Antioksidant og anti-melanogene aktiviteter av varmebehandlet lakris (Wongam, Glycyrrhiza Glabra × G. Uralensis) ekstrakt
Mar 26, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Min Hye Kang 1,2, Gwi Yeong Jang 1, Yun-Jeong Ji 1, Jeong Hoon Lee 1, Su Ji Choi 1, Tae Kyung Hyun 2,* og Hyung Don Kim 1,*
Abstrakt:Melanin er et brunt eller svart pigment som beskytter huden mot ultrafiolett stråling og aktive oksygenarter (ROS). Imidlertid er overproduksjon av melanin assosiert med lentiginer, melasma, fregner og hudkreft.Lakrishar vistantioksidant, anti-tumor, anti-blodplate, anti-inflammatorisk og immunmodulerende aktiviteter og brukes som en naturlig behandling for hudbleking.Vi hadde som mål å bekrefte potensialet til Wongam, en ny kultivar av lakris utviklet av RuralDevelopment Administration (RDA), som enblekingagent innen kosmetikk. I tillegg bekreftet vi effekten av varmebehandling på bioaktiviteten til lakris ved å sammenligneantioksidantoganti-melanogentaktiviteter av lakrisekstrakt før og etter oppvarming (130 ◦C). Det varmebehandlede lakrisekstraktet (WH-130) viste høyere radikalfjernende aktiviteter i ABTS pluss (2,20-azino-bis-(3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre syre) diammoniumsalt) og DPPH (2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl)-analyser. I tillegg hemmet WH-130 melanogenese mer effektivt på grunn av nedreguleringen av tyrosinase i B16F10-melanomceller enn ikke-oppvarmedelakrisekstrakt. Dessuten økte varmebehandling det totale fenolinnholdet. Spesielt isoliquiritigenin, enantioksidantoganti-melanogentsammensetning av lakris, ble produsert ved varmebehandling. Avslutningsvis har WH-130, med økte nivåer av bioaktive fenoler som isoliquiritigenin, potensial for utvikling til en ny hudblekingmateriale med bruksområder i kosmetikk.
Nøkkelord: anti-melanogentaktivitet; varmebehandling;lakris; murine melanomceller (B16F10)
1. Introduksjon
Lakris(Glycyrrhiza-arter), en flerårig urt med medisinsk bruk i familien Leguminosae, er vidt distribuert over Sentral-Asia, Kina, Russland, Manchuria, Mongolia og Europa [1]. Det har lenge vært brukt som et smaks- og søtningsmiddel. Lakrisets tørrrot og stolon har blitt brukt til behandling av forkjølelse, hoste, astma, tretthet og luftveisinfeksjoner på grunn av lakrisens biologiske aktivitet, inkludertantioksidant,antimikrobielle, anti-tumor, anti-blodplate, anti-inflammatoriske og immunmodulerende aktiviteter [2,3]. Slekten Glycyrrhiza består av rundt 22 lakrisarter, inkludert G. uralensisFisch, G. glabra L. og G. inflata Batal.
Wongam, en ny interspesifikk hybridkultivar av lakris, ble utviklet av RuralDevelopment Administration som en hybrid av Glycyrrhiza glabra x G. uralensis (G. korshinskiGrig). Wongam har høyere utbytte og bedre sykdomsresistens enn G. uralensis. Tallrike studier har blitt utført på de biologiske aktivitetene til G. uralensis, mens eksisterende forskning på Wongam, en ny kultivar, er begrenset til dens anti-allergiske, immunmodulerende og anti-ulcus aktiviteter [1,2]. Derfor er det nødvendig å undersøke den brede bioaktiviteten til Wongam.
De viktigste bioaktive komponentene ilakrisroten er flavonoider og triterpen saponiner, inkludert liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritigenin (ISL) og glycyrrhizin (eller glycyrrhizicacid) [4,5]. ISL er et flavonoid som finnes i lakris som har vist ulike farmasøytiske aktiviteter, inkludert anti-blodplate, anti-allergisk, anti-tumor, anti-inflammatorisk ogantioksidantaktiviteter [6–8]. ISL er et hydrolyseprodukt fra isoliquiritin i lakrisrot. Det kan hemme melanogenese gjennom nedbrytning av mikroftalmiassosiert transkripsjonsfaktor (MITF) ved aktivering av den ekstracellulære signalregulerte proteinkinase (ERK) signalveien. Følgelig undertrykte MITF-nedbrytning ekspresjonen av tyrosinase(TYR) og tyrosinase-relaterte proteiner (TRP-1 og TRP-2) gener i SK-MEL-2 celler [9,10].ISL kan hemme mono- og difenolaseaktivitetene til sopp TYR samt themelanogenese i melanocytter [11].
