Antioksidant grafenoksid nanobånd som et nytt blekemiddel hemmer melanogenesemekanismen

Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hsin-Yu Chou, Hui-Min David Wang,* Chia-Heng Kuo, Pei-Hsuan Lu, Lin Wang, Wenyi Kang og Chia-Liang Sun*

ABSTRAKT:I melaninsynteseprosessen spiller oksidative reaksjoner en vesentlig rolle, og det er en god strategi å hemme melaninproduksjonen ved å redusere oksidativt stress. Fulleren og dets derivater, eller kompleksene, ble betraktet som sterke frie radikaler, og vi brukte ytterligere flerlags sp2 nanokarboner for å oppdagemelaninsyntesehemmende mekanismer. I denne studien brukte vi nye nanomaterialer, for eksempel flerveggede karbon-nanorør (MWCNT), korttype MWCNT, grafenoksid-nanobånd (GONR) og GONR-er av kort type, som antioksidative midler for å regulere melaninproduksjonen. Resultatene viste at GONR-er hadde bedre antioksidative evner i intracellulære og ekstracellulære oksidativt stressanalyseplattformer enn andre. Vi foreslo at GONR-er har oksygenholdige funksjonelle grupper. I 2′,7′-diklordihydrofluoresceindiacetatanalysen fant vi ut at GONR kunne chelatere metallioner for å fjerne reaktive oksygenarter. I det molekylære innsiktssynet observerte vi at disse nanomaterialene nedregulerte melaninsyntesen ved å redusere mikroftalmiassosierte transkripsjonsfaktorrelaterte genuttrykk, og det var lignende konsekvenser i proteinuttrykk. For å oppsummere er GONR-er et potensielt middel som en ny antioksidant og hudblekende kosmetikkmateriale.

Cistanche er ogsåen potensiell agent som en romanantioksidantog hudblekingkosmetikkmateriale.

1. INTRODUKSJON

Hud er organet som dekker den ytre overflaten av menneskekroppen. Siden grensesnittet er i kontakt med miljøet, spiller hudlaget en viktig rolle i å beskytte kroppen mot patogener, unngå overdreven vanntap, regulere kroppstemperaturen og så videre. Melanocytter vokser i basalmembranen i hudepidermis og står for 5 prosent til 10 prosent av celleinnholdet. De har blitt karakterisert som encellede "kjertler" med tynne, lange, streamerlignende dendritter og forgrening. Melanocytter beveger seg gjennom epidermale celler i deres umiddelbare nærhet, og skaper en konstellasjon av epidermale celler rundt hver melanocytt. Det er mange interne og eksterne årsaker til aldring av huden, og en slik faktor er ultrafiolett (UV) stråling fra sollys.1 Under UV-eksponering øker nivåene av reaktive oksygenarter (ROS) i huden dramatisk, som er kjent som oksidativt stress. Flere miljøtoksisitetsfaktorer forsterker også oksidativt stress på huden, slik som plantevernmidler, karbontetraklorid, tungmetaller, aromatiske aminer og partikler 2,5 (PM2,5).2 I den biokjemiske mekanismen genereres de intracellulære oksidantene fra ikke- enzymsystem, transformerer dem til ROS for å utløse melanogenese-veien.3

I tillegg til ROS er det mange faktorer som påvirkermelanin produksjon, inkludert genuttrykk, betennelse, endokrine endringer og pigmentopptak.1 I de første trinnene i melaninproduksjonen spiller tyrosinase en rolle i å katalysere tyrosin til fenomelanin og eumelanin. Begge pigmentfremstillingsmekanismene er like, som inkluderer L-tyrosinhydroksylering til 3,4-dihydroksy-L-fenylalanin (L-DOPA) og L-DOPA-oksidasjon til dopakinon. I neste trinn oksideres dopamin av tyrosinaserelatert protein 1 (TRP-1) og tyrosinaserelatert protein 2 (TRP-2) i melanosomet, som reguleres av den mikroftalmiassosierte transkripsjonsfaktoren ( MITF) for å danne melanin. Til slutt modnes og utfelles melanin i stratum corneum.4,5 Disse penetrerer de nærliggende keratinocyttene i basallaget og beskytter deres DNA mot eventuelle UV-induserte mutasjoner eller modifikasjoner. Det modnede melaninet i melanosomer overføres til keratinocytter6−9 og fører til slutt til en langvarig pigmentering. Lentiginer, fregner og brune/svarte flekker forårsaker noen ganger sosiale problemer hos menn og kvinner. Blokkering av oksidativt stress eller undertrykkelse av tyrosinaseaktiviteten er en strategi for å nedregulere syndromet med hyperpigmentering og dermatologiske lidelser. Antioksidanter helbreder ROS-forårsakede hyperpigmenteringer og cellulær skade.10,11 Derfor har syntetiserte antioksidative forbindelser mange biofunksjonelle bruksområder i hudpleieapplikasjoner.

