Gunstige effekter av total fenyletanoid glykosidfraksjon isolert fra Cistanche Deserticola på beinmikrostruktur hos ovariektomiserte rotter

Denne studien ble designet for å estimere den antiosteoporotiske aktiviteten til total fenyletanoidglykosidfraksjon isolert fra C. deserticola (CDP) på rotter indusert ved ovariektomi (OVX) så vel som de relaterte mekanismene. Etter 3 måneders oral administrering ble den reduserte beinmineraltettheten, serum Ca og P i OVX-rotter gjenvunnet, og den forverrede trabekulære beinmikroarkitekturen ble delvis forbedret av CDP (60, 120 og 240 mg/kg) intervensjon, aktivitetene til benresorpsjonsmarkører ble nedregulert, og det bioaktive av bendannelsesindeksen ble oppregulert; i mellomtiden ble innholdet av MDA redusert, og GSH ble økt ved CDP-behandling. Sammensetningsmessig ble 8 fenyletanoidglykosidforbindelser identifisert i CDP, med det totale innholdet kvantifisert til 50,3 prosent ved bruk av HPLC-metoden. Mekanistisk reduserte CDP nivåene av TRAF6, RANKL og RANK, og undertrykte dermed RANKL/RANK/TRAF6-indusert aktivering av nedstrøms NF-KB og PI3K/AKT signalveier og forhindret til slutt aktivitetene til de viktigste osteoklastogene proteinene til NFAT2 og c-Fos. Alle dataene ovenfor antydet at CDP viste gunstige effekter på beinmikrostruktur i ovariektomiserte rotter, og disse effektene kan være relatert til NF-KB og PI3K/AKT signalveier som ble utløst av bindingen av RANKL, RANK og TRAF6.

Klikk cistanche fordeler produktet

1. Introduksjon

Postmenopausal osteoporose, hvor 1 av 3 kvinner over 50 år vil lide, er i ferd med å bli en hovedhelsefare som rammer mer enn 200 millioner kvinner over hele verden [1]. Ved overgangsalder fører den kraftige nedgangen i østrogennivået vanligvis til en overskredet benresorpsjon forårsaket av økt osteoklastogenese; deretter ble balansen mellom osteoblast-indusert bendannelse og osteoklast-indusert benresorpsjon forstyrret, og den akselererte benresorpsjonen forårsaket til slutt osteoporose og til og med hofte- eller ryggradsbrudd [2]. Det ble antatt at differensieringen av osteoklasten ble utløst når reseptoraktivatoren til nukleær faktor kappa B (RANK) ble bundet til RANKL, liganden til RANK. Imidlertid kan kombinasjonen av RANK til RANKL ikke aktiveres med mindre proteintumornekrosefaktorreseptorassosiert faktor 6 (TRAF6) ble slått sammen i den [3], etterfulgt av stimulering av nedstrøms signalveier inkludert PI3K/AKT og NF-KB. Og til slutt ble uttrykkene for den nukleære faktoren til aktiverte T-celler c2 (NFAT2) og c-Fos regulert [4] for å modulere differensieringen av osteoklasten så vel som benresorpsjon. Dermed ble faktorene og regulatorene som er direkte eller indirekte relatert til aktivering og differensiering av osteoklast antatt som avgjørende mål for å forhindre bentap.

Det er faktisk noen kliniske og syntetiske hormonbehandlingsmedisiner som østradiolvalerat som er effektive i behandlingen av postmenopausal osteoporose. Dessverre økte noen av disse risikoen for alvorlige kreftformer inkludert bryst- og endometriekreft [5], noe som begrenset deres kliniske anvendelser.

Derfor er det nødvendig å velge andre alternativer med både effekt og minimale bivirkninger. Tradisjonelle kinesiske medisiner (TCM), så vel som de isolerte bioaktive forbindelsene og fraksjonene [6–9], ble bevist effektive på ulike plager inkludert postmenopausal osteoporose. Blant disse bioaktive komponentene og fraksjonene ble fenyletanoidglykosid (PhG) forbindelser med potensiell effekt antatt som lovende midler for behandling av osteoporose [10–12]. Strukturene til PhG består av kanelsyreaglykon, en hydroksylfenyletylgruppe som er kombinert med -glukopyranose, apiose, galaktose, rhamnose eller xylose via en glykosidbinding. De finnes mye i medisinske arter av slekten Cistanche [13]. Cistanche deserticola YC Ma er en offisiell TCM som er registrert i kinesisk farmakope, og i tillegg til å være en viktig TCM [14], er C deserticola også en antialdrende styrkende urt med få bivirkninger som har blitt utviklet til medisinsk brennevin og ernæringsvæske godkjent av Statens Food and Drug Administration.

Basert på registreringen av kinesisk farmakope, hadde C. deserticola tradisjonelt blitt brukt av innfødte til å håndtere problemer med nyreessensmangel som muskelsvikt og lumbal svakhet, og fenylethanoidglykosidforbindelser inkludert echinacoside og acteosid er de viktigste bioaktive bestanddelene i denne urten. I følge TCM-teorien om "nyre-styre-bein" styres beinsystemet av nyreessens [15], og beinrelaterte problemer som osteoporose kan utvinnes av urter eller forbindelser som har aktiviteten til å nære nyreessensen. Derfor antok vi at den totale fenyletanoidglykosidfraksjonen isolert fra C. deserticola, i det minste delvis, var gunstig i behandlingen av osteoporose. Det nåværende eksperimentet ble derfor utviklet for å validere hypotesen vår ved å bruke en ovariektomisert (OVX) rottemodell; i tillegg til benresorpsjons- og dannelsesmarkørene som må estimeres, ble antioksidasjonsindeksen, samt RANKL/RANK/TRAF6--induserte PI3K/AKT- og NF-KB-signalveier, også brukt for å undersøke hovedmekanismene til antiosteoporotisk bioaktivitet

2. Materialer og metode

2.1. Plantematerialer og forberedelse. Totalt 30 kg stilker av Cistanche deserticola YC Ma ble samlet inn fra Yongning County i september 2015 med koordinatene 106.026597 og 38.262816, Ningxia-provinsen, Kina. Urten ble identifisert av Dr. Lin Dong (Department of Pharmacognosy, Ningxia Medical University), og en tilsvarende prøve (#20150901) ble bevart i Department of Pharmaceutical Analysis.