Melanin, et hovedpigment som gir hudfarge, syntetiseres i epidermale melanocytter og lagres i intracellulære organeller kalt melanosomer [12]. Melaninpigmenter består av to typer: brunt eller svart eumelanin og rødt eller gult feomelanin [12]. Melanogenese kan induseres av ytre stimuli, inkludert ultrafiolett (UV) stråling, reaktive oksygenarter (ROS) og kjemikalier som -melanocyttstimulerende hormon (-MSH) andisobutylmethylxanthine (IBMX), som øker nivåene av syklisk adenosinmonofosfat (cAMP). Melanin beskytter huden mot disse stimuli, mens overproduksjonen forårsaker hudhyperpigmentering, som kan føre til sykdommer som hudkreft [13–17]. Hudblekingmidler som kojinsyre, hydrokinon, arbutin og askorbinsyre, som er TYR-hemmere, har blitt brukt til å behandle hyperpigmentering i flere kosmetiske produkter [13,18]. Melanogenese er regulert gjennom en rekke signalveier, og disse signalene er knyttet til oppreguleringen av MITF. Aktivering av MITF fremmer uttrykket av TYR og TRP (TRP-1, TRP-2). Deretter katalyserer TYR oksidasjonen av L-tyrosin til 3,4-dihydroksy-L-fenylalanin (L-DOPA), som deretter oksideres til DOPAkinon. TRP-2 konverterer dopakrom til 5,6-dihydroksyindol-2-karboksylsyre (DHICA) eller 5,6-dihydroksyindol (DHI). Til slutt blir DHICA og DHI oksidert av TRP-1, noe som resulterer i melanogenese [19].
Termiske prosesser påvirker de fysisk-kjemiske og biologiske egenskapene til planteekstrakter. De ødelegger cellevegger og spalter kovalente bindinger, noe som resulterer i frigjøring av bioaktive forbindelser [20,21]. Varmebehandling av bryggere brukte kornekstrakter over 130 ◦ Øker totalt fenolinnhold (TPC) og totalt flavonoidinnhold (TFC), med tilsvarende økning i antioksidantaktivitet [16,20,21]. Oppvarming av sitrusskall kan føre til frigjøring av fenolforbindelser og økeantioksidantaktivitet [17].
Vårt hovedmål er å bekrefte potensialet til Wongam som en naturlig hudblekingmateriale i kosmetikk. I tillegg er denne studien også ment å bevise om varmebehandling kan forbedre antioksidant- og anti-melanogene aktivitetene tillakris. Vi undersøkteantioksidantaktiviteter, sammen med TPC av Wongam-ekstrakter.Anti-melanogeneffekter av Wongam-ekstrakter ble verifisert av TYR-hemmingsaktivitet og melanininnhold i melanomceller.
Cistanche er en naturlighudbleking urt
2. Materialer og metoder
2.1. Prøveforberedelse
Prøver ble fremstilt i henhold til en tidligere rapportert metode [22].Lakris(Wongam, Glycyrrhiza glabra x G. uralensis, identifisert av Yun Ji Lee fra NIHHS, RDA og registrert i Korea Medicinal Resources Herbarium med kupongnummer MPS006326) ble dyrket og høstet ved Department of Herbal Crop Research (Eumsung, Chungcheongbuk-do, Korea) ) i 2018, og tørket ved 60 ◦C i 20 timer. 10 kglakrisvasket og 1 kg ble malt. Etter blanding ble det oppnådd 3 prøver av henholdsvis WC eller WH. Malt lakris (5 g) ble plassert i en glassbeholder med 1 mL destillert vann og behandlet i en autoklav (Jisico, Seoul, Korea) i 1 time ved 130 ◦C (WH-130). Ubehandlet kontrolllakris (WC) 5 g) og WH-130 ble ekstrahert separat ved bruk av 70 prosent etanol (prøve: løsningsmiddel, 1:50, v:v) i 24 timer ved romtemperatur (RT). Etter filtrering ble ekstraktene fordampet under vakuum, frysetørket og lagret ved -80 ◦C. Alle ekstrakter ble solubilisert i dimetylsulfoksid (DMSO) (Sigma, St. Louis, MO, USA) og metanol (Sigma, St. Louis, MO, USA).
2.2. Bestemmelse av bruning
Bruningsindeksen pålakrisekstrakter (WC og WH-130) ble registrert basert på deres absorbansverdi ved 420 nm (A420) målt ved hjelp av en mikroplateleser (BioTek, Winooski, VT, USA). Høyere verdier av absorbans ved 420 nm tilsvarer en høyere bruningsindeks [23,24].
2.3. Totalt fenolinnhold (TPC)
I henhold til en tidligere rapportert metode [25] ble TPC målt basert på prinsippet om at Folin-Ciocalteus reagens reduseres til en blå kromofor bestående av afosfowolfram-fosfomolybdenkompleks avhengig av alkaliske forhold og konsentrasjonen av fenoliske forbindelser. Hver prøve (10 µL) ble blandet med 2 prosent natriumkarbonat (200 µL) og deretter Folin-Ciocalteus reagens (10 µL). Blandingen ble aktivert i 30 minutter ved romtemperatur. Deretter ble absorbansen målt ved 750 nm ved bruk av en mikroplateleser (BioTek, Winooski, VT, USA). TPC ble beregnet fra standardkurven for gallussyre, og resultatene ble uttrykt som gallussyreekvivalentverdier, mg GAE g−1ekstrakt.