Fulleren (C60), karbon nanorør (CNT), grafen og grafen nanobånd (GNR) er fire typer sp2 nanokarbon som er mye forsket på rundt om i verden.12 Fulleren og dets derivater eller komplekser har blitt ansett som sterkefrie radikaleri lang tid. Yodh et al. brukt vannløselig C60 som et beskyttende middel mot katabolsk stress-indusert degenerasjon. Inject et al. konkluderte med at C60(OH)24 er en sterk antioksidantforbindelse når det oksidative stresset er for høyt. Okuda et al. antydet at C60-komplekser kan forhindre NO-mediert celleskade.13,14 Tong et al. viste at C60-komplekser kan være lovende kandidater for behandling av hjernerelaterte sykdommer forårsaket av økte nivåer av superoksid. Faktisk identifiserte et japansk selskap fullerener med en sterk antioksidantaktivitet for kosmetisk bruk i 2006. Lucente-Schultz et al. demonstrerte at evnen til å fjerne oksygenradikaler til funksjonaliserte enkeltveggede CNT-er (SWCNT-er) er nesten 40 ganger større enn dendritiske C60.15−19 Fenoglio et al. observerte at flerveggede CNT-er (MWCNT-er) har en bemerkelsesverdig radikalfjernende kapasitet i kontakt med en ekstern kilde til hydroksyl- eller superoksidradikaler.20 Beregninger av tetthetsfunksjonsteori avslørte også en modell av SWCNT som frie radikaler. I 2004, Novoselov et al. demonstrerte først at grafen viste en sterk ambipolar elektrisk effekt og kunne være lovende for elektroniske applikasjoner.21 Deretter fortsatte de å vise at grafen har elektroniske egenskaper som er karakteristiske for en 2D gass av partikler beskrevet av Dirac-ligningen.22,23 Siden disse to banebrytende papirene har mer og mer oppmerksomhet blitt gitt til grafenbasert forskning.24−30 For eksempel Qiu et al. i 2014 viste at grafenoksid og fålags grafen viser betydelig antioksidantaktivitet og kan beskytte ulike biomolekylære molekyler mot oksidasjon.31 Han et al. demonstrerte eksperimentelt i 2007 at energigapet til GNR-er kan kontrolleres under litografiprosessen ved å endre båndbredden.32 Blant de fire nanokarbonene har GNR-er fått minst oppmerksomhet. Så vidt vi vet er det lite forskning på antioksidantegenskapene til grafenoksid-nanobånd (GONR-er).31,33 Derfor har vi i denne studien forberedt MWCNT-er, korte MWCNT-er, GONR-er og korte GONR-er nøye og har som mål å sammenligne deres antioksidantegenskaper og relaterte resultater systematisk.

