Antioksidant, anti-inflammatorisk og antialdringspotensiale til en Kalmia Angustifolia-ekstrakt og identifisering av noen hovedforbindelser Del 1
May 25, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon
Abstrakt:Aldring av huden er det mest synlige elementet i aldringsprosessen, noe som gir opphav til en stor bekymring for mange mennesker. Planter fra Ericaceae-familien har generelt antioksidant- og anti-inflammatoriske egenskaper, noe som gjør dem til potensielle antialdringsaktive ingredienser. Denne studien hadde som mål å evaluere sikkerheten og antialdringseffekten til et Kalmia angustifolia-ekstrakt ved å bruke rekonstruerte huderstatninger. Sikkerhetsevalueringen ble utført ved bruk av en 3-(4,5-dimetyltiazolyl-2)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT)-analyse, mens effekten var bestemt ved å vurdere antioksidant og antiinflammatorisk aktivitet og analysere huderstatninger rekonstruert i henhold til selvmonteringsmetoden ved histologi og immunfluorescensfarging (elastin, kollagen-1, kollagen-3, aquaporin-3) . Cellelevedyktighetsanalysen etablerte sikkerheten til ekstraktet ved en konsentrasjon på opptil 200 ug/mL. Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC)-analysen og en cellebasert analyse med 2',7'-diklorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) avslørte en sterk antioksidantaktivitet med en ORAC-verdi på 16 μmol Trolox-ekvivalent/mg og en halv- maksimal hemmende konsentrasjon (IC50) på 0,37±0,02 ug/mL, mens en interessant antiinflammatorisk aktivitet ble funnet i hemming av NO-produksjon, med en hemmingsprosent av NO-produksjon på 49±2 prosent ved 80 ug/ml. Isoleringen og karakteriseringen av ekstraktet tillot identifikasjon av forbindelser som kunne være ansvarlige for disse biologiske aktivitetene, med to av dem som ble identifisert for første gang i K.cistanche stammeAngustifolia: avicularia og epicatechin-(2 -O-7, 4 -6)-ent-epicatechin. Histologiske analyser av huderstatninger behandlet med ekstraktet viste en økning i dermal tykkelse sammenlignet med kontrollene. K. Angustifolia-ekstrakt forbedret uttrykket av elastin og kollagen-1, som vanligvis reduseres med aldring av huden. Disse resultatene tyder på at K. Angustifolia har lovende antioksidanteffekt og antialdringspotensial.
Nøkkelord: huderstatninger; aldring av huden; naturlige produkter; aktive ingredienser; Sau Laurel; antioksidant aktivitet; anti-inflammatorisk aktivitet; vevsteknikk
1. Introduksjon
Aldring av huden er en naturlig fysiologisk prosess som bekymrer mange mennesker. Det er det første "et synlig tegn på fremgang alder og huddegenerasjon. Dermed er formuleringen av anti-aldring: kosmetiske produkter har fått betydning de siste årene på grunn av ønsket om å begrense dette utseendet til aldring. Hudaldring er preget av flere endringer på et biologisk nivå, som inkluderer en reduksjon i celleproliferasjon, noe som resulterer i epidermal atrofi, og en reduksjon i dermale komponenter som fibroblaster og elastin og kollagenfibre, og dermed en reduksjon i dermal tykkelse hos eldre voksne [1,2] Den boreale skogen er full av uutforskede ressurser med stort potensial for utvikling av kosmetiske aktive ingredienser.Kalmia angustifolia, også kjent som sauelaurbær, er en angiosperm-plante av Ericaceae-familien.cistanche tubulosa fordeler og bivirkningerDenne planten er hjemmehørende i det østlige Nord-Amerika, men finnes hovedsakelig i den kanadiske boreale skogen [3]. I tradisjonell indianermedisin ble K. Angustifolia brukt til å behandle ulike helseproblemer som involverer betennelse, som magesmerter, forstuinger og hevelser, antyder at denne planten har anti-inflammatoriske egenskaper [4]. Ulike planter av Ericaceae-familien har også antiinflammatoriske og antioksidantegenskaper, noe som gjør dem til interessante kosmetiske aktive ingredienser. Den kjemiske sammensetningen av K.angustifolia er ennå ikke godt dokumentert. Noen studier har identifisert giftige forbindelser, som grayanotoksiner, som er nevrotoksiner som er giftige for mennesker ved inntak, men sjelden dødelige, og arbutin(4-hydroksyfenyl-D-glukopyranosid), en tyrosinasehemmer som finnes i bladene til K. Angustifolia og brukes som et depigmenteringsmiddel [5-8]. Til tross for disse potensielt giftige forbindelsene som finnes i K. Angustifolia, har annen forskning også fastslått at flavonoider, fenolsyrer, tanniner og terpener kan finnes i overflod i planten [9-15]. Noen av disse forbindelsene har interessante biologiske aktiviteter og kan derfor gi K. Angustifolia en lovende antialdringseffekt, slik de gjør for andre planter.