2.4. Bestemmelse av antioksidantkapasitet
Den radikalfjernende aktiviteten ble målt ved å bruke 2,20-azino-bis-(3-etylbenzotiazolin6-sulfonsyre) diammoniumsalt (ABTS) i henhold til en tidligere beskrevet metode med liten modifikasjon [19, 26]. ABTS radikalkationløsning ble produsert ved å blande 2,6 mM kaliumpersulfat og 7,4 mM ABTS og la dem reagere i 24 timer ved RT. ABTS-løsningen ble deretter fortynnet med destillert vann for å justere absorbansen til området 1.000–1.500. Deretter ble 20 µL av prøven reagert med 180 µL ABTS pluss-løsning, beskyttet mot lys, og blandingen av prøve og løsning ble inkubert i 30 minutter ved RT. Absorbansen ble målt ved bruk av en mikroplate-leser (BioTek, Winooski, VT, USA) ved 735 nm. Fra en Trolox-standardkurve, Trolox-ekvivalentenantioksidantkapasitet (TEAC) ble beregnet og uttrykt i mg trolox-ekvivalent (TE) per g tørr prøve.
2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radikalløsning ble fremstilt ved å løse opp0.2 mM DPPH i 99 prosent etanol. DPPH-løsning ble fortynnet med destillert vann til anabsorbans ved 520 nm på 1000–1500. Deretter ble 50 µL av prøven blandet med 200 µL DPPH-løsning og reagert i 30 minutter ved romtemperatur. Etter reaksjonen ble absorbansen til blandingen bestemt ved 520 nm. Fra Trolox-standardkurven ble TEAC beregnet og uttrykt i mg TE per g tørr prøve.
2.5. Høyytelses væskekromatografi (HPLC) analyse
En modifisert HPLC-metode ble brukt [22]. ISL-innholdet ilakrisekstrakter ble analysert ved HPLC med en UV-synlig detektor (HPLC: 1200-serien, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA; kolonne: SynergiTM, 250 × 4,6 mm, 4 µm, Fusion-RP 8{{40}} Å, Phenomenex, Torrance, CA, USA). Den mobile fasen besto av løsningsmiddel A (0,1 prosent maursyre i vann) og løsningsmiddel B (0,1 prosent maursyre i acetonitril). Gradientprogrammet for den mobile fasen ble operert under følgende gradient: 0–8 min (20–20 prosent B), 8–30 min (20–38 prosent B), 30–42 min (38–50 prosent) B), 42–47 min (50–90 prosent B), 47–53 min (90–90 prosent B), 53–54 min (90–20 prosent B) og 54–60 min (20–20 prosent B) . Strømningshastigheten, deteksjonsbølgelengden og injeksjonsvolumet ble satt til henholdsvis 1,0 mL/min, 360 nm og 10 μL. ISL-standardløsningene ble analysert med fire forskjellige konsentrasjoner (0,05, 0,1, 0,2, 0,4 mg/ml). Kalibreringskurven (y=ax plus b) ble brukt til å bestemme innholdet i ISL. I regresjonsligningen refererer x til konsentrasjonen av ISL (mg mL−1) og y betyr topparealet.
2.6. Mushroom Tyrosinase Inhibitory Activity Assay
TYR-hemmende aktivitetsanalysen ble utført ved bruk av et TYR-hemmer-screeningssett (BioVision, Milpitas, CA, USA). Hvert ekstrakt (WC og WH-130) ble oppløst i DMSO til en sluttkonsentrasjon på 250 µg/ml. Kojinsyre, brukt som en positiv kontroll, ble også fortynnet til 250 µg/ml i DMSO. Kort fortalt ble 20 µL ekstrakt eller kojinsyre kombinert med 50 µL TYR-enzymløsning. Etter inkubering ved romtemperatur i 10 minutter ble 30 µL TYR-substratløsning tilsatt til hver brønn. Sluttkonsentrasjonen av ekstraktene og kojinsyren var 50 µg/ml. Den optiske tettheten til brønnene ble deretter målt ved 510 nm i kinetisk modus i 1 time med en mikroplateleser (BioTek, Winooski, VT, USA).
cistanche pulver: antioksidasjon
2.7. Cellekultur
Murine melanom B16F10-celler ble hentet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). B16F10-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10 prosent føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter/ml penicillin og 100 µg/ml streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA) som inneholder en fuktig atmosfære. prosent CO2 ved 37 ◦C.
2.8. Cellelevedyktighetsanalyse
Cytotoksisiteten tillakrisekstrakter (WC og WH-130) til B16F10-celler ble bestemt ved å bruke MTT [3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,{{8 }}difenyltetrazoliumbromid]-analyse.B16F10-celler ble dyrket med 4 × 103 celler/brønn i en 96-brønnplate i 24 timer. Deretter ble ekstrakter tilsatt til cellene i konsentrasjoner på 50, 100 og 200 µg/ml og inkubert ved 37 ◦C i 48 timer. Deretter ble MTT-løsning tilsatt til hver brønn (500 µg/ml), og platen ble inkubert i 1 time ved 37 ◦C. Mediet i hver brønn ble kastet og 100 ul DMSO ble tilsatt. Etter risting i 30 minutter ble absorbansen målt ved 540 nm med en mikroplateleser. Alle tester ble utført i tre eksemplarer.