Først ble 30.0 kg pulverisert C. deserticola ekstrahert ved å bruke refluksmetoden med 70 prosent etanol som løsningsmiddel; forholdet mellom materiale og løsningsmiddel ble satt til 1:10, og tilbakeløpstiden var 2 timer i 3 ganger. Deretter ble alle filtratene kombinert og kondensert under redusert trykk ved 60 grader C. For det andre ble AB-8 makroporøse harpikskolonner brukt for den foreløpige separasjonen, og forskjellige forhold av etanol i vann ({ {34}} prosent, 20 prosent, 30 prosent, 40 prosent, 50 prosent og 60 prosent, hver 60 L) ble brukt for eluering. For det tredje ble 40 prosent og 50 prosent elueringsmidler kombinert og ytterligere renset ved å bruke gjentatte AB-8 makroporøse harpikskolonner med elueringsmidler på 0 prosent, 20 prosent, 30 prosent, 40 prosent og 50 prosent etanol i vann, og hver eluent var 12 1. Til slutt ble 40 prosent fraksjonen samlet og kondensert under redusert trykk for å oppnå 150 g blekgult sediment fenylethanoid glykosid fraksjon av C. deserticola (CDP, utbyttet var 0,5 prosent). For in vivo-eksperimenter ble 0,5 prosent CMC-Na-løsningsmiddel anvendt for å oppløse CDP; oral administrering til dyr ble satt til 1 ml/100 g kroppsvekt; for in vitro Western blot-analyse ble CDP oppløst med DMSO og deretter fortynnet med DMEM for å oppnå sluttkonsentrasjonene på 0,1 mg/ml, 0,01 mg/ml og 0,001 mg/ml.

2.2. Kjemikalier og løsemidler. Estradiol valerat (EV) var fra Delpharm Lille SAS, Frankrike; alkalisk fosfatase (ALP), ben-gla-protein (BGP), tartrat-resistent sur fosfatase (TRAP) og deoksypyridinolin (DPD) tverrbinding ELISA-sett fra Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, Kina, 201605; malondialdehyd (MDA, 20181221), superoksiddismutase (SOD, 20121218) og glutation (GSH, 20181221) reagenssett fra Institute of Nanjing Jiancheng Biological Engineering, Nanjing, Kina; Intakt parathormon (l-PTH, NEWASHE7UZ), kalsitonin (2L9ISN7AIU) og østrogen-relatert reseptor alfa (ERR , Y3AY8QEWB3) kryssbinder ELISA-sett fra Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, Kina; cathepsin K ELISA-reagenssett fra BioVision, America, 1l300141; primære antistoffer av RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κBp65 (AH04138226), PI31pha1fa p690 alfa p690 AKT 1 (AF05173234), -aktin (17AV0411), og sekundære antistoffer av pepperrotperoksidase-konjugert geit-antikanin-IgG fra ZSGB-BIO, Kina, 136080; totalt BCA-proteinanalysesett og det kommersielle settet for påvisning av osteoklastdannelse og føtalt bovint serum og Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) fra HyClone, Logan, UT, USA; polyvinylidenfluorid (PVDF) membran fra Millipore Life Sciences, Billerica, MA, USA; penicillin og streptomycin fra Gibco, Rockville, MD, USA. Alle de andre kjemiske midlene som ble brukt var av AR-grad.

2.3. HPLC-kvantifisering av CDP. Et Agilent 1220 HPLC-instrument ble brukt for å identifisere og kvantifisere sammensetningen av CDP. Kromatografibetingelsene var som følger: C18-kolonne (TSK-GEL, 4 6 I d × 250 mm, 5 μm); gradienteluering inneholdt løsningsmidler A (acetonitril) og B (vann som inneholder 0,5 prosent eddiksyre) (0-10 min: 17-20 prosent A; 10-30 min: 20-25 prosent A; og 30-40 min: 25-30 prosent A); deteksjonsbølgelengden var 333 nm; omgivelsestemperatur; strømningshastigheten var 1,0 ml/min; prøveinjeksjonsvolumet var 5 μL. Åtte PhG-forbindelser, nemlig cistanosid F, echinacosid, 6'-acetylacteosid, cistanosid C, cistanosid A, acteosid, 2'-acetylacteosid og isoacteosid, ble identifisert; ved å bruke de tilsvarende referansestoffene og en ekstern standardmetode, ble innholdet av de ovennevnte 8 PhG-ene kvantifisert ved HPLC-analyse (Figur 1).