2. RESULTATER OG DISKUSJON

2.1. Morfologi til MWCNT-er og GONR-er.

Figure 1a shows the low- and high-magnification transmission electron microscopy (TEM) images of MWCNTs and short MWCNTs. Following acidic cutting under ultrasonication, the length of MWCNTs could be shortened from >10 μm til 2−3 μm. Samtidig ble det observert at salpetersyrebehandlingen gjør de glatte røroverflatene ru. Noen hakk og uregelmessige former vises i bildet med høy forstørrelse. Videre, bruk av MWCNT og korte MWCNT gjennom mikrobølgereaksjoner oppnår henholdsvis GONR og kort GONR. Vi illustrerte også TEM-bildene med lav og høy forstørrelse av GONR og kort GONR. På grunn av den store langsgående utpakkingen og mindre horisontale skjæringer, ser det ut til at GONR-er var kortere enn MWCNT-er. På den annen side viste bilder med høy forstørrelse større diametre, det vil si 0.11−0,18 μm, av GONR-er enn MWCNT-er, noe som indikerer at utpakkingsprosessen var vellykket. På samme måte viste korte GONR-er en kortere lengde og større diameter enn korte MWCNT-er. I luftkompressoren til vår nye utpakkingsprosess var de tynne lagstrukturene til GONR-ene mindre enn det vi oppnådde i den tidlige rapporten for den samme mikrobølgeeffekten på 250 W mens de beholdt de tykkere sentrale MWCNT-ene.12 Dette betydde et kjerne-skall MWCNT. /GONR-heterostruktur vil mer sannsynlig vises i stedet for den fullstendig utpakkede nanobåndstrukturen gjennom alle mikrobølgekrefter i den nye prosessen. For å sammenligne med den korte GONR i våre tidligere studier34, genererte den høyere mikrobølgeeffekten flere hakk på siden av båndene og dannet ikke fine, glatte båndkanter. Merk at vi brukte to forskjellige typer Cu-nett i figur 1a. For MWCNT-er og GONR-er med nok lengde, ble Gu-gitteret med en blondeformvar stabilisert med karbon (produktnr. 01881-F, Ted Pella, Inc., USA) brukt. De åpne hullene i en blond karbonfilm forhindret et overlappende overføringsbilde mellom nanokarboner og karbonfilmen. De mørkegrå nettverkene tilhører den blonde karbonfilmen. Gu-nettet med formvar stabilisert med karbon (produktnr. 01800-F, Ted Pella, Inc., USA) var imidlertid nødvendig for kort MWCNT og kort GONR. Dette var fordi de store hullene i den blonde karbonfilmen forårsaket problemer for å holde den korte MWCNT og den korte GONR effektivt. Som illustrert i figur 1, er den lysegrå kontrasten under de korte MWCNT-ene og korte GONR-ene et lett lag av karbon. Dette karbonlaget stabiliserte formvar-filmen som ble utsatt for elektronstrålen via dens varme- og elektrisk ledende egenskaper.

2.2. Bindingskonfigurasjoner av MWCNT-er og GONR-er.

Raman-spektrene til de fire nanokarbonene er presentert i figur 1b; D-båndet til GONR-er var høyere enn for MWCNT-er etter utpakkingsprosessen. Dette ble tilskrevet det høyere oksidasjonsnivået og større antall kantstrukturer av GONR sammenlignet med MWCNT-er. Dette fenomenet ligner også på det vi observerte i 2011.12 På grunn av det høye grafitiseringsnivået hadde G-båndet til MWCNT-er det laveste fullbredde-ved-halv-maksimumstallet. ID/IG-forholdene til de fire nanokarbonene var henholdsvis {{10}}.076, 0.502, 0.483 og 0.700. Kort fortalt økte den reduserte lengden og overflateoksidasjonen defektnivået og gjorde dermed ID/IG-forholdene høyere. D′-toppen er tilstede i alle defekte grafener og blir sett på som et mål på kvalitet.35 Som illustrert i figur 1b, blir D′-toppene i de fire spektrene mer fremtredende etter enten kutte- eller utpakkingsprosessen, noe som tyder på at de er destruktive prosesser som introduserer mange feil. Figur 1c,d viser røntgenfotoelektronspektroskopispektrene til de fire nanokarbonene. Tilsynelatende er D′-toppen den klareste for korte GONR-er. Som vist i figur 1c økte O-nivået betydelig fra 7,6 prosent (MWCNTs) til 19,9 prosent (GONRs) på grunn av den sterke oksidasjonsevnen til KMnO4 i et surt miljø. På den annen side økte O-nivået litt med 0,8 prosent fra MWCNT til de korte MWCNTene. Viktigere er at det høyeste O-nivået er 38,3 prosent for den korte GONR, noe som antyder at endene av nanobåndene ville være lettere å feste oksygenfunksjonelle grupper enn de plane sp2-overflatene. Det større tallet i full bredde-ved-halv-maksimum og skiftet til en høy bindingsenergi av C 1s-topper etter utpakkingsprosessen til både MWCNT-er og korte MWCNT-er er illustrert i figur 1d. For grafenoksider kan de dekonvoluterte toppene på siden med høy bindingsenergi tildeles C−C(CC), C−O, CO og COOH-bindinger.36 Vi karakteriserte GONR (200 W) i 2013 ,37 og resultatene var lik denne studiens resultater. Denne studien konkluderte med fenomenene til Raman-spektra, noe som betyr at flere oksygenholdige funksjonelle grupper ble generert under transformasjonen av rør til bånd (figur 2).