2.9. Måling av cellulært melanininnhold
Intracellulært melanininnhold ble målt ved å bruke en litt modifisert versjon av metoden tidligere beskrevet [27]. B16F10 melanomceller ble sådd i 6-brønnplater med en tetthet på 8 × 104 celler/brønn og inkubert i 24 timer. Cellene ble eksponert for ekstraktene (WC og WH-130, 100 µg/mL), kojinsyre (100 µg/mL) eller ISL (10 µM, Millipore Sigma, Burlington, MA, USA) i 48 timer i tilstedeværelsen av 100 µM 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX). Etter behandling ble cellene vasket med Dulbeccos fosfatbufret saltvann (DPBS) og oppløst i 200 µL 1 N NaOH i 2 timer ved 90 ◦C. Absorbansen ved 405 nm ble målt ved bruk av en mikroplateleser.
2.10. Cellulær tyrosinaseaktivitetsanalyse
Intracellulær TYR-aktivitet ble målt ved å bruke en litt modifisert versjon av en tidligere beskrevet metode [27]. B16F10 melanomceller (8 × 104 celler/brønn) ble behandlet med ekstraktene (100 µg/ml) eller kojinsyre (100 µg/ml) i nærvær av 100 µM IBMX i 48 timer, samlet og vasket med DPBS. Proteinprøvene ble lysert i 1 prosent TrionX-100 (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) med natriumfosfatbuffer (pH 6,8) og deretter sentrifugert ved 15,000 rpm i 10 minutter. Supernatantfraksjonen ble samlet og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved å bruke bicinchoninsyre (BCA) analysesett (Waltham, MA, USA). En reaksjonsblanding bestående av 30 µg protein (justert til 100 µL med 1 prosent Trion X-100) og 100 µL 10 mM L-DOPA ble tilsatt til hver brønn i en 96-brønnplate. Etter inkubering ved 37 ◦C i 1 time, ble dopakrom overvåket ved å måle absorbansen ved 490 nm ved bruk av en mikroplateleser. TYR-aktivitet ble beregnet med følgende formel:
Tyrosinaseaktivitet ( prosent )=(OD405 av prøve/OD405 av kontroll) × 100
2.11. Sanntids polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)
mRNA-ekspresjonsnivåene til melanogenese-relaterte gener inkludert MITF, TYR,TRP-1 og TRP-2 ble bestemt ved å bruke en modifisert RT-PCR-analyse [28]. Kort fortalt ble B16F10-celler sådd i 6-brønnplater med en tetthet på 8 × 104 celler per brønn og dyrket i 24 timer. Deretter ble cellene behandlet med ekstrakter (100 µg/ml), kojinsyre (100 µg/ml) eller ISL (10 µM) i 48 timer. Totalt RNA ble isolert fra cellene ved bruk av TRIzol-reagens (Ambion, Austin, TX, USA) og deretter ble konsentrasjonen av RNA kvantifisert ved bruk av en mikroplateleser. Etter klargjøring av cDNA (2 µg) ved bruk av Reverse Transcriptase Premix Kit (ElpisBiotech, Daejeon, Korea) i henhold til produsentens protokoller, ble sanntids-PCR utført med MITF, TYR, TRP-1, TRP-2 og -aktinprimere (tabell 1, Bioneer, Daejeon, Korea) med et SYBR Green-sett (ProGEN, Heidelberg, Tyskland) i et CFX96 Real Time PCR-instrument (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Alle data ble normalisert til nivåer av -actinmRNA som et referanse husholdningsgen.
2.12. Fremstilling av cellelysater og Western blot-analyse
B16F10-celler ble sådd i 6-brønnplater med en tetthet på 8 × 104 celler per brønn, inkubert i 24 timer og deretter eksponert for ekstrakter (100 µg/ml), kojinsyre (100 µg/mL) ) eller ISL (10 µM) i 48 timer. Etter vask med DPBS ble cellene høstet og lysert i Triton X-100buffer (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) som inneholdt 1 prosent protease og fosfataseinhibitorcocktail. Proteinkonsentrasjonene til helcellelysater ble målt ved bruk av aBCA-analysesett (Waltham, MA, USA). Like mengder protein (20 µg) ble lastet på 10 prosent natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgeler, som ble kjørt i 4 timer ved 70 V. Deretter ble proteinene overført til en polyvinylidenfluorid (PVDF)-membran. Membranen ble vasket tre ganger med Tris-bufret saltvann [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl] inneholdende 0,1 prosent Tween 20 (TBST) og blokkert med 2 prosent bovint serumalbumin (GenDEPOT) i 1 time. Deretter ble membranene inkubert over natten ved 4 ◦C med de primære antistoffene (fortynning 1:1000) i 4 timer ved romtemperatur. MITF, TYR, TRP-1, TPR-2 og -actin ble påvist med polyklonalt anti-MITF-antistoff fra kanin (Abcam, Cambridge, Storbritannia); geitpolyklonalt anti-TYR-antistoff (Santa Cruz, Dallas, TX, USA); og muse monoklonale antiTRP-1, anti-TRP-2 og anti- -aktin-antistoffer (Santa Cruz, Dallas, TX, USA). Etterpå ble membranene vasket flere ganger med TBST og inkubert med sekundære antistoffer (fortynning 1:2000) i 1 time, nemlig kanin anti-mus IgG, mus antigeit IgG og geit anti-mus IgG (Santa Cruz, Dallas, TX, USA), etterfulgt av flere vaskinger med TBST. Målproteiner ble påvist ved bruk av forbedret kjemiluminescens (ECL) reagens (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) med ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Proteinbåndkvantifisering ble utført ved bruk av ImageJ-programvare (versjon 1.52a for Windows; NIH, Rockville, MD, USA) [28].