2.4. Dyreforsøksprotokoll. Totalt 60 voksne Sprague-Dawley-rotter i alderen 3 måneder ble hentet fra dyretestsenteret ved Ningxia Medical University, med en gjennomsnittlig kroppsvekt på ca. 234 ± 25 g. Rottene ble holdt i et standard spesifikt patogenfritt miljø for å akklimatisere seg i 1 uke. Deretter ble alle rottene bedøvet (kloralhydrat, 100 mg/kg, ip) bare eller sham ovariektomisert (SHAM), eller to eggstokker ble begge fjernet og deretter tilfeldig delt inn i 5 undergrupper: oralt behandlet med bærer (0,5 prosent CMC- Na) ble satt som modellgruppe (OVX), østradiolvalerat (1 mg/kg/dag) som positiv gruppe (EV), og 60, 120 og 240 mg/kg/dag av CDP som lav (CDPL), henholdsvis moderate (CDPM) og høye (CDPH) doseringsgrupper. Alle rottene ble administrert oralt daglig og varte i 3 måneder med dosen justert hver 2. uke som var avhengig av endringen i hele kroppsvekten. På den siste dagen av dyreforsøket ble 24-timers urin oppnådd ved å bruke metabolske bur; serum ble samlet fra lårbensarterien til bedøvede rotter; høyre femora, tibia og alle organene ble dissekert og lagret ved -80 grad C for videre analyse. Dyreforsøkene vi utførte ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Ningxia Medical University.

2.5. Benmineraltetthetsbestemmelse og mikro-CT-analyse. For det første ble en dual-energy røntgen absorptiometri maskin (Lunar, USA) brukt for å estimere den totale beinmineraltettheten til høyre femur til hver rotte; for det andre ble den samme lårbenet brukt til å estimere 3D-bildet av trabekulær beinmikroarkitektur ved å bruke et mikro-CT-skannerapparat (GE, Amerika). Den isotropiske oppløsningen ble satt til 14 μm for å oppnå et ideelt 3D-bilde; regionen av interesse (ROI) ble valgt ved å sette de samme koordinatene i vekstplaten til femur i hver prøve; og benmorfometriske parametere inkludert trabekulær separasjon (Tb. Sp), trabekulært antall (Tb. N), trabekulær tykkelse (Tb. Th), benmineralinnhold (BMC), vevsmineraltetthet (TMD) og vevsmineralinnhold (TMC) ) ble oppnådd ved å analysere ROI.

2.6. Serum og urin biokjemisk analyse. Aktivitetene til serum cathepsin K, TRAP, SOD og GSH samt innholdet av serum PTH, calcitonin, ERR , MDA, BGP og urin DPD ble bestemt ved å bruke tilsvarende reagenssett i henhold til produsentens instruksjoner, og nivået av alkalisk fosfatase (ALP) og innholdet av serum- og urinkalsium (Ca) og fosfor (P) ble estimert ved å bruke en automatisk maskin (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, USA).

2.7. Western blot-analyse. Osteoklaster ble indusert ved å bruke RAW 264.7-celler tilsatt makrofagkolonistimulerende faktor (MCSF) og RANKL. Kort fortalt ble 1 × 107 RAW 264.7-celler dyrket i en 6-brønnplate i nærvær av 30 ng/mL MCSF og 25 ng/mL RANKL. Etter 6 dagers induksjon ble de modne osteoklastcellene identifisert ved å bruke TRAP-farget metode med det tilsvarende settet, og deretter behandlet med CDP (0.1, 0.01 og 0,001 mg/mL henholdsvis) i 24 timer; Deretter ble cellene lysert med en lyseringsbuffer inneholdende 0,5 mmol fenylmetylsulfonylfluorid, protease og fosfataseinhibitorer. Lysatet ble deretter separert ved å bruke 10 prosent SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran, som ble probet med AKT1, NF-KB-p65, RANKL, PI3Kp85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos og -actin (1 : 400) etter blokkering med 5 prosent fettfri melk i 2 timer. De samme membranene ble strippet og probet igjen med henholdsvis de ovennevnte 9 tilsvarende antistoffene, og ble deretter oppdaget av Image Lab-programvaren på slutten. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger.

2.8. Statistisk analyse. Alle data oppnådd fra in vivo og in vitro eksperimenter, beskrevet som gjennomsnitt ± SD, ble analysert ved å bruke enveis ANOVA etterfulgt av Dunnetts test (SPSS 22.0 programvare, SPSS, USA); p < 0 05 var statistisk signifikant.

2.7. Western blot-analyse. Osteoklaster ble indusert ved å bruke RAW 264.7-celler tilsatt makrofagkolonistimulerende faktor (MCSF) og RANKL. Kort fortalt ble 1 × 107 RAW 264.7-celler dyrket i en 6-brønnplate i nærvær av 30 ng/mL MCSF og 25 ng/mL RANKL. Etter 6 dagers induksjon ble de modne osteoklastcellene identifisert ved å bruke TRAP-farget metode med det tilsvarende settet, og deretter behandlet med CDP (0.1, 0.01 og 0,001 mg/mL henholdsvis) i 24 timer; Deretter ble cellene lysert med en lyseringsbuffer inneholdende 0,5 mmol fenylmetylsulfonylfluorid, protease og fosfataseinhibitorer. Lysatet ble deretter separert ved å bruke 10 prosent SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran, som ble probet med AKT1, NF-KB-p65, RANKL, PI3Kp85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos og -actin (1 : 400) etter blokkering med 5 prosent fettfri melk i 2 timer. De samme membranene ble strippet og probet igjen med henholdsvis de ovennevnte 9 tilsvarende antistoffene, og ble deretter oppdaget av Image Lab-programvaren på slutten. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger.

2.8. Statistisk analyse. Alle data oppnådd fra in vivo og in vitro eksperimenter, beskrevet som gjennomsnitt ± SD, ble analysert ved å bruke enveis ANOVA etterfulgt av Dunnetts test (SPSS 22.0 programvare, SPSS, USA); p < 0 05 var statistisk signifikant.