2.3. Antioksidative egenskaper til MWCNT-er og GONR-er.

2.3.1. Bestemmelse av 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl Free Radical Scavenging Activity Assays.

1,1- Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) friradikalfjernende aktivitet er en antioksidantplattform som brukes for å oppdage den antioksidative kapasiteten; resultatene for de fire nanokarbonene er beskrevet i tabell 2. I DPPH-analysen ble vitamin C i en konsentrasjon på 100 μM brukt som en positiv kontroll. For å teste de antioksidative aktivitetene til MWCNT, korte MWCNT, GONR og korte GONR, ble doser på 1, 5 og 1 0 mg/L inkubert i reaksjonsløsningen for å måle egenskapene. MWCNT-er, korte MWCNT-er, GONR-er og korte GONR-er hadde moderate hemmende evner ved 10 mg/L (19.2 ± 0.3, 12.1 ± 0.3, 26.8 ± 0.3 og 30,0 ± 0,4 prosent), mens vitamin C hadde en lignende tilstand ved 100 μM (93,4 ± 0,1 prosent) for undertrykkelsen.

2.3.2. Ione-chelaterende aktivitetsanalyse.

Innenfor den oksidative stresssituasjonen kan ferrozinet utvikle et kompleks med Fe2 pluss som skal måles kvantitativt. I nærvær av chelaterende mediatorer brytes komplekset, noe som får jernholdige ioner til å redusere fra en mørk rød farge på Fe2 pluss-komplekset. Vi brukte EDTA som positiv kontroll. Tabell 2 viser at MWCNT-er, korte MWCNT-er, GONR-er og korte GONR-er hadde chelateringsaktivitet ved 10 mg/L (29,2 ± {{10}}.8, 28.7 ± 0 0,7, 69,7 ± 0,6 og 68,9 ± 0,3 prosent), mens den positive kontrollen hadde lignende tilstand ved 100 μM (93,4 ± 0,1 prosent).

2.3.3. Jern-reduserende antioksidantkraftmåling.

Den ferri-reduserende potensialanalysen er en enkel og pålitelig test som brukes til å kvantifisere Fe(III)-ferricyanidkomplekssyntesen. I denne analysen ble den reduserende kraften til de fire nanokarbonene som produserer jernholdig Fe(III)-TPTZ-komplekset oppdaget ved endringer i fargen på løsningen fra gul til grønn og blå. Tabell 2 viser at de reduserende kraftene til MWCNT, kort MWCNT, GONR og kort GONR var optisk tetthet (OD) 1,11, 1,13, 1,15 og 1,11 ved 10 mg/L.

2.3.4. MWCNT-er og GONR-er hemmer intracellulær ROS-akkumulering.

Mange rapporter har vist at ROS ødelegger den strukturelle integriteten til cellemembraner, inkludert cellemembraner og kjernemembraner for å føre til celleskade og tap av normal funksjon.38−40 I tillegg er ROS også en av de viktige faktorene for å katalysere tyrosinasedannelse. melanin, og hemming av ROS-produksjon er en god strategi for å nedregulere melaninsyntesen. I denne studien brukte vi 2′,7′-diklordihydrofluoresceindiacetat (DCFDA)-fargingsanalysen for å analysere det intracellulære oksidative stressnivået i MWCNT- og GONR-behandlingsceller. Forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) induserte oksidative stimuleringer i MWCNT- og GONR-gruppene og ble brukt som en negativ kontroll.41 Når konsentrasjonen av PMA var 20 ng/mL, induserte det oksidativt stress, og økte verdien til 38 prosent; etter behandling av GONR-er og MWCNT-er, ble nivåene av ROS nedregulert til det normale nivået. Dataene viste at begge materialene hemmet oksidativt stressnivåer, og den antioksidative effekten av GONR-er var høyere enn MWCNT-er (figur 3). Tabell 1 viser en tilsvarende konsekvensliste. Vi hevdet at det er tre grunner til våre nye funn: For det første var oppløselighetsrekkefølgen til disse materialene som følger: korte GONR-er > GONR-er > korte MWCNT-er > MWCNT-er, noe som betyr at kontaktområdet til korte GONR-er var størst, så det var overlegen for ROS-rensing. For det andre var GONR-er og MWCNT-er sp2-karbonstrukturer som kunne ødelegge ROS-elektrisitet gjennom adduktdannelse eller elektronoverføring.42 Vi fant at antioksidanteffektene til nanobåndstrukturene var bedre enn de til nanorørstrukturene, så nanobånd gjør det lettere å overføre elektroner enn nanorør. Til slutt, i figur 1b, observerer vi at GONR sp2-karbonstedet inneholdt flere oksygenfunksjonelle grupper enn MWCNT, karboksylsyregruppene kunne chelatere metallioner, og hydroksylgruppene kunne være en H-donor for å fjerne ROS og hemme melaninproduksjonen.

