært oksidativt stress indusert av H2O2 (fig. 4). Etter 24 timers behandling av prøvene på cellene i en konsentrasjon på 100 mM, ble DCF-DA lastet på cellene, og cellene ble deretter behandlet med H2O2 i 30 minutter og fluorescensintensiteten til DCF ble observert ved en eksitasjon bølgelengde på 485 nm og en emisjonsbølgelengde på 535 nm. Celler utsatt for oksidativt stress med 1 mM H2O2 viste en fluorescensintensitet som var mer enn tre ganger høyere enn den negative kontrollen; Imidlertid ga Gal2–Pep-behandling en fluorescens som bare var 67 prosent av den som ble produsert av celler behandlet med kun H2O2. I nærvær av TPPTTP, som ikke utviste radikal rensende aktivitet (fig. 3a), ble ROS-stresset forårsaket av H2O2 redusert med omtrent 20 prosent, noe som støtter tidligere forskning som har rapportert at TPPTTP reduserer ROS-nivåer i cellene.24 Når cellene ble behandlet med kun GA, var det ingen signifikant endring i ROS-nivåer. Til sammen antyder disse resultatene at Gal2–Pep, som kombinerer to GA-molekyler med et peptid, er en stabil og effektiv antioksidant.

3.4. Effekt av syntetiserte peptider på mitokondriemembranpotensialet

I denne studien ble JC-1-fargestoff brukt til å undersøke effekten av de syntetiserte peptidene på MmP (DJm). MmP fungerer som en viktig parameter for mitokondriell funksjon og er kjent for å være assosiert med flere sykdommer som Alzheimers og Huntingtons sykdom.26 JC-1 fargestoff produserer en rødskjorte fra grønne utslipp ved å akkumulere i mitokondrier og danne J-aggregater. Etter å ha behandlet HaCaT- og fibroblastcellene med de syntetiserte peptidene i 24 timer, ble cellene eksponert for JC-1-fargestoff i 10 minutter, og deretter ble fluorescensintensiteten målt ved hjelp av en mikroplateleser (grønn lEx ¼ 475 nm og lEm ¼ 530 nm, rød lEx ¼ 475 nm og lEm ¼ 590 nm). Forholdet mellom rød og grønn fluorescens ble uttrykt som fold-endringen sammenlignet med den negative kontrollen (fig. 5). HaCaT-celler behandlet med GA og peptidet uavhengig viste ingen signifikant endring sammenlignet med den negative kontrollgruppen, mens Gal2–Pep viste en signifikant forskjell, og økte 1.45- ganger sammenlignet med kontrollen. Fibroblastcellene behandlet med Gal2-Pep også betydelig

økt 1.12-fold sammenlignet med den negative kontrollen. Økningen i MmP med Gal2–Pep-behandling indikerer tydelig at Gal2–Pep er et biomolekyl som kan brukes i antialdringskosmetikk.

cistanche anti-aging

Fig. 4 Intracellulære antioksidantaktivitetsanalyser ved bruk av DCF-DA ved gallussyre- og peptidkonsentrasjoner på 100 mM. Etter 24 timers behandling ble H2O2 tilsatt og inkubert i 30 minutter, etterfulgt av måling av DCF-fluorescensintensitet. Stjerner indikerer statistisk signifikante forskjeller (*p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,001).

cistanche anti-aging

Fig. 5 Måling av mitokondriemembranpotensialet ved bruk av JC-1-fargestoff i (a) HaCaT-celler og (b) dermale fibroblaster. Stjerner indikerer statistisk signifikante forskjeller (*p < 0.05, **p < 0,005, ***p<0.001)

cistanche anti-aging

Fig. 6 Måling av elastaseaktiviteten i dermale fibroblaster ved gallussyre- og peptidkonsentrasjoner på 100 mM. Stjerner indikerer statistisk signifikante forskjeller (*p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.001).