3. Resultater

3.1. Kjemisk sammensetning av CDP. Ved å bruke HPLC-metoden ble det funnet åtte fenyletanoidglykosidforbindelser i denne fraksjonen, som figur 1 viser. Ved å bruke standardreferanser og en ekstern standardmetode, ble forbindelsene og deres innhold identifisert og kvantifisert som følger: (1) akteosid F (3,6 prosent), (2) echinakosid (8,8 prosent), (3) cistanosid A (5.{ {11}} prosent), (4) akteosid (13,3 prosent), (5) isoakteosid (3,3 prosent), (6) akteosid C (3,6 prosent), (7) 2'-acetylakteosid (9,9 prosent), og (8) ) 6'-acetylakteosid (3,2 prosent). Det totale innholdet av disse åtte komponentene ble kvantifisert til 50,7 prosent.

3.2. Effekter av CDP på ​​beinmineraltetthet og mikroarkitektur til Trabecula. Den totale beinmineraltettheten til rottene i forskjellige undergrupper ble vist i figur 2. En synkende trend i innholdet av beinmineraltetthet ble observert hos rotter i OVX-modellgruppen, som gikk ned med nesten 12,0 prosent etter 12 uker etter operasjonen sammenlignet med rottene i SHAM-gruppen (p < 0 001). Alle de CDP-behandlede rottene viste signifikant økt bentetthet med henholdsvis 11,2 prosent, 12,0 prosent og 10,7 prosent (p < 0 01), sammenlignet med rottene i OVX-modellgruppen .

Videre, i samsvar med dataene for total beinmineraltetthet, viste mikro-CT-rekonstruksjon, samt histomorfometrisk bestemmelse av lårbenet, at rottene i OVX-gruppen viste åpenbar forverring i trabekulær arkitektur bevist av det merkbart reduserte antallet og arealet av trabecula samt markert økt Tb. Så sammenlignet med rottene i SHAM-gruppen. Behandling med CDP forhindret den OVX-induserte forverringen i trabekulær arkitektur; som figur 3 viser, BMC, TMC og Tb. N-verdiene ble betydelig økt, og arealet av Tb. Sp ble merkbart redusert, mens verdiene for TMD og Tb. De virket ikke nevneverdig påvirket av OVX-operasjonen og vår CDP-intervensjon.

3.3. Effekter av CDP på ​​urin og serum biokjemiske parametere. Som figur 4 viser, ble det påvist signifikante reduksjonstrender i urinnivået av P og seruminnhold av kalsitonin hos rotter i OVX-modellgruppen, som var nesten 30 prosent og 60 prosent mindre enn SHAM-rottene (p < 0 001 ), henholdsvis, mens ingen åpenbare økende eller synkende trender i urinnivåer av Ca og serum Ca samt serum P og serum PTH ble observert mellom OVX- og SHAM-gruppene. Behandling med CDP forhindret signifikant tap av serum P og Ca hos OVX-rotter, bevist ved at nivåene av serum P og Ca var spesielt oppregulert (p < 0 05) sammenlignet med rottene i OVX-modellgruppen. I tillegg ble økte, men ikke-statistisk signifikante trender av kalsitonin observert i både lav- og høydosegruppene av CDP sammenlignet med OVX-modellgruppen.

3.4. Effekter av CDP på ​​bendannelse og benresorpsjonsmarkører. De gunstige effektene av CDP på ​​bendannelsesindeksen så vel som hemmende påvirkninger på benresorpsjonsmarkører ble beskrevet i figur 5. Når det gjelder bendannelsesmarkørene, ble nivåene av serum-BGP nesten ikke påvirket av den ovariektomiserte operasjonen som ble påvist av ikke-signifikante endringer observert i alle behandlede grupper, mens statistisk signifikante forbedringer av serum-ALP ble oppnådd både i lave (60 mg/kg) og moderate (120 mg/kg) doser av CDP-intervensjonsgrupper sammenlignet med rottene fra SHAM-gruppen (p < 0 01). Når det gjelder benresorpsjonsindeksen, ble nivåene av serumkathepsin K og DPD samt TRAP hos rotter av OVX-modellgruppen signifikant forbedret med henholdsvis omtrent 75,0 prosent, 41,4 prosent og 21,0 prosent sammenlignet med SHAM-rottene, og når de ble behandlet med CDP, spesielt den lave dosen på 60 mg/kg, ble egenskapene til cathepsin K og DPD samt TRAP i OVX-modellgruppen spesielt hemmet med henholdsvis 67,3 prosent, 41,4 prosent og 25,9 prosent, sammenlignet med rottene i OVX-modellgruppen.

3.5. Effekter av CDP på ​​skjeden og livmoren samt hele kroppsvektene. Ikke-signifikante forskjeller i den opprinnelige helkroppsvekten til rotter ble observert før behandling i seks grupper (figur 6). Den ovariektomiserte operasjonen førte imidlertid til en betydelig økning i den endelige kroppsvekten til rotter i OVX-modellgruppen, som er nesten 36,0 prosent, mens våtvektene i livmoren og skjeden gikk drastisk ned med nesten 9{{6} }.0 prosent og henholdsvis 60,0 prosent sammenlignet med SHAM-rottene (p < 0 001). Selv om innholdet av ERR ikke viste noen signifikant forskjell mellom OVX- og SHAM-gruppene, økte alle behandlingsgruppene inkludert CDP og EV signifikant nivået av ERR. Videre, når de ble behandlet med EV, økte de ovennevnte hele kroppsvektene, samt tap av vagina og livmorvekt hos OVX-rotter ble delvis reversert (p < 0 001), men ikke påvirket av CDP-intervensjon.