2.4. Cytotoksisitet av MWCNT og GONR behandlet i humane dermale fibroblastceller.

{{0}}(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT)-metoden ble brukt for å evaluere cytotoksiske egenskaper til GONR-er på Hs68-celler (figur 3), og cellene ble dyrket i forskjellige doser på 1, 5 og 10 ug/ml. Vi undersøkte at cellelevedyktigheten til MWCNT var 100,7 ± 3,7, 99,8 ± 4,9 og 94,1 ± 4,7 prosent ved konsentrasjoner på henholdsvis 1, 5 og 10 mg/L; levedyktigheten for den korte MWCNT ble beregnet i samme rekkefølge og ble funnet å være 93,9 ± 2,2, 86,4 ± 3,0 og 98,9 ± 2,1 prosent. Vi observerte at B16−F10-cellene ble inkubert i høye konsentrasjoner, og celleoverlevelsen til Hs68-celler var mer enn 80 prosent, noe som tyder på at MWCNT og kort MWCNT ikke hadde noen toksisk effekt på humane dermale fibroblastceller. Cellelevedyktigheten til GONR og kort GONR var 86,24 ± 2,1, 90,87 ± 3,5, 88,58 ± 2,5, 89,03 ± 3,6, 90,71 ± 2,8 og 90,64 ± 2,5 prosent. Det er også påpekt i figur 4a at GONR og kort GONR ikke hadde en merkbar cytotoksisk effekt på HS68-celler. I tidligere rapporter kunne bruken av uprøvde nanomaterialer til kosmetiske formål anses som tvilsom,43,44 og det skyldtes vanligvis angrepet av DNA etter at nanopartikler kom inn i cellene. Etter cytotoksisitetstest fant vi at materialene våre ikke forårsaket toksisitet for normale hudceller. Vi konkluderte med at etter at nanomaterialer kom inn i cellene, hemmer nanomaterialene bare melaninproduksjonen ved å redusere oksidativt stress og chelaterende metallioner og ikke skade mitokondriene eller DNA, noe som betyr at MWCNT og GONR var trygge å brukes.

2.5. To typer MWCNT og GONR i B16−F10 cellulær tyrosinaseaktivitet og melanininnhold.

I melaninsynteseveien spiller tyrosinase en kritisk rolle. Tyrosinase oksiderer og danner eumelanin og pheomelanin gjennom en rekke biokjemiske reaksjoner. For å bestemme om GONR-er og MWCNT-er hemmer aktivitetene til tyrosinase og forårsaker en reduksjon i melaninproduksjonen, analyserte vi tyrosinaseaktiviteten i B16−F10-celler. Vi fant at MWCNT og korte MWCNT hemmet tyrosinaseaktivitet med omtrent 17,1 prosent og 23 prosent ved 10 mg/L. GONR-er og korte GONR-er hadde en bedre effekt på å undertrykke tyrosinaseaktiviteten ved samme konsentrasjoner sammenlignet med en annen GONR. De var også på en doseavhengig måte og hemmet 49,8 prosent og 44,7 prosent av tyrosinaseaktiviteten, som vist i figur 4b.