Cistanche kan anti-aldring
Selv om det er behov for å utvikle nye dermo-kosmetiske produkter som bidrar til å forhindre aldring av huden, gjør nye lover som forbyr eller begrenser dyreforsøk i kosmetikkindustrien det vanskeligere å gjøre det. Derfor er det nødvendig med andre alternativer for å teste produktets effektivitet. Bruk av in vitro cellekulturer, eller huderstatninger, er et godt alternativ for screening av kosmetiske ingredienser. Flere modeller er godkjent av European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM, Ispra, Italia) og selges kommersielt til kosmetikkfirmaer, for at de skal utføre sikkerhetstester og unngå unødvendig lidelse som følger med bruk av dyr [16,17] . Imidlertid presenterer de fleste kommersielt tilgjengelige modeller bare en differensiert epidermis og mangler interaksjonen mellom keratinocytter og fibroblaster [16]. Nye fulltykkelsesmodeller har dukket opp de siste årene og har blant annet muliggjort undersøkelse av aldringsveier og antialdringsforbindelser, noe som gjør dem til nyttige verktøy for å erstatte dyrebruk innen kosmetikk [18,19].cistanche tubulosa ekstraktMålet med denne studien var først å vurdere den biologiske aktiviteten til et K. Angustifolia-ekstrakt på dyrkede cellemonolag og deretter å evaluere antialdringspotensialet til dette ekstraktet ved å bruke huderstatninger rekonstruert i henhold til selvmonteringsmetoden [20,21] . Styrken til denne huderstatningsmodellen er at den er fri for eksogene materialer og er avhengig av askorbinsyres evne til å fremme produksjonen av ekstracellulær matrise av dermale fibroblaster, noe som gjør modellen helt menneskelig.cistanche tubulosa anmeldelserDenne studien presenterer en ny aktiv ingrediens som kan brukes i dermo-kosmetiske produkter og foreslår bruk av in vitro-modeller som et alternativ i kosmetisk forskning.
2. Materialer og metoder
2.1. Plantemateriale og ekstraktforberedelse
K.angustifolia ble høstet 2. mai015 i Lac-St-Jean-regionen i Quebec, Canada. Planten ble identifisert av M. Patrick Nadeau og et kupongprøve (nr. QFA0617265) ble deponert ved Louis Marie-herbariet ved Laval University, Ouébec, Canada. Luftdeler av K.angustifolia (2,1 kg) ble malt med en Fritsch Pulverisette 25 Cutting Mill (Fritsch, Laval, QC, Canada) og ble ekstrahert under tilbakeløp med vannfri etanol (1,5 L, tre ganger) og EtOH-H2O3:1( 1,5 L, to ganger). Ekstraktene oppnådd etter de første ekstraksjonene (i EtOH og EtOH-H, O) ble filtrert og slått sammen. Etter fordampning av EtOH i vakuum ble den vandige fasen delt med diklormetan (DCM, CHCl; 300 ml, fem ganger) og etylacetat (EtOAc; 300 ml, fem ganger). EtOAc-fasen ble fordampet under redusert trykk til tørrhet for å gi K.angustifolia-ekstrakt (222,6 g, 10,6 prosent). Dagen før behandlinger ble ekstraktet, i pulverform, oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO; Sigma, Oakville, ON, Canada) for å oppnå stamløsningen, og ble deretter lagret ved -20 grad til nødvendig. De ønskede konsentrasjonene av K.angustifolia ble oppnådd ved å fortynne stamløsningen (12,5 eller 25 mg/ml) direkte i kulturmediet på dagen for forsøket. Sluttkonsentrasjonen av DMSO var 0,2 prosent (ofo) for å unngå løsningsmiddeltoksisitet.