2.13. Statistisk analyse Dataene ble analysert med Microsoft Excel 2016 og alle eksperimentelle resultater er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) av tre uavhengige målinger. Elevens t-test med to prøver ble brukt til å vurdere forskjeller mellom kontrollen og prøvene. Enveis variansanalyse (ANOVA) og Duncan-testen ble utført ved bruk av Rsoftware (versjon 3.6.3) for å bestemme betydningen av hver sammenligning kl. nivåer av p < 0.05="" (*),="" p="">< 0,01="" (**)="" og="" p="">< 0,001="" (***).="" korrelasjonsanalyse="" ble="" utført="" ved="" bruk="" av="" prism5.02="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="" ca,="">
3. Resultater
3.1. Browning Index av lakrisekstrakter
Graden av bruning avlakrisekstrakter er vist i figur 1a. Disse resultatene bekreftet at varmebehandlet ekstrakt (WH-130, 0.965 ± 0.025 AU [absorbansenheter]) hadde mye høyere bruningsindeksverdier enn ikke-oppvarmet ekstrakt (WC, 0.758 ± 0.005 AU). Vi forventer at termisk prosessering øker melanoidindannelsen i WH-130 og at denne endringen kan være knyttet til ulike biologiske aktiviteter.
3.2. Totalt fenolinnhold (TPC) av lakrisekstrakter
Figur 1b viser TPC forlakrisekstrakter. Vi fant en forskjell i TPC mellom WC og WH{{0}}, ettersom WC hadde en TPC på 12.093 ± 0,061 mg GAE/g ekstrakt, mens WH-130hadde en TPC på 14,098 ± 0,781 mg GAE/g ekstrakt. Varmebehandling økte TPC av lakrisekstrakter.
3.3. Radikal-rensende aktivitet av lakrisekstrakter
Deantioksidantaktivitet avlakrisekstrakter er presentert i figur 1c,d. ABTS pluss radikalfjernende kapasitet var høyere for WH-130-ekstrakt (6.086 ± 0.304 mg TEAC/geekstrakt) enn WC-ekstrakt (3.542) ± 0,093 mg TEAC/g ekstrakt). I DPPH-analysen ble en lignende tendens observert. WH-130 (7,442 ± 0,292 mg TEAC/g ekstrakt)-ekstrakt viste større DPPH-radikalfjernende aktivitet enn WC-ekstrakt (4,033 ± 0,160 mg TEAC/geekstrakt). Disse resultatene indikerer at oppvarming kan øke antioksidantaktiviteten til ekstrakter.
3.4. Isoliquiritigenin Innhold av lakrisekstrakter
Resultatene viste at ISL-innholdet i WC økte markant etter varmebehandling (tabell 2, figur 2), noe som indikerer at termisk prosessering kan påvirke innholdet av detteantioksidantoganti-melanogentsammensatt.
cistanche tubolosa
3.5. Cellelevedyktighet
Som vist i figur 3,lakrisekstrakter påvirket ikke cellelevedyktighet ved 50 eller 100 µg/ml i forhold til den IBMX-behandlede kontrollen. I 50 og 100 µg/mL-behandlingene av alle ekstrakter forble cellelevedyktigheten større enn 100 prosent. Derfor ble ytterligere eksperimenter utført med lakrisekstraktkonsentrasjoner på opptil 100 µg/ml.
3.6. Effekter av lakrisekstrakter på melaninproduksjon i B16F10 melanomceller
Pigmenteringen og melanininnholdet i B16F10-celler er vist i figur 4a,b. Melanininnholdet i B16F10-celler økte opptil 3.4- ganger med IBMX-behandling i forhold til den ubehandlede kontrollen. WC og WH-130 viste signifikant redusert pigmentering og melanininnhold sammenlignet med den IBMX-behandlede gruppen (Figur 4a,b). Både WC og WH{{10}} viste lavere melanininnhold enn KA-behandlede celler. Den hemmende effekten av melaninsyntese i B16F10-celler behandlet med WH-130 var større enn WC. Mengdene av melanin som var tilstede etter behandling med 100 µg/mL WC og WH-130 ble redusert til henholdsvis ca. 0.59- ganger og 0.51- ganger av nivået i de IBMX-behandlede group.ISL (10 µM) og KA (100 µg/mL) undertrykte melaninproduksjonen til 0.59- ganger og 0.67- ganger, henholdsvis av nivået i IBMX-behandlede celler.