3.5. Elastaseinhiberende aktivitet

Elastase fremmer aldring av huden ved å bryte ned kollagen eller elastin i huden, slik at den kan forhindre aldring av huden ved å hemme elastase.27 Fig. 6 viser elastaseaktivitet i CCD-1064Sk-cellerbehandlet med hver prøve. TPPTTP har en sjelden effektpå elastasehemming. Imidlertid kan behandling med gallussyre, Gal–Pep, ogGal2–Pep viste elastaseaktivitet med 69 prosent, 84 prosent og 76 prosent,hhv. Gal2–Pep hemmet elastase med 7 prosent mindre ennGA. Men når man vurderer resultatene av måling avantioksidant effekt, langsiktig stabilitet og mitokondriemembranpotensial, Gal2–Pep var mer effektivtenn GA som enanti-aldringsmiddel.

cistanche anti-aging

3.6. Uttrykk av type I kollagen, MMP-1 og PGC-1a gener

Fig. 7 viser RT-qPCR-data for type I kollagen, MMP-1 og PGC-1et genuttrykk. Type I kollagen, en hovedkomponent av kollagenfamilien som finnes i huden, avtar etter hvert som aldringutvikler seg.28 Når Gal2–Pep ble brukt til å behandlefibroblaster for8 timer og 24 timer økte uttrykket av type I kollagenca. henholdsvis 1.19- og 1.21-fold. Med GA ogGal–Pep, det var ingen nevneverdigendre after 2 timer og 8 timer, mentype I kollagenekspresjon økte 1.16- og 1.26-fold etter 24h, henholdsvis. Med TTPTTP behandling, derimot, uttrykkøkt med 1.24-fold ififørste 2 timer og deretter gradvisredusert. ENfter 24 timer, var uttrykksnivået likt det forden negative kontrollen (fig. 7a). For MMP-1, uttrykksnivåer på{{0}}.43, 0.44 og 0.68-fold ble observert enfter 24 timer med GA, Gal–Pep og Gal2–Pep-behandling, henholdsvis. i tilleggekspresjonsnivåer med GA-behandling økte med 1.46- ganger etter 2h. Med TPPTTP ble MMP{{0}}-uttrykket redusert 0.87-fold etter 2h, men ble senere lik den negativekontroll. Samlet gjenopprette kollagennivåer, som ellersreduseres med aldring, bidrar til å forbedre rynker.28

cistanche anti-aging

Fig. 7 Genekspresjonsanalyse i dermale fibroblaster ved bruk av RT-qPCR: (a) type I kollagen, (b) MMP-1 og (c) PGC-1a.

Uttrykket av PGC-1a var høyest etter 8 timer for alle behandlinger, med ekspresjonshastigheter for GA, TPPTTP, Gal–Pep og Gal2–Pep økende 2.06-, 1.{{6} }, henholdsvis 1.07- og 2.05-fold. Imidlertid, i motsetning til de andre behandlingene, økte Gal2–Pep PGC-1et uttrykk 1.27-fold etter 24 timer. PGC-1aregulerer syntesen og antioksidanteffektene av mitokondrierog rapporteres tilreduseres med aldring.29–32 Derfor har Gal2–Pep potensial til å bli brukt som en effektiv antioksidant som effektivt kan beskytte mot ROS.

Alt sammen økte Gal2–Pep uttrykket av PGC-1a og kollagen sammenlignet med effekten av GA og TPPTTP alene, mensuttrykk for MMP-1 hadde en tendens til å reduseres, og illustrerer dermed potensialet for bruk iantialdringskosmetikk.

KSL26

4. Konklusjon

I denne studien viste Gal2–Pep, som ble utviklet ved å kombinere GA og peptidet TPPTTP, utmerketantioksidant aktivitetog mitokondriell aktivering i hudceller. Cellelevedyktighetsresultatene indikerte tydelig at Gal2–Pep ikke har noen cytotoksisk effekt på hudceller. Gal2-Pep viste også doseavhengig antioksidant- og frie radikaler-fjernende aktivitet,med ROS-renseaktivitet over 50 prosent selv etterr lagring forfire uker i romtemperatur. Det påvirket også positivt MmP og økte uttrykket av PGC-1a, hvilkenregulerer mitokondriesyntesen og har en antioksidant f.eksffectved å eliminere frie radikaler i huden. Gal2–Pep ogsåøkte uttrykket av type I kollagen og redusert elastaseaktivitet og uttrykket til MMP-1, som beviser at det holderløfte for bruk i anti-aldringskosmetikk.

Interessekonflikter

Det er ingen konflikter å erklære.