2.2.Isolering av hovedforbindelser av K. Angustifolia-ekstraktet
Av EtOAc-ekstraktet beskrevet tidligere ble 30 g separert ved kromatografi over en Diaion-kolonne (Mitsubishi Chemicals, Charlotte, NC, USA), ved bruk av MeOH/H2O som elueringsmiddel under gradientforhold (40 prosent , 50 prosent , 60 prosent , 70 prosent og 100 prosent ), for å gi fire anrikede fraksjoner (AD). Fraksjon B (2 g) ble utsatt for en silikagelkolonne (200 g) og eluert med gradientbetingelser for MeOH-DCM fra 5 prosent til 15 prosent for å gi fire fraksjoner (B1-B4). Fraksjon C (6 g) ble også utsatt for en silikagelkolonne (300 g) og eluert med gradientbetingelser for MeOH-DCM fra 5 prosent til 25 prosent for å gi syv fraksjoner (C1-C7). Fraksjonen C3 (500 mg) ble renset ved revers-fase kromatografi på en C18 kolonne (120 g, FLH-R33230B-IS120 SiliaSepTM C18, Silicycle, Quebec, QC, Canada) ved bruk av 0,1 prosent maursyre i H, O-MeOH fra 40 prosent til 60 prosent. Fire underfraksjoner ble oppnådd: C3A-C3D, med C3B, og C3C med høy renhet, inneholdende hovedforbindelser. Fraksjon C4(2g) ble også renset ved revers-fase kromatografi på en C18 kolonne ved bruk av 0,1 prosent maursyre i H2O-MeOH fra 30 prosent til 45 prosent. Tre underfraksjoner ble oppnådd fra separasjonen: C4A-C4C, med C4A og C4C av høy renhet, som hver inneholdt en enkelt forbindelse. Fraksjon D (8,7 g) ble utsatt for silikagelkolonner (2×200 g) og eluert med gradientbetingelser av CHCl3-MeOH (15:1;10:1;5:1) for å oppnå åtte fraksjoner (D 1-D8). Fraksjoner D1 til D4 presenterte hver en hovedforbindelse.
2.3. NMR og GC-MS analyse
Kjernemagnetisk resonans (NMR)-spektre ble registrert med et Bruker Avance 400-spektrometer (Bruker, Milton, ON, Canada) ved 400 MHz for'H-kjerner og 100 MHz for 13C-kjerner, ved bruk av deuterert kloroform (CDCl3) eller deuterert metanol (CH3OD) som løsningsmiddel. Kjemiske skift er rapportert i ppm i forhold til gjenværende topp for løsemiddel. Høyoppløselig massespektrometri (HRMS) ble registrert på et Agilent 6224 MS-TOF massespektrometer (Agilent, Saint-Laurent, QC, Canada) utstyrt med en elektrospraykilde.
2.4. Biopsier og celleekstraksjon
Primære keratinocytter og fibroblaster ble hentet fra biopsier fra brystreduksjonsoperasjoner. Donorer var kaukasiske kvinner i alderen 18 til 52 år. Keratinocytter og fibroblaster ble ekstrahert fra biopsiene ved bruk av isolasjonsmetoden beskrevet tidligere [22,23]. Biopsier ble inkubert i termolysin ved 4 grader i 16 timer for å skille epidermis fra dermis. Deretter ble keratinocytter isolert fra epidermis ved bruk av trypsin i 30 minutter, mens fibroblaster ble isolert fra dermis ved bruk av kollagenase i 4 timer. Cellene ble deretter dyrket til ønsket passasje. Keratinocytter ble brukt ved passasje 1 og fibroblaster ved passasje 4.