Dette resultatet viser at varmebehandletlakrisekstrakt (WH-130) kan hemme melaninproduksjonen mer effektivt enn ikke-oppvarmet ekstrakt (WC). Dessuten observerte vi at behandling med WH-130-ekstrakt ved 25, 50 og 100 µg/mL (Figur 4c) resulterte i en konsentrasjonsavhengig reduksjon i melanininnholdet i B16F10 melanomceller. Sammen viser disse resultatene at oppvarming forbedretanti-melanogentaktiviteten til lakrisekstrakt.
3.7. Effekter av lakrisekstrakter på tyrosinaseaktivitet
3.7.1. Sopp-tyrosinase-aktivitet
Virkningen avlakrisekstrakter på sopp-TYR-aktivitet er vist i figur 5a. Vi bekreftet at effekten av ekstraktene (WC og WH-130) på oksidasjonen av substrater av sopp-TYR skjedde under cellefrie forhold. Ved 50 µg/mL hemmet WC-ekstrakt enzymaktiviteten til 81,33 prosent, mens WH-130 undertrykte TYR-aktiviteten til 65,95 prosent av EC-nivået. I mellomtiden forårsaket kojinsyre (KA), en TYR-hemmer, hemming av enzymaktivitet til 47,09 prosent av EC-nivået. Hemmingen av TYR-aktivitet var større i varmebehandlet lakris (WH-130) enn i ikke-oppvarmet lakris (WC).
3.7.2. Cellulær tyrosinaseaktivitet
Som vist i figur 5b, økte TYR-aktiviteten til IBMX-behandlede celler til 233 prosent i forhold til den ubehandlede kontrollen (100 prosent). WC reduserte TYR-aktiviteten til 82,17 prosent sammenlignet med den IBMX-behandlede gruppen. WH-130-ekstrakt hemmet cellulær TYR-aktivitet til 59,88 prosent sammenlignet med IBMX-behandlede celler. KA reduserte cellulær TYR-aktivitet til 74,07 prosent av nivået i IBMX-behandlede celler. Sammen viser disse resultatene at lakrisekstrakter (WC og WH-130) undertrykker TYR-aktivitet og at WH-130 har mer potent TYR-hemmende aktivitet enn WC og KA.
Deretter undersøkte vi korrelasjonene mellom TPC, ISL-innhold,antioksidantaktivitet og anti-melanogen aktivitet (tabell 3). TPC var positivt korrelert med ISL-innhold (0.827), så vel som med ABTS plus og DPPH radikalfjernende aktiviteter (henholdsvis 0.886 og 0.896), mens TPC var omvendt korrelert med melanininnhold (–0.859). ISL-innholdet var positivt korrelert med ABTS pluss og DPPH-radikalfjernende aktiviteter (henholdsvis 0.977 og 0.985), mens ISL-innhold var omvendt korrelert med TYRactivity (–0. 834) og melanininnhold (–0.995). Antioksidantaktiviteter (ABTS pluss og DPPH) var omvendt korrelert med TYR-aktivitet (henholdsvis –{{20}}.879 og –0.856) og melanininnhold (–0. 974 og –0,984, henholdsvis). Disse resultatene indikerer at fenoliske forbindelser som ISL i lakris er nært forbundet med antioksidanten oganti-melanogentaktiviteter av lakrisekstrakter.
3.8. Effekter av lakrisekstrakter på mRNA-ekspresjon av melanogenese-relaterte gener
Vi undersøkte uttrykket av melanogenese-relaterte gener i B16F10-celler for å belyse effekten av lakrisekstrakter på melanogenese. Både WC og WH-130 undertrykte mRNA-ekspresjonen til MITF, TYR, TRP-1 og TRP-2 (Figur 6). WC hemmet mRNA-ekspresjonen av MITF, TYR, TRP-1 og TRP-2 til nivåene 0.{{10}}fold, 0.{ {12}}fold, 0.71-fold henholdsvis 0.65-fold av de i IBMX-behandlede celler. WH-130 hemmet mRNA-uttrykket av MITF, TYR, TRP-1 og TRP{{20}} til 0.43-fold, {{33 }}.60-fold, henholdsvis 0.62-fold og 0.49-fold av de IBMX-behandlede gruppenivåene. WH{{30}}-ekstrakt hadde en sterkere hemmende effekt på mRNA-ekspresjon enn WC-ekstrakt. ISL undertrykte også uttrykket MITF, TYR, TRP-1 og TRP-2 (0.42-fold, 0.59-fold, 0.68-fold og henholdsvis 0.44-fold i forhold til IBMX-behandlede celler). I den WH-130-behandlede gruppen var omfanget av reduksjonen i mRNA-ekspresjon av melanogenese-relaterte gener større enn i den WC-behandlede gruppen, noe som indikerer atlakrisekstrakter hemmer melanogenese via undertrykkelse av transkripsjonen av melanogenese-relaterte gener og at varmebehandling forbedreranti-melanogentaktiviteten til lakrisekstrakt.