Melanin er et uunnværlig pigment i menneskekroppen, men overuttrykk av melanin utløser ofte en rekke sykdommer. I tidligere studier har Xiao et al. brukte et lignende materiale, Radical Sponge, en fullerennanopartikkel, som et anti-melaninmiddel.45 Det var noen gode resultater; ca. 20 prosent av melaninproduksjonen kan hemmes. For å forbedre effektiviteten forbedret vi testmaterialet ytterligere for å måle inhiberingshastigheten til melanin og dets molekylære mekanisme, som vist i figur 4c og 5. MWCNT og korte MWCNT reduserte melanininnholdet med 17,6 ± 5,5 og 13,2 ± {{ 16}},2 prosent ved 10 mg/L og på en doseavhengig måte. GONR-er og korte GONR-er nedregulerte verdiene kraftig til 32,0 ± 2,3 og 35,3 ± 3,4 prosent ved 10 mg/L. De eksperimentelle resultatene antydet at alle fire typene kunne hemme syntesen av melanin og GONR hadde en sterkere effekt. På den annen side har vi også observert at den korte GONR har en bedre effekt på å hemme melaninproduksjonen. Vi konkluderer med at de korte GONR-ene har mer funksjonelle grupper og effektivt kan forhindre metallion-katalysert tyrosinase, og hemme produksjonen av melanin ytterligere (figur 2). I tabell 1 observerer vi at innsatsen til metallion-chelaterende kort type er høyere enn den normale typen; dette betyr at disse korte GONR-ene potensielt kan brukes i det kosmetiske feltet som hudpleiemidler.

2.6. Mekanisme av MWCNT og GONR hemmet B16−F10 cellulært melanininnhold.

Celler reagerer på det ytre oksidative stresset ved å regulere proteinuttrykket. B16−F10-celler forbedrer c-myc-genekspresjonen og oppregulerte AMPK for å redusere oksidative nivåer,46 og i dette arbeidet er MITF en spesifikk transkripsjonsfaktor av tyrosinase for å regulere signalveien for molekylær melaninsyntese.47−49 I figur 5a, MWCNT-er og GONR-er nedregulerer den mikroftalmiassosierte transkripsjonsfaktoren ved å redusere det oksidative stresset, og deretter ble nedstrømsgenet TRP-1 og TRP-2 også nedregulert. For proteinnivået ble det funnet et lignende fenomen, der MWCNT-er og GONR-er nedregulerte den MITF-relaterte melanogenese-veien og deretter til slutt reduserte melanininnholdet (Figur 5b).

3. EKSPERIMENTELLE MATERIALER OG METODER

3.1. Utarbeidelse av MWCNT-er og GONR-er.

Den relevante prosessen for å lage GONR-er ble rapportert i et tidligere papir.12 MWCNT (0.05 g) ble suspendert i 9:1 H2SO4/H3PO4 og behandlet med en mikrobølgereaktor (CEM-Discover) med effekten innstilt på 250 W i 2 min. Etter tilsetning av KMnO4 (0,25 g) til løsningene, ble løsningene behandlet med samme mikrobølgeeffekt ved 65 grader i 4 min. Her brukes luftkompressoren til å kontrollere temperaturen på mikrobølgereaktoren under prosessen. Mikrobølgeeffekten ble satt til 250 W i de foreløpige testene.

3.2. Utarbeidelse av korte MWCNT-er og korte GONR-er.

Den relevante prosessen for å lage korte GONR-er ble rapportert i vår forrige artikkel.34 Den sure behandlingstiden ble valgt til 8 timer. Mikrobølgeeffekten ble satt til 250 W, som er det samme som for å få GONR-er.

3.3. DPPH Radical Scavenging Activity.

DPPH ble ofte brukt for å bestemme prøvenes rensekapasitet og antioksidasjonsegenskapene.50 DPPH er et lilla reagens som endrer fargen fra lilla til gult hvis det frie radikalet overføres til analytten. Positive antioksidative prøver med passende konsentrasjoner ble tilsatt løsningen, og prøvene ble analysert ved 517 nm i 30 min. Vi brukte prosentene av gjenværende DPPH i tillegg til testprøvene for å måle mengden antioksidant som kreves for å redusere de tidligere DPPH-radikalene. Vitamin C ved 100 μM ble brukt som positiv kontroll. Renseaktiviteten (prosent) ble målt som

Rensekapasitet ( prosent )=(Asample − Ablank) / (Acontrol − Ablank) × 100 prosent (1)