2.5. Cellekultur
Primære fibroblaster (passasje 4) ble sådd ved 4 × 103 celler/cm² og dyrket i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10 prosent FB Essence-serum (FBI; Seradigm, Salt Lake City) , UT, USA), 100 UI/ml penicillin G (Sigma, Oakville, ON, Canada), og 25 ug/ml gentamicin (Gemini, West Sacramento, CA, USA). Primære keratinocytter (passasje 1) ble sådd ved 4×103 celler/cm² på et matelag av bestrålte 3T3 murine fibroblaster og dyrket i en kombinasjon av DMEM med Hams F12 i en andel på 3:1 (DMEMH), supplert med 5 prosent føtal klon. Ⅱ serum (Hyclone, Scarborough, ON, Canada), 5 ug/mL insulin (Sigma, St. Louis, MO, USA), 0,4 ug/mL hydrokortison (Galen-ova, Saint-Hyacinthe, QC, Canada), 0,212 ug /ml isoproterenolhydroklorid (Sandoz Canada, Boucherville, QC, Canada), 10 ng/ml human epidermal vekstfaktor (EGF; Austral Biological, San Ramon, CA, USA), 100UI/mL penicillin G (Sigma, Oakville, ON, Canada ) og 25 ug/ml gentamicin (Gemini, West Sacramento, CA, USA). Cellekulturer ble inkubert ved 37C i en 8 prosent karbondioksid(CO2)atmosfære. Cellekulturmedier ble skiftet annenhver dag, totalt tre ganger per uke.
2.6. Cytotoksisitetsanalyse
Toksisiteten til K.angustifolia-ekstraktet ble vurdert på primære keratinocytter ved å bruke en {{0}}(4,5-dimetyltiazolyl-2)-2,{{5} }difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse. MTT-analysen er en kolorimetrisk analyse basert på enzymatisk reduksjon av et gult tetrazoliumsalt (MTT) til lilla formazankrystaller. Denne enzymatiske reaksjonen katalyseres av mitokondriell succinatdehydrogenase i metabolsk aktive celler. Dermed brukes den til å vurdere cellelevedyktighet basert på cellulær metabolsk aktivitet. Kort fortalt, på dag 0 ble keratinocytter ved P3 fra friske donorer utsådd med 5×103 celler/brønn i en 96-brønnplate på et matelag av bestrålte 3T3 murine fibroblaster. På dag 2 ble behandlingen lagt til. På dag 4 ble MTT-fargestoff (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, Sigma, St. Louis, MO, USA) tilsatt til platen i en konsentrasjon på 0,5 mg/ml i sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) 1X. Platen ble deretter inkubert i 3 timer (37 grader ,8 prosent CO) og formazan ble ekstrahert med en frisk løsning av isopropanol og saltsyre (HCl). Absorbansen ble avlest ved 570 nm ved bruk av en mikroplateleser (SpectraMax Plus 384 Microplate Reader, Molecular Devices, San José, CA, USA). 2.7. Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC)-analyse
For å evaluere antioksidantegenskapene til K.angustifolia-ekstraktet, ble en Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC)-analyse utført som beskrevet av Ou et al. med noen modifikasjoner [24]. Kort fortalt ble analysen utført i en 384-brønnplate på en Fluoroskan Ascent FLTM plateleser (Labsystems, Milford, MA, USA). Ulike konsentrasjoner av Trolox(6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylkroman-2-karboksylsyre; en vitamin E-analog) ble utarbeidet for å lage en standardkurve i rekkefølge å sammenligne testprøver med denne positive kontrollen. Forsøket ble utført ved en temperatur på 37,5 grader og en halv 7,4 med en blindprøve parallelt.cistanche StorbritanniaFluorescensen til fluorescein ble registrert hvert 60. sekund med fluorometeret etter tilsetning av 2,2'-azobis(2-amidinopropan)-dihydroklorid. Fluorescensen ble målt ved en eksitasjonsbølgelengde på 485 nm og en emisjonsbølgelengde på 538 nm. Resultatene ble beregnet ved å bruke forskjellene mellom områdene under fluorescein-nedbrytningen fra blindprøven og prøvekurven. Resultatene for ORAC-verdier ble uttrykt i mikromol Trolox-ekvivalent (TE) per milligram (μmol TE/mg) eller mikromol TE per mikromol (umol TE/mol).