3.9. Effekter av lakrisekstrakter på proteinuttrykk av melanogenese-relaterte gener
Som vist i figur 7b, reduserte behandling med WC og WH-130 signifikant proteinekspresjonsnivåene til MITF, TYR, TRP-1 og TRP-2. Ekspresjonsnivåer av MITF, TYR,TRP-1 og TRP-2 ble undertrykt i celler behandlet med WC (0.79-fold, 0.{{9 }}fold, henholdsvis {{10}}.89-fold og 0.67-fold i forhold til IBMX-behandlede celler). WH-130 viste reduserte proteinuttrykksnivåer av MITF, TYR, TRP-1 og TRP-2 ({{20}}.74-fold, {{24 }}.73-fold, henholdsvis 0.80-fold og {{30}}.48-fold i forhold til IBMX-behandlede celler) . ISL reduserte proteinekspresjonsnivåene til MITF, TYR og TRP-2 (henholdsvis 0.76-fold, 0.83-fold og 0.41-fold i forhold til IBMX-behandlet celler). WH-130 undertrykte proteinuttrykket av melanogenese-relaterte gener sterkere enn WC, og viste atlakrisekstrakter hemmer melanogenese via undertrykkelse av translasjonen av melanogenese-relaterte gener og at varmebehandling forbedreranti-melanogentaktiviteten til lakrisekstrakt.
hudbleking cistanche pulver
4. Diskusjon
Resultatene av denne studien viser at varmebehandling avlakrispåvirker TPC, antioksidantaktivitet, oganti-melanogentaktivitet. WH-130 hadde en høyere bruningsindeks og TPC-verdier enn WC. Behandlingsforhold, inkludert temperatur og trykk, påvirker bestanddelene i prøvene. [29]. Oppvarming kan fremme Maillard-reaksjoner, som er knyttet til melanoidinproduksjon [23]. Melanoidiner har noen biologiske effekter, inkludertantioksidant, antitumor og antihypertensive aktiviteter, samt blodsukkermodulering [30]. Disse forbindelsene er polymere brunfargede makromolekyler dannet gjennom Maillard-reaksjonen fra interaksjoner mellom sukker og aminosyrer ved høye temperaturer [21]. Jo flere melanoidiner i oppvarmet ekstrakt, jo høyere bruningsindeks. Fargen på ikke-oppvarmet lakrisekstrakt (WC) viste lysebrun, men fargen ble gradvis mørkere med høy temperatur (130 grader). Oppvarmingsprosessen kan også indusere noen endringer i de kjemiske strukturene til fenoliske forbindelser og forårsake bryte ned celleveggene til planter, frigjøre fenoler, noe som fører til antioksidantaktiviteter [31]. Dermed kan fenolinnholdet i lakrisekstrakter øke ved varmebehandling [21]. Tidligere rapporter viste at varmebehandling av honning økte melanoidindannelsen, og graden av brunfarging falt sammen med økningen i antioksidantaktivitet [24]. Derfor viste WH-130 høyere antioksidantkapasitet enn WC i ABTS plus og DPPH radikalfjernende analyser, som har blitt mye brukt for å bestemme antiradikale aktiviteter til prøver basert på kapasiteten til å overføre elektroner eller hydrogenatomer [32].
Den vanligste naturligeantioksidantog anti-melanogene forbindelser er fenoler. Tricin og 9-hydroksyoktadekadiensyre ble identifisert som hovedfenolen i Sorghum bicolor. I tillegg viste disse komponentene antioksidant- og anti-melanogene effekter ved inhibering av tyrosinaseaktivitet [19]. I tillegg har p-kumarsyre, en aktiv forbindelse av Sasa quelpaertensis Nakai, blitt bevist at denne forbindelsen sterkt hemmet tyrosinaseaktivitet og reduserte melaninproduksjonen i melanomceller [27]. I følge tidligere forskning viser ISL, en velkjent flavonoidforbindelse i hydrolyseproduktet av lakrisrot [6–8], antioksidant- og anti-melanogene aktiviteter ved hemming av TYR-aktivitet, melanosomtransport og induksjon av melanin-nedbrytning [10,31] Så vi fokuserte på ISL-innholdet i ekstraktene og ISLs handling i melanogenese-relaterte mekanismer. ISL brukes som et terapeutisk middel for mange sykdommer på grunn av dets mange biologiske aktiviteter, inkludert antiinflammatoriske, antimikrobielle, antioksidative, anti-kreft, immunregulerende, leverbeskyttende og kardiobeskyttende effekter [33]. I denne studien ble høyere ISL-innhold målt i WH-130 enn i WC. Hudhyperpigmentering er relatert til oksidativt stress. Frie radikaler har blitt rapportert å spille viktige roller i å undertrykke hyperpigmentering [17,34]. Sammen viser disse resultatene at varmebehandling av lakris kan forbedre dens radikalfjernende aktiviteter oganti-melanogentaktiviteter via økende nivåer av antioksidantfenoliske forbindelser som ISL. I følge tidligere litteratur er det glabrene, glabridin, glabrol, liquiritigenin i lakris (Glycyrrhiza uralensis, G. glabra), som viser tyrosinaseinhibering. Så disse forbindelsene kan også ha en innvirkning på anti-melanogene aktiviteter [10,11,15,35]. Ytterligere studier på dem er viktige for å belyse de anti-melanogene effektene av lakris.