3.6. Effekter av CDP på ​​nivåer av serum MDA, SOD og GSH. Det var ingen statistisk signifikant forskjell i egenskapene til serum SOD og GSH mellom SHAM- og OVX-modellgruppene; som figur 7 beskriver, kan en økende trend i GSH observeres mellom de to ovennevnte gruppene. I tillegg ble nivået av serum-MDA kraftig oppregulert med nesten 50 prosent hos rottene i OVX-modellgruppen sammenlignet med SHAM-rottene. Aktiviteten til SOD ble ikke påvirket av CDP-behandling, mens egenskapen til GSH ble betydelig forbedret ved CDP-intervensjon, og CDP reduserte nivået av MDA med 33,9 prosent og 42,4 prosent ved doser på henholdsvis 60 og 240 mg/kg ( p < 0 001).

3.7. Effekter av CDP på ​​proteinekspresjonsnivåer. Dataene våre, vist i figur 8, antydet at CDP-behandling reduserte proteinnivåene til TRAF6, RANK og RANKL signifikant sammenlignet med kontrollen. Nedstrøms signalveier inkludert NF-KB undertrykt, og PI3K/AKT ble stimulert av CDP-intervensjon, dokumentert ved uttrykket av NF-KB-p65 nedregulering, mens PI3Kp85 og AKT1 ble oppregulert. Følgelig ble ekspresjonen av NFAT2 signifikant redusert, og cFos ble økt etter behandling med CDP ved en konsentrasjon på 0.001-0.1 mg/ml. En foreslått mekanisme er beskrevet i figur 9, der CDP nedregulerte nivåene av RANKL og RANK, noe som førte til reduksjon av bindingsmengdene av denne liganden med reseptoren, og forbindelsen mellom RANKL og RANK ble ytterligere redusert ved nedregulering av TRAF6, etterfulgt av undertrykkelse av nedstrømsveiene inkludert NF-KB-banen mens PI3K/AKT-signalveien ble stimulert, noe som til slutt førte til reduksjon av NFAT2-ekspresjon og økning av c-Fos-nivået.

4. Diskusjon

Fenyletanoidglykosider er naturlig forekommende vannløselige komponenter som finnes mye i medisinplanteriket [11]. Så langt har forbindelsene av fenyletanoidglykosider tiltrukket seg flere og flere forskere på grunn av deres åpenbare rolle i å håndtere ulike menneskelige plager og abnormiteter [13]. Flere antiosteoporotiske bioaktive fraksjoner og forbindelser, inkludert polyfenol og fenyletanoidglykosider, ble identifisert og isolert fra dusinvis av naturlige medisinske urter [5, 10, 12, 16, 17]. C. deserticola er velkjent som "ørkenens ginseng" som antydet sikkerhetsprofilen til denne spiselige TCM [18, 19]. Som en generell styrkende urt og naturlig helsekost som lenge har vært brukt i asiatiske land, viste C. deserticola en gunstig funksjon for å forbedre nyrestyrken.

Det ble funnet at TCM, som tradisjonelt brukes til å styrke og beholde nyreessens, vanligvis ble brukt til å behandle osteoporose, både in vitro og in vivo publiserte data hadde bevist den antiosteoporotiske aktiviteten til C. deserticola [20–23], og fenyletanoid glykosid bestanddeler inkludert echinacoside og acteosid er de viktigste bioaktive komponentene som finnes i denne spiselige medisinplanten; alle som antydet at ikke bare echinacoside og acteosid selv, men også andre phenylethanoid glykosid komponenter inneholdt i C. deserticola ble ansett som ansvarlig for antiosteoporotic egenskapen til denne urten. I vår nåværende studie ble en gunstig sikkerhetsmakroporøs harpiks brukt for å isolere og berike fenyletanoidglykosidfraksjonen fra C. deserticola, og ved å bruke HPLC-metoden ble åtte hovedkomponenter av fenyletanoidglykosid, nemlig acteosid F, echinacoside, cistanoside A, acteosid, isoacteosid, acteosid C, 2'-acetylacteosid og 6'-acetylacteosid, ble funnet i den isolerte fenylethanoid-glykosidfraksjonen, og innholdet var 3,6 prosent, 8,8 prosent, 5,0 prosent, 13,3 prosent, 9,3 prosent, 9.3 prosent, 9.3 prosent. og 3,2 prosent. Echinacoside, en av hovedaktivitetsforbindelsene registrert i C. deserticola [14], hadde vist seg å ha antiosteoporotisk aktivitet; Imidlertid var dosen på 270 mg/kg så høy at det begrenset den videre kliniske anvendelsen [24]. I de nåværende eksperimentene ble den totale fenyletanoidglykosidfraksjonen med en lavere dose på 60-240 mg/kg kroppsvekt/- dag brukt på OVX-rotter, og innholdet av identifiserte bestanddeler var nesten 50 prosent rene i denne fraksjonen ved å bruke HPLC-metoden.

Det var velkjent at OVX kan forårsake osteoporose, og en OVX-rotte ble antatt som en klassisk og egnet modell for å simulere menneskelig postmenopausal osteoporose. Samtidig ble en signifikant reduksjon i beinmineraltetthet, trabekulær benmikroarkitektur, våtvekter i livmor og skjede, og østrogennivå, samt den åpenbare økningen i benresorpsjon og kroppsvekt, observert etter ovariektomikirurgi, hvorav i del på grunn av tap av østrogen [25]. Dataene våre har så langt tydelig vist at OVX faktisk induserte postmenopausal osteoporose og alltid er ledsaget av en kraftig nedgang i beinkvalitet, beinmikroarkitektur og våtvekter i livmor og skjede. Siden EV er et generelt hormonerstatningsmiddel som har blitt brukt i klinisk praksis, ble det brukt som en positiv kontroll i vårt in vivo-eksperiment, og økt kroppsvekt og atrofierte livmorvekter samt forringet bentetthet og trabekulær beinmikroarkitektur ble forventet reversert av EV-tilskudd.

Forskjellig fra den positive kontrollen, ble den reduserte vekten i skjeden og livmoren samt den økte helkroppsvekten hos rotter i OVX-modellgruppen ikke påvirket av CDP-behandling, noe som antydet at CDP kunne øke beindannelsen uten å indusere bivirkningene på kroppen og organisk vev i livmoren. Selv om nivåene av ERR ble betydelig oppregulert av CDP-behandling, var det akkurat som en fytoøstrogeneffekt ved at det ikke ble observert noen bivirkninger på livmor- og skjedens organiske vev. I tillegg styrket behandling av CDP signifikant beinkvaliteten hos OVX-rotter som hadde blitt dårligere ved ovariektomikirurgi.

I tillegg ble nivåene av P og Ca i urin og serum hos OVX-rotter også brukt for å reflektere den antiosteoporotiske effekten, og konsentrasjonene av Ca og uorganisk P var vanligvis avhengig av nivåene av kalsitonin og PTH [26]. I denne studien, selv om det ikke ble oppnådd signifikante synkende eller økende trender i urinutskillelsesnivået av Ca, serum P, serum Ca og PTH hos rotter fra OVX-modellgruppen, var de signifikante urinnivåene av P og kalsitonin (p < { {1}}) ble observert. I samsvar med de publiserte dataene om at østrogenmangel forårsaket av ovariektomikirurgi alltid førte til et redusert kalsitoninnivå i blodet, førte dette reduserte serumkalsitoninet til slutt til et økt PTH-nivå, der Ca ble antatt som den viktigste regulatoren av PTH-sekresjonen. Fordi konsentrasjonen av PTH ikke viste noen signifikant forskjell mellom OVX- og SHAM-gruppene i denne studien, viste nivået av Ca i både serum og urin heller ingen åpenbare endringer mellom de to gruppene ovenfor.

Imidlertid ble det oppnådd en signifikant redusert tendens på nivået av kalsitonin mellom OVX- og SHAM-gruppene, og følgelig ble innholdet av P i urinen til OVX kraftig redusert. Vi mente at dataene ovenfor kan forklare det motstridende fenomenet hvorfor utskillelsen av Ca-nivået i urin hos OVX-rotter ikke viste noen åpenbar endring sammenlignet med SHAM-rotter, og dette fenomenet kan også være relatert til den økte beinomsetningshastigheten [27] . Etter behandling med CDP ble nivåene av P og Ca i serum merkbart oppregulert, og innholdet av P i urin ble nedregulert hos OVX-rotter, noe som reflekterte at CDP ikke bare kunne forhindre utskillelse av benmineralelementer, men også øke seruminnholdet til de. elementer, og dermed indirekte undertrykke bentap.

Videre ble bendannelses- og resorpsjonsmarkørene så vel som antioksidantenzymene inkludert SOD og GSH også brukt for å forklare de underliggende antiosteoporotiske mekanismene til CDP. I likhet med de publiserte dataene, viste nivået av ALP hos rotter av OVX-modellgruppen en ikke-statistisk signifikant økende trend som indikerer en akselerert beinomsetningshastighet ved postmenopausal osteoporose [10]. Etter behandling med CDP (60, 120 og 240 mg/kg/dag) ble imidlertid egenskapen til ALP betydelig forbedret. Det var velkjent at OVX forårsaket en kraftig nedgang i østrogennivåer som vanligvis fører til en overskridelse av benresorpsjon og oksidativt stress [28], bevist av nivåene av TRAP, cathepsin K og DPD samt MDA spesielt oppregulert i rotter av OVX modellgruppe.

Imidlertid ble disse forverringene delvis forbedret av CDP-intervensjon. I tillegg viste OVX-rottebehandling med CDP (60 og 240 mg/kg) en signifikant økning i aktiviteten til GSH (p < 0 05). Resultatene ovenfor antydet at CDP viste en terapeutisk effekt på OVX-indusert osteoporose, og disse effektene var både ved å forsterke bendannelse og undertrykke benresorpsjon, samt å forbedre beinantioksidantsystemet.

Aktivering av RANK ved sin ligand RANKL stimulerte uttrykkene til NFAT2 og c-Fos via PI3K/AKT og NF-KB-signalering [29]. NF-KB ble bevist essensiell for osteoklastogenese da forstyrrelsen av NF-KB kunne føre til en svekket osteoklastdifferensiering med en osteoporotisk fenotype, og NF-KB oppregulerte c-Fos og nedregulerte NFAT2-uttrykk under RANKL/RANK/TRAF-indusert oste. For å estimere den gunstige påvirkningen av CDP på ​​NFAT2 og c-Fos-mediert osteoklastogenese, ble ekspresjonsnivåene til RANKL og RANK analysert. Forventet hemmet CDP signifikant NFAT2 og stimulerte c-Fos-nivåer ved å nedregulere uttrykkene til RANKL og RANK.

I mellomtiden manglet RANK i seg selv iboende kinase-egenskap med mindre TRAF6 ble koblet til for å utløse nedstrømssignalering [3]. CDP nedregulerte også uttrykket av TRAF6, noe som førte til at bindingsmengdene av RANKL og RANK ble betydelig redusert. En antatt antiosteoporotisk mekanisme for CDP på ​​OVX-rotter dekket signalveiene ovenfor, og regulatorer ble beskrevet i figur 9. Kort fortalt falt CDP TRAF6-, RANKL- og RANK-nivåene, og undertrykte dermed nedstrøms signalveier inkludert PI3K/AKT og NF-κB som utløses av RANKL/RANK, og reduserte til slutt uttrykkene og aktivitetene til de sentrale osteoklastogene proteinene NFAT2 og c-Fos. Derfor antydet flere ledetråder av data den gunstige effekten av CDP på ​​benmetabolismen til OVX-rotter hovedsakelig gjennom RANKL/RANK/TRAF6-mediert PI3K/AKT- og NF-KB-veier.

5. Konklusjon

Oppsummert viste de totale fenyletanoidglykosidene, isolert fra C. deserticola, betydelige fordelaktige effekter på postmenopausal osteoporose hos OVX-rotter, og det terapeutiske potensialet for å undertrykke bentap var hovedsakelig gjennom å stimulere beindannelse og hemme benresorpsjon samt å forbedre beinantioksidasjonen. system; mekanismene kan være relatert til RANKL/RANK/TRAF6-indusert NF-KB-aktivering og PI3K/AKT-inaktivering samt c-Fos-stimulering og NFAT2-undertrykkelse, og til slutt ble differensieringen av osteoklast hemmet.

Forkortelser

AKT: Proteinkinase B

ALP: Alkalisk fosfatase

BGP: Ben gla-protein

BMC: Benmineralinnhold

CDP: Fenylethanoid glykosidfraksjon av C. deserticola

CK: Cathepsin K

CT: Kalsitonin

DPD: Deoksypyridinolin

ERR : Østrogen-relatert reseptor alfa

EV: Østradiolvalerat

GSH: Glutation

l-PTH: intakt parathormon

MCSF: Makrofagekolonistimulerende faktor

MDA: Malondialdehyd

NFAT2: Nukleær faktor av aktiverte T-celler c2

NF-KB: Nukleær faktor kappa B

OPG: Osteoprotegerin

OVX: Ovariektomisert

PhGs: Fenyletanoide glykosider

PI3K: Phosphoinositide 3-kinase

RANK: Reseptoraktivator av kjernefysisk faktor kappa B

RANKL: Reseptoraktivator av kjernefaktor kappa B-ligand

ROI: Region av interesse

SOD: Superoksiddismutase

Tb. N: Trabekulært tall

Tb.Sp: Trabekulær separasjon

Tb.Th: Trabekulær tykkelse

TCM: Tradisjonell kinesisk medisin

TMC: Vevsmineralinnhold

TMD: Vevsmineraltetthet

TNF: Tumornekrosefaktor

TRAF6: Tumornekrosefaktorreseptorassosiert faktor 6

FELLE: Tartrat-resistent sur fosfatase.

Datatilgjengelighet

Dataene som brukes for å støtte funnene i denne studien er tilgjengelig fra den tilsvarende forfatteren på forespørsel.

Interessekonflikter

Forfatterne hadde ingen interessekonflikt.

Forfatteres bidrag

XM designet og overvåket eksperimentene; SD og LY utførte de fleste forsøkene og utarbeidet manuskriptet; BZ og JL utførte Western blot-analysen og deltok i dyreforsøk; YD analyserte dataene; QT og PY reviderte manuskriptet. Alle forfattere gjennomgikk manuskriptet. Lingling Yang og Shuqin Ding bidro like mye til manuskriptet.

Anerkjennelser

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Science Technology Foundation of Higher Education of Ningxia (NGY2017090), National Natural Science Foundation of China (nr. 81560684), Key Research and Development Program of Ningxia (2018BHF2001), Ningxia Key Research og Invention Program of Science and Technology Cooperation of the East and the West (nr. 2017BY084 og 2017BY079), og West Light Foundation of the Chinese Academy of Sciences-Young Scientists of West 2017.

Referanser

[1] LJ Melton III, EA Chrischilles, C. Cooper, AW Lane og BL Riggs, "Perspektiv. Hvor mange kvinner har osteoporose?," Journal of Bone and Mineral Research, vol. 7, nei. 9, s. 1005–1010, 1992.

[2] S. Schnell, SM Friedman, DA Mendelson, KW Bingham og SL Kates, "The 1-year mortality of patients treated in a hoftefracture program for elders," Geriatric Orthopedic Surgery & Rehabilitation, vol. 1, nei. 1, s. 6–14, 2010.

[3] EM Tan, L. Li, IR Indran, N. Chew og EL Yong, "TRAF6 formidler undertrykkelse av osteoklastogenese og forebygging av ovariektomi-indusert bentap ved en ny prenylflavonoid," Journal of Bone and Mineral Research, vol. 32, nei. 4, s. 846–860, 2017.

[4] JH Kim og N. Kim, "Regulering av NFATc1 i osteoklastdifferensiering," Journal of Bone Metabolism, vol. 21, nei. 4, s. 233–241, 2014.

[5] Q. Ye, XQ Ma, CL Hu et al., "Antiosteoporotisk aktivitet og bestanddeler av Podocarpium podocarpus," Phytomedicine, vol. 22, nei. 1, s. 94–102, 2015.

[6] SA Jang, HS Song, JE Kwon, et al., "Protocatechuic acid attenuates trabecular bentap in ovarectomized mus," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2018, artikkel-ID 7280342, 11 sider, 2018.

[7] AB Abdel-Naim, AA Alghamdi, MM Algandaby, et al., "Rutin isolert fra Chrozophora tinctoria forbedrer bencelleproliferasjon og ossifikasjonsmarkører," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2018, artikkel-ID 5106469, 10 sider, 2018.

[8] J. Wattanathorn, C. Thipkaew, W. Thukham-mee, S. Muchimapura, P. Wannanon og T. Tong-un, "Morinda citrifolia L. bladekstrakt beskytter mot cerebral iskemi og osteoporose i en in vivo eksperimentell modell for overgangsalder," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2018, artikkel-ID 1039364, 13 sider, 2018.