2.8. Antioksidantaktivitet vurdert ved hjelp av en cellebasert analyse
Antioksidantaktiviteten ble evaluert med en cellebasert analyse ved bruk av 2',7/-diklorfluorescein-diacetat (DCFH-DA) som beskrevet av Girard-Lalancette et al. med noen modifikasjoner [25]. Kort fortalt ble humane hud WS1 fibroblaster (ATCC⑧ CRL -1502, Manassas, VA, USA) inkubert i 60 minutter med 100 μL 5μM DCFH-DA i Hanks balanserte saltløsning (HBSS, HyClone, Marlborough, MA, USA) . Deretter, for å vurdere antioksidantaktiviteten til ekstraktet, ble cellene inkubert i 60 minutter med økende konsentrasjoner av K.angustifolia-ekstraktet og de positive kontrollene (quercetin og Trolox). For det oksidative stresset ble 100 μL 400 μM tertbutylhydroperoksid (t-BuOOH) tilsatt for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 200 μM t-BuOOH i brønnene. Fluorescensen ble deretter målt umiddelbart og etter 90 minutter ved bruk av en automatisert Fluoroskan Ascent FLTM plateleser (Labsystems, Milford, MA, USA). Fluorescensen ble vurdert ved en eksitasjonsbølgelengde på 485 nm og en emisjonsbølgelengde på 538 nm. Antioksidantaktivitet ble uttrykt som prosentandelen av inhibering av DCFH-oksidasjon.
2.9. Anti-inflammatorisk aktivitet vurdert ved nitrittkvantifisering
Den antiinflammatoriske aktiviteten ble evaluert ved å vurdere inhiberingen av nitrogenoksid (NO) produksjon av K.angustifolia-ekstraktet som beskrevet av Legault et al. [26]. Kort fortalt ble de murine makrofagene RAW 264.7(ATCC⑧ TIB-71, Manassas, VA, USA) inkubert med økende konsentrasjoner av K. Angustifolia-ekstrakt og deretter stimulert med 100 ng/mL lipopolysakkarid (LPS). En positiv kontroll, Nw-nitro-L-arginin metylesterhydroklorid (L-NAME), ble også brukt i to forskjellige konsentrasjoner -250 μM (67 ug/ml) og 1 mM (270 ug/mL). Cellefrie supernatanter ble samlet 24 timer etter LPS-stimuleringen, og konsentrasjonen av NO ble umiddelbart evaluert ved bruk av Griess-reaksjonen. Absorbansen ble avlest ved 540 nm ved bruk av en Multiskan plateleser (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Tilstedeværelsen av nitritt ble kvantifisert ved å bruke en NaNO-standardkurve. Inaktiverte celler (eksponert for media alene) ble brukt som en negativ kontroll og aktiverte celler som en positiv kontroll.
2.10.Produksjon av huderstatning
Sunn huderstatning ble produsert i henhold til selvmonteringsmetoden, delvis modifisert ved bruk av 6-brønnplater [20,21]. Kort fortalt ble fibroblaster ved P5 fra friske givere sådd i 1,5×105 celler/brønn og dyrket i 26 dager i DMEM supplert med 50 ug/mL (pluss)-natrium L-askorbat (Sigma, St. Louis, MO, USA) til de dannet manipulerbare ark. Deretter ble to fibroblastplater løsnet og lagt over hverandre for å danne den dermale ekvivalenten. Dermale ekvivalenter ble inkubert ved 37 grader i en 8 prosent CO-atmosfære i ytterligere to dager for å tillate arkfusjon og dermed danne det nye dermale laget av huderstatningene. Etter denne perioden ble keratinocytter ved P2 fra friske givere sådd på hudekvivalenten ved 1 × 10 graders celler/ekvivalent for å danne det epidermale laget av huderstatningene og dyrket i syv dager i DMEMH supplert med 50 ug/mL ( pluss ) -natrium L-askorbat (Sigma, St. Louis, MO, USA) for å tillate keratinocyttproliferasjon. Deretter ble huderstatninger hevet til luft-væske-grensesnittet for å fremme celledifferensiering. Ved luft-væske-grensesnittet ble huderstatninger dyrket med et medium som mangler EGF for å oppnå et lagdelt epitel som er representativt for in vivo-hud. Fjorten dager etter å ha blitt hevet til luft-væske-grensesnittet, ble huderstatninger behandlet tre ganger per uke i én uke med ekstraktstamløsningen fortynnet i et kulturmedium (med en endelig konsentrasjon av K. Angustifolia-ekstrakt på 25 ug/mL). Etter totalt 56 dagers dyrking ble huderstatningsbiopsier tatt og analysert ved histologi og immunfluorescensfarging.