Melaninsyntese reguleres av TYR, TRP-1, TRP-2 (dopakrom tautomerase) og MITF (figur 8). TYR, et kobberholdig glykoprotein, fungerer som det hastighetsbegrensende enzymet og spiller en avgjørende rolle i melaninproduksjonen. TYR katalyserer hydroksyleringen av tyrosin til 3,4-dihydroksyfenylalanin (DOPA). TYR katalyserer også oksidasjonen av DOPA til dopakinon og omdannelsen av dopakinon til dopakrom. Deretter omdannes dopakrom til dihydro-indolizin (DHI) eller indol 5,6-kinon-2-karboksylsyre (DHICA) [36–38]. I denne banen katalyserer TRP-2 konverteringen av dopakrom til DHICA, som oksideres av TRP-1 for å danne eumelanin. MITF er en spesifikk transkripsjonsfaktor som spiller en kritisk rolle i melanogenese som hovedregulatoren av TYR, TRP-1 og TRP-2 uttrykk (figur 8) [28,37]. Den kjemiske induseren av melanogenese er 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX), som øker TYR-aktiviteten gjennom cAMP-signalveien [13]. IBMX øker den intracellulære cAMP-konsentrasjonen ved å hemme cAMP-fosfodiesterase. Økningen i cAMP-nivåer aktiverer proteinkinase A (PKA) og aktivert PKA forbedrer aktiviteten og uttrykket av cAMP-relatert bindingsprotein (CREB) [39]. CREB binder seg til MITF-promotoren, noe som fører til oppregulering av MITF-genuttrykk. Aktivering av MITF fremmer uttrykket av TYR og TRPer [13,19]. Derfor resulterer nedregulering av MITF i hypopigmentering.
Oppvarmet lakrisekstrakt (WH-130) hemmet sopp-TYR og cellulær TYR-aktivitet mer effektivt enn ikke-oppvarmet lakrisekstrakt (WC). Hemming av cellulær TYRaktivitet i lakrisekstrakter kan være forårsaket av nedregulering av TYR. Disse resultatene er knyttet til melanininnholdet i B16F10 melanomceller. I B16F10-celler undertrykte WH-130-behandling IBMX-indusert melaninproduksjon bedre enn WC-behandling. Dessuten nedregulerte WH 130 transkripsjonen og translasjonen av melanogenese-relaterte markører (MITF, TYR, TRP-1, TRP-2) i B16F10-celler i større grad enn WC. Disse markørene kan til sammen bidra til det totaleanti-melanogentaktivitet [40].
Oppvarmingen avlakrisekstrakt økte mengden av antioksidantfenoliske forbindelser som ISL, og denne økningen var knyttet til øktantioksidantaktiviteter (ABTS plus og DPPH). Oppvarmet lakrisekstrakt (WH-130) viste også økt hemmende aktivitet av TYR og redusert melaninsyntese. Det er en ny trend i utviklingen av naturlige materialer på grunn av potensialet for sikkerhet. Lakris har blitt brukt i kosmetiske kremer for hyperpigmentering [41]. Vi demonstrerte potensialet til Wongam som en nyhudblekingagent for bruk i kosmetikk og verifisert at varmebehandling kan forbedre potensialet.
Glycyrrhiza uralensis Fischer (lakris) har antioksidant- og UV-fotobeskyttende aktiviteter i humane dermale fibroblaster [22]. Imidlertid må studier av sammenligning mellom Wongam (lakris) og andre innfødte arter utføres etterpå. I tillegg bør ytterligere studier på de uidentifiserte komponentene, slik som glabrene, glabridin, av Wongam assosiert med dets anti-melanogene effekt utføres ved bruk av egnede metoder. Det er nødvendig å undersøke de synergistiske eller antagonistiske effektene blant fenoliske forbindelser etter analyse av bestanddeler i lakrisekstrakt [40]. For å undersøke hvordan disse stoffene virker påantioksidantog anti-melanogene mekanismer, hydrogenatomoverføring eller enkeltelektronoverføringssystemer og mitogenaktiverte proteinkinase-signalveier bør evalueres [32,37].
5. Konklusjoner
I denne studien undersøkte vi potensialet til ekstrakter av Wongam, en ny kultivar avlakris, som enblekingmiddel for bruk i kosmetikk og effekten av varmebehandling på deres bioaktivitet. Wongam-ekstrakter (WC og WH-130) viste høye radikalfjernende aktiviteter og hemmet melaninsyntese i IBMX-induserte melanocytter ved å undertrykke aktiviteten til TYR. Varmebehandling økteantioksidantog anti-melanogene aktiviteter av Wongam. Som et resultat viste WH-130 overlegen antioksidativ oganti-melanogentaktiviteter enn WC. Resultatene våre tyder på at varmebehandlet Wongam-ekstrakt (WH-130) er et kraftig pigmentreduserende middel med mulige anvendelser ved ulike dermatologiske hyperpigmenteringsforstyrrelser, inkludert brune flekker, fregner og melasma, og viser at termisk prosessering kan brukes til å forbedre anti-melanogen aktivitet av lakris.
cistanche tubolosa fordeler: hudbleking