Anerkjennelser

Denne studien ble støttet av et stipend fra Korea Industrial Complex Corp. (KICOX, NTIS nr. 1415165722) og Inha University Research Grant.

Referanser

1 P. Brenneisen, H. Sies og K. Scharfffetter-Kochanek, Ann. NY Acad. Sci., 2002, 973, 31–43.

2 A. Trifunovic, A. Wredenberg, M. Falkenberg, JN Spelbrink, AT Rovio, CE Bruder, M. Bohlooly-Y, S. Gldl¨of, A. Oldfors,R. Wibom, J. T¨ornell, HT Jacobs og NG Larsson,

Nature, 2004, 429, 417–423.

3 SB Khan, CS Kong, JA Kim og SK Kim, Biotechnol. Bioprocess Eng., 2010, 15, 191–198.

4 H.-J. Kim, K.-W. Kim, B.-P. Yu og H.-Y. Chung, fri radikal biol. Med., 2000, 28, 683–692.

5 M. Erden Inal, A. Kahraman og T. Koken, Clin. Exp.Dermatol., 2001, 26, 536–539.

6 HS Jin, SY Park, JY Kim, JE Lee, HS Lee, NJ Kang og DW Lee, Biotechnol. Bioprocess Eng., 2019, 24, 240–249.

7 H. Masaki, J. Dermatol. Sci., 2010, 58, 85–90.

8 TSA Thring, P. Hili og DP Naughton, BMC komplementær alternativ. Med., 2009, 9, 27.

9 L. Quiles-Carrillo, S. Montava-Jord a, T. Boronat, C. Sammon, R. Balart og S. Torres-Giner, Polymers, 2019, 12, 31. 10 DH Park, DH Jung, SJ Kim, SH Kim og KM Park,

BMC Biochem., 2014, 15, 4–10.

11 YJ Cheng, GF Luo, JY Zhu, XD Xu, X. Zeng, DB Cheng, YM Li, Y. Wu, XZ Zhang, RX Zhuo og F. He, ACS Appl. Mater. Grensesnitt, 2015, 7, 9078–9087.

12 H. Lee, ATE Vilian, JY Kim, MH Chun, JS Suh, HH Seo, SH Cho, IS Shin, SJ Kim, SH Park, Y.-K. Han, JH Lee og YS Huh, RSC Adv., 2017, (48), 30205–30213.

13 Y. Kong, C. Xu, ZL He, QM Zhou, J. Bin Wang, ZY Li og X. Ming, Peptides, 2014, 53, 70–78.

14 H. Kim, JS Kim, YG Kim, Y. Jeong, JE Kim, NS Paek og CH Kang, Biotechnol. Bioprocess Eng., 2020, 25, 421–430.

15 MA Frezzini, F. Castellani, N. De Francesco, M. Ristorini og S. Canepari, Atmosphere, 2019, 10(12), DOI: 10.3390/atmos10120816.

16 A. Rengaraj, P. Puthiaraj, NS Heo, H. Lee, SK Hwang,S. Kwon, WS Ahn og YS Huh, Colloids Surf., B, 2017,160, 1–10.

17 T. Miyazawa, T. Otomatsu, Y. Fukui, T. Yamada og S. Kuwata, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1988, 419–420.

18 SM Mali, M. Ganesh Kumar, MM Katariya og HN Gopi, Org. Biomol. Chem., 2014, 12, 8462-8472. 19 T. Michels, R. D ¨olling, U. Haberkorn og W. Mier, Org. Lett., 2012, 14, 5218–5221.

20 P. Song, W. Du, W. Li, L. Zhu, W. Zhang, X. Gao, Y. Tao og F. Ge, Nanomater. Nanoteknologi, 2020, 10, 1–10.

21 M. De Zotti, B. Biondi, Y. Park, K.-S. Hahm, M. Crisma, C. Toniolo og F. Formaggio, Amino Acids, 2012, 43, 1761–1777.

22 Z. Zhai, K. Xu, L. Mei, C. Wu, J. Liu, Z. Liu, L. Wan og W. Zhong, So Matter, 2019, 15, 8603–{{4 }}.

23 DJ Tobin, J. Tissue Viability, 2017, 26, 37–46.

24 M. Schieber og NS Chandel, Curr. Biol., 2014, 24, 453–462.