[9] S. Sungkamanee, J. Wattanathorn, S. Muchimapura og W. Thukham-mee, "Antiosteoporotisk effekt av et kombinert ekstrakt av Morus alba og Polygonum odoratum," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2014, artikkel-ID 579305, 9 sider, 2014.

[10] J. Liu, Z. Zhang, Q. Guo, Y. Dong, Q. Zhao og X. Ma, "Syringin forhindrer bentap i ovariektomiserte mus via TRAF6-mediert hemming av NF-κB og stimulering av PI3K/AKT "Fytomedisin, vol. 42, s. 43–50, 2018.

[11] CW Lu, SK Huang, TY Lin og SJ Wang, "Echinacoside, en aktiv bestanddel av Herba Cistanche, undertrykker epileptiform aktivitet i hippocampus CA3 pyramidale nevroner," The Korean Journal of Physiology & Pharmacology, vol. 22, nei. 3, s. 249–255, 2018.

[12] X. Xu, Z. Zhang, W. Wang, H. Yao og X. Ma, "Terapeutisk effekt av cistanosid A på benmetabolismen til ovariektomiserte mus," Molecules, vol. 22, nei. 2, s. 197, 2017.

[13] K. Alipieva, L. Korkina, IE Orhan og MI Georgiev, "Verbascoside – en gjennomgang av dens forekomst, (bio)syntese og farmakologisk betydning," Biotechnology Advances, vol. 32, nei. 6, s. 1065–1076, 2014.

[14] Redaksjonskomité for Chinese Pharmacopoeia, Pharmacopoeia of the People's Republic of China, China Medical Science and Technology Press, Beijing, Kina, 10. utgave, 2015.

[15] H. Zhang, WW Xing, YS Li et al., "Effekter av et tradisjonelt kinesisk urtepreparat på osteoblaster og osteoklaster," Maturitas, vol. 61, nei. 4, s. 334–339, 2008.

[16] X. Ma, J. Liu, L. Yang, B. Zhang, Y. Dong og Q. Zhao, "Cynomorium solarium forhindrer benresorpsjon hos ovariektomiserte rotter gjennom RANKL/RANK/TRAF6-mediert undertrykkelse av PI3K/AKT og NF-KB-veier," Life Sciences, vol. 209, s. 140–148, 2018.

[17] XQ Ma, T. Han, X. Zhang, et al., "Kaempferitrin forhindrer bentap hos ovariektomiserte rotter," Phytomedicine, vol. 22, nei. 13, s. 1159–1162, 2015.

[18] PL Liao, CH Li, LS Tse, JJ Kang og YW Cheng, "Sikkerhetsvurdering av Cistanche tubulosa helsekostprodukt Memoregain®: genotoksisitet og 28-dag gjentatt dose toksisitetstest," Food and Chemical Toxicology , vol. 118, s. 581–588, 2018.

[19] CC Wong, HB Li, KW Cheng og F. Chen, "En systematisk undersøkelse av antioksidantaktiviteten til 30 kinesiske medisinske planter ved bruk av jernreduserende antioksidantkraftanalyse," Food Chemistry, vol. 97, nei. 4, s. 705–711, 2006.

[20] D. Song, Z. Cao, Z. Liu, et al., "Cistanche deserticola polysaccharide attenuates osteoclastogenese and benresorption via inhibering RANKL signaling and reactive oxygen species production," Journal of Cellular Physiology, vol. 233, nr. 12, s. 9674–9684, 2018.

[21] HD Liang, F. Yu, ZH Tong, HQ Zhang og W. Liang, "Cistanches Herba vandig ekstrakt som påvirker serum BGP og TRAP og benmarg Smad1 mRNA, Smad5 mRNA, TGF- 1 mRNA og TIEG1 mRNA uttrykksnivåer i osteoporosesykdom," Molecular Biology Reports, vol. 40, nei. 2, s. 757–763, 2013.

[22] TM Li, HC Huang, CM Su et al., "Cistanche deserticola-ekstrakt øker beindannelse i osteoblaster," Journal of Pharmacy and Pharmacology, vol. 64, nei. 6, s. 897–907, 2012.

[23] H. Liang, F. Yu, Z. Tong og Z. Huang, "Effect of Cistanches Herba aqueous extract on bone loss in ovariektomized rotte," International Journal of Molecular Sciences, vol. 12, nei. 8, s. 5060–5069, 2011.

[24] F. Li, X. Yang, Y. Yang, et al., "Antiosteoporotisk aktivitet av echinacoside i ovariektomiserte rotter," Phytomedicine, vol. 20, nei. 6, s. 549–557, 2013.

[25] H. Nian, MH Ma, SS Nian og LL Xu, "Antiosteoporotisk aktivitet av icariin i ovariektomiserte rotter," Phytomedicine, vol. 16, nei. 4, s. 320–326, 2009.

[26] SR Fahmy, AM Soliman, AA Sayed og M. Marzouk, "Mulig antiosteoporotisk mekanisme for Cicer arietinum-ekstrakt i ovariektomiserte rotter," International Journal of Clinical and Experimental Pathology, vol. 8, nei. 4, s. 3477–3490, 2015.

[27] R. Swaminathan, "Biokjemiske markører for beinomsetning," Clinica Chimica Acta, vol. 313, nr. 1-2, s. 95–105, 2001.

[28] S. Muthusami, I. Ramachandran, B. Muthusamy, et al., "Ovariektomi induserer oksidativt stress og svekker beinantioksidantsystemet hos voksne rotter," Clinica Chimica Acta, vol. 360, nei. 1-2, s. 81–86, 2005.

[29] WJ Boyle, WS Simonet og DL Lacey, "Osteoklastdifferensiering og aktivering," Nature, vol. 423, nr. 6937, s. 337–342, 2003.

For more information:1950477648nn@gmail.com