3.4. Metall-chelaterende aktivitet.

Metallion er faktoren som forårsaker overdreven oksidasjon av lipider, og Fe2 pluss er et av de mest påvirkende ionene.50 Ulike konsentrasjoner av nanobiomateriale (1 μL) ble lastet inn i en 96-brønnplate, som inneholdt 2 mM FeCl2·4H2O (10 μL), og deretter lastet inn i ferrozin (5 mM, 20 μL). Blandingen ble fullstendig blandet med 69 μL mentol og holdt ved romtemperatur i 10 minutter. Deretter ble prøvereaksjonsløsningen observert ved 562 nm. EDTA ble brukt som en positiv kontroll ved 100 μM, og beregningsformelen for metallchelaterende aktivitet var basert på ekv. 1.

3.5. Redusere kraft.

Beregningen av reduserende kraft er basert på en tidligere studie.50 Først ble 2,5 μL grafenmaterialer blandet med PBS-buffer (67 mM, pH 6,8) og K3Fe(CN)6 (2,5 μL, 20 prosent) og deretter inkubert ved 50 grader i 20 min. Deretter ble 10 prosent trikloreddiksyre (160 μL) blandet med reagensene ved 300 g sentrifugert i 20 minutter. Absorpsjonslengden ble bestemt ved 700 nm etter å ha blitt blandet med 25 μL FeCl3 (2 prosent). Butylert hydroksyanisol (BHA) ble brukt ved 100 μM.

3.6. Cellespredningsundersøkelser.

Den humane dermale fibroblastcellelinjen HS68 ble brukt for å analysere forholdet mellom celleproliferasjon. HS68 ble inkubert i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) som inneholdt 10 prosent føtalt bovint serum og 1 prosent penicillin og streptomycin blandet.50,51 Etter å ha blitt behandlet med forskjellige konsentrasjoner av prøver, brukte vi MTT for å påvise celleproliferasjonsforholdet. 8000 celler ble sådd i 96-brønnplater og behandlet med prøver i 24 timer. Supernatantløsningen ble fjernet, og vi brukte MTT-løsningen til dyrking i 2 timer ved 37 grader. Etter inkubering fjernet vi det MTT-holdige mediet og løste det opp med dimetylsulfoksid (DMSO). Løsningen ble avlest ved OD 590 nm og hastigheten ble beregnet ved eq 1.

3.7. Vurdering av cellulært melanininnhold.

Vi brukte en metode med mindre modifikasjoner basert på forrige analyse.52,53 Cellepelleter av B16−F10 fra Bioresource Collection and Research Center (BCRC, CRL 6323, Hsinchu, Taiwan) ble oppløst i en blanding av 2.0 N NaOH og 10% DMSO. Prøven ble deretter oppvarmet i 1 time ved 90 grader og sentrifugert ved 10,000g i ytterligere 10 minutter for å oppnå den klare supernatanten. Melanintallet ble bestemt ved å overvåke OD til supernatanten ved 475 nm.

3.8. B16−F10 Cellulær tyrosinaseaktivitet.

For den cellulære B16−F10-tyrosinaseaktiviteten refererte vi til det forrige arbeidet med noen modifikasjoner.50 Celler ble dyrket i 12-brønnplater med 105 celler hver brønn. Etter behandlinger med prøver ble cellene lysert i 1 prosent Triton X-100/PBS og 2 mM L-tyrosin (50 μL) i 3 timer. Etter inkubasjonen fjernet vi mediet og leste absorbansen ved OD 590 nm. Tyrosinaseaktivitetsformelen ble beregnet ved eq 1.

Cistanche er en tyrosinasehemmer.

3.9. Deteksjon av ROS ved DCFDA-farging.

Med henvisning til forrige studie,54 1.2 1.105 B16−F10-celler ble sådd i 6-brønnplater og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av prøver. Celler ble suspendert i PBS og deretter lastet med DCFDA (5 μM) i ikke-fenolrød DMEM i 30 minutter ved 37 grader. Strømningscytometeret (Guava, Merck, Tyskland) ble brukt til å detektere det fluorescerende signalet til DCFDA. Eksitasjons- og emisjonsbølgelengdene til DCFDA var henholdsvis 488 og 535 nm.

3.10. Kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon.

Vi fulgte metodene til Lin et al. (2018).1 Sanntids kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR) besto av en eksklusiv primerprobe for å generere fluorescens. Den brukte en fluorescensdeteksjonsteknikk som registrerer hver syklus ved hjelp av et 7500 qRT-PCR-system (Applied Biosystems, USA). Den oppdaget syklusen basert på mengden frigjort fluorescens, og deretter ble produktet av hver syklus beregnet for det genererte innholdet, noe som resulterte i oppnåelse av kvantitative sanntidsformål. Trizol (Invitrogen, USA) ble brukt til å ekstrahere et komplett RNA fra lungevevet, i henhold til instruksjonene gitt av produsenten. Deretter ble et revers transkripsjonssett (Takara, Japan) brukt for å generere DNA. I qRT-PCR ved bruk av primere, oppført i tabell 1, ble prøven først oppvarmet for å danne en enkelt DNA-streng; deretter fant en primerbinding sted for å danne et dobbelttrådet DNA (dsDNA), hvoretter SYBR Green dsDNA ble kombinert, hvortil SYBR green plus reagenssettet (Roche, Basel, Swiss) ble brukt, noe som resulterte i frigjøring av fluorescens. Resultatet ble ført gjennom et fluorescensdeteksjonssystem. Deteksjonen av fluorescerende signaler fant sted under forlengelses- eller annealingsfasen av hver syklus; etter deteksjonen ble prøveinnholdet presset tilbake av de detekterte fluorescensintensitetene.55 Ekspresjonsnivåene til målgener ble normalisert til -tubulinnivåer ved bruk av 2−ΔΔCt-metoden.

myricetin

3.11. Western Blot Test.

B16−F10-celler ble lysert ved 4 grader over natten med en radioimmunutfellingsanalysebuffer (Thermo Scientific Co., USA), som inneholder proteasehemmere. Bicinchoninsyre-proteinanalysesettet (BCA, Sigma-Aldrich Corp., USA) ble brukt for å kvantifisere proteinmengden. Prøveproteiner ble separert på 10 prosent natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel og overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF)-membran (PALL Life Science, Ann Arbor, MI, USA). PVDF-membranen ble blokkert med en blokkeringsbuffer (Thermo Scientific) i 1 time og inkubert med det spesifikke primære antistoffet over natten ved 4 grader. Deretter ble membranen vasket med Tris-bufret saltvann-Tween 20-buffer to ganger og inkubert med sekundære antistoffer i 1,5 time. Etter det ble membranen dyppet i kjemiluminescensdeteksjonsreagenser (Thermo Scientific) og analysert av en MiniChemi Chemiluminescence-bildeapparat (Beijing Sage Creation Science, Kina). Kilder til antistoffer inkluderte kanin-anti-MITF, kanin-anti-TRP-1, kanin-anti-TRP-2 og -aktin (Thermo Scientific).

3.12. Materialanalyse.

TEM (JEOL JEM-1230, 100 kV) ble brukt for å observere morfologien til nanokarbonene. Et mikro Raman-spektrometer (PTT, RAMaker) ble brukt for å sjekke resonansmodusene til nanokarbonene. Røntgenfotoelektronspektroskopi (XPS, Kratos Axis Ultra DLD) målinger ble også utført for å bestemme komposisjonsanalysen.12,34

3.13. Statistisk analyse.

Alle prøvene og standardeksperimentene ble gjentatt minst tre ganger. Vi brukte studentens t-test for å sammenligne og uttrykke gjennomsnittet av gjennomsnittsverdiene ± standardavvik statistisk.

4. KONKLUSJONER

For å oppsummere, observerte vi at den korte GONR var potensielt materiale for hudpleieprodukter på grunn av dets flere biofunksjonelle egenskaper (figur 6). Resultatene viste at nanokarbonene spilte en rolle som en ekstracellulær og intracellulær antioksidant. I mellomtiden hemmet nanokarbonet tyrosinaseaktiviteten og melanininnholdet og forårsaket ingen alvorlig skade på pigmentceller. Dette arbeidet etablerte anti-melanogenese-funksjonene til fire typer nanokarboner; fremtidige studier vil bli undersøkt mekanismen til disse forbindelsene på spesifikke gen- og proteinuttrykk relatert til melaninmodning, transport og akkumulering.

Cistanche forbedrer bleking.

Klikk på bildet og få flere detaljer.