2.11. Histologiske analyser
Huderstatningsbiopsier fra hver tilstand ble fikset i HistoChoice-løsning (Amresco, Solon, OH, USA) og innebygd i parafinvoks. Seksjoner 5 μm tykke ble deretter kuttet og farget med Massons Trichrome ved bruk av Weigerts hematoxylin, fuchsin-ponceau og anilinblå fargestoffer. Tykkelsen av dermis og levende epidermis ble målt med ImageJ-programvare (National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, USA). For tykkelsesmålingene ble det analysert tre ulike cellepopulasjoner, og for hver av dem ble det tatt to representative bilder per tilstand og gjort 10 målinger per bilde for totalt 60 målinger per tilstand.
2.12. Immunfluorescensfarging
Huderstatningsbiopsier fra hver tilstand ble innebygd i Tissue-Tek OCT Compound (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA), frosset ned i flytende nitrogen og deretter holdt ved -80 grad til nødvendig. Frosne deler av normal human hud ble brukt som positive kontroller. Indirekte immunfluorescensfarging ble utført på 6 um tykke kryoseksjoner fikset i aceton. De primære antistoffene som ble brukt var: polyklonalt anti-elastin fra kanin (gG) (fortynning 1:800, Abcam, Cambridge, MA, USA), polyklonalt antikollagen fra kanin-1 (IgG) (fortynning 1:300, Cedarlane, Burlington, ON, Canada), polyklonalt anti-kollagen fra kanin-3 (IgG)(fortynning 1:200, Cedarlane, Burlington, ON, Canada) og polyklonalt anti-akvaporin fra kanin-3(IgG)(fortynning) 1:500, Abcam, Cambridge, MA, USA). Det sekundære antistoffet som ble brukt var esel-anti-kanin IgG (H pluss L) Alexa 488 (fortynning 1:1600, Life Technologies, Eugene, OR, USA). Cellekjerner ble merket etter det sekundære antistoffet med monteringsmediet DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA). For å semikvantifisere fluorescensintensiteten til hvert protein, ble pikselintensiteten til immunfluorescensfargingen målt ved bruk av ImageJ-programvare (National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, USA). Kort fortalt ble hele hudlaget (dermis eller levende epidermis) av det studerte proteinet analysert ved å måle gjennomsnittlig gråverdi for hvert område. Fluorescensintensiteten til de behandlede huderstatningene ble sammenlignet med fluorescensintensiteten til kontrollhuderstatningene for å vurdere endringen i proteinekspresjon observert med behandlingene.
2.13. Statistisk analyse
Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. Den statistiske analysen av MTI-analysen, den antioksidantcellebaserte analysen og den antiinflammatoriske aktiviteten ble utført med en enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av en Dunnetts post hoc-test (p-verdi)<0.05 compared="" to="" control="" at="" 0="" μg/ml）="" or="" a="" bonferroni's="" post="" hoc="" test=""><0.05 compared="" to="" controls).="" thickness="" measurements="" were="" analyzed="" with="" a="" t-test.="" results="" were="" considered="" significant="" when=""><0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" with="" r="" software="" (v3.5.2,="" rcmdr="" v2.5-1,="" r-core="" team="" 2018,="" r="" foundation,="" vienna,="">
Denne artikkelen er hentet fra Antioxidants 2021, 10, 1373. https://doi.org/10.3390/antiox10091373 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants