Bioaktive bestanddeler fra kinesiske naturmedisiner. XXXVI.1) Fire nye acylerte fenyletanoid-oligoglykosider, kankanosider J1, J2, K1 og K2, fra stammer av Cistanche Tubulosa

Yingni PAN, Toshio MORIKAWA, Kiyofumi NINOMIYA, Katsuya IMURA, Dan YUAN, Masayuki YOSHIKAWA og Osamu MURAOKA

Pharmaceutical Research and Technology Institute, Kinki University; 3–4–1 Kowakae, Higashi-Osaka, Osaka 577–8502, Japan: School of Traditional Chinese Medicine, Shenyang Pharmaceutical University; 103 Wenhua Rd., Shenyang 110016, Folkerepublikken Kina: og Kyoto Pharmaceutical University; Misasagi, Yamashina-Ku, Kyoto 607–8412, Japan. Mottatt 28. november 2009; akseptert 2. februar 2010; publisert på nett 4. februar 2010

Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com

Abstrakt

Fire nye acylerte fenyletanoid-aminoglykosider, kankanosidene J1 (1), J2 (2), K1 (3) og K2 (4), ble isolert fra stammer avCistanchetubulosa(Orobanchaceae) sammen med isocampneosid I (5). Strukturene deres ble belyst basert på kjemiske og fysisk-kjemiske bevis. Blant dem ble 3-5 funnet å hemme D-galaktosamin-indusert cytotoksisitet i primære dyrkede musehepatocytter.

Cistanchetubulosa har mange effekter, klikk her for å vite mer

Nøkkelord:Cistanchetubulosa; Lankisk side; fenyletanoid glykosid; Orobanchaceae; hepatobeskyttende aktivitet.

Under våre studier på bioaktive bestanddeler fra kinesiske naturmedisiner,1–3) fant vi at metanolekstrakt av tørkede stengler avCistanchetubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) viste vasorelakserende 4) og hepatobeskyttende aktiviteter.1) Fra de tørkede stilkene til C.tubulosa, fem iridoider, kankanosidene A—D og kankanol, et monoterpenglykosid, kankanosid E, to fenyletanoide aminoglykosider, kankanosidene F og G, og et acylert oligosukker, kankanose, ble isolert sammen med 30 kjente bestanddeler.4,5) Nylig, i tillegg isolerte 19 fenyletanoid-aminoglykosider inkludert kankanosidene H1, H2 og I 1) og to acylerte oligosukker fra ferske stammer av C. tubulosa. 1) Videre ble hovedfenyletanoidglykosider, echinakosid, akteosid og isoakteosid, funnet å hemme økningen i serumaspartataminotransferase (sAST) og alaninaminotransferase (sALT) nivåer i leverskadde mus indusert av D-galaktosamin (D-Galaktosamin) lipopolysakkarid i doser på 25–100 mg/kg per os (po), og strukturelle krav til fenyletanoidglykosider for den hepatobeskyttende aktiviteten ble belyst.1) Som en kontinuerlig studie på bestanddeler fra de friske stilkene til C.tubulosaisolerte vi ytterligere fire nye acylerte fenyletanoide oligoglykosider, kankanosidene J1 (1), J2 (2), K1 (3) og K2 (4). Denne oppgaven tar for seg isolasjon og strukturbelysning av 1–4.

Friske stilker av C.tubulosa(dyrket i Urumqi, Xinjiang-provinsen, Kina) ble ekstrahert med metanol under tilbakeløp for å gi et metanolisk ekstrakt (8,36 prosent fra de friske stilkene). Fra det metanoliske ekstraktet ble H2O- og MeOH-eluerte fraksjoner (henholdsvis 5,63 prosent og 2,73 prosent) oppnådd ved Diaion HP-20 kolonnekromatografi (H2O→MeOH) som beskrevet tidligere.1) Ved de intensive kromatografiene på den MeOH-eluerte fraksjonen, fire nye fenyletanoide oligoglykosider, kankanosider J1 (1, 0.0002 prosent ), J2 (2, 0 0,0002 prosent), K1 (3, 0,0002 prosent) og K2 (4, 0,0005 prosent) sammen med isocampneosid I6) (5, 0,0006 prosent) ble isolert.

Strukturer av kankanosidene J1 (1) og J2 (2) Kankanoside J1 (1) ble oppnådd som et hvitt pulver med negativ optisk rotasjon ([a]D 25 - 6,5 grader i MeOH). IR-spekteret på 1 viste absorpsjonsbånd ved 3414, 1734, 1719, 1701, 1638, 1508, 1159, 1067 og 1046 cm- 1 som kan tilskrives hydroksyler, ester karbonyler, eterfunksjoner og aromatiske ringer. De positive- og negative-ion FAB-MS-spektrene på 1 viste kvasimolekylære ionetopper ved m/z 719 (M-Na) og m/z 695 (MH), og molekylformelen ble bestemt som C32H40O17 ved høyoppløselig positiv- ion FAB-MS måling. 1H- og 13C-NMR-spektrene til 1 (CD3OD, tabell 1, 2), som ble tildelt ved forskjellige NMR-eksperimenter,7) viste signaler som kunne tilordnes en metoksygruppe [d 3,21 (3H, s, 7- OCH3)], en metylen og et metin som har en oksygenfunksjon [d 3,58, 4.00 (1H hver, begge m, 8-H2), 4.18 (1H, dd-lignende, J ca. 4, 8 Hz, 7-H)], orto- og metakoblede aromatiske protoner av ABC-type [d 6,63 (1H, dd, J 1,8, 8,2 Hz, 6-H), 6,74 (1H) , d, J 1,8 Hz, 2-H), 6,74 (1H, d, J 8,2 Hz, 5- H)], en bD-glukopyranosyldel [d 4,54 (1H, d, J 7,8 Hz) , Glc-1-H)], og en aL-rhamnopyranosyldel [d 1,07 (3H, d, J 6,4 Hz, Rha-6-H3), 4,80 (1H, br s, Rha{103} }H)] sammen med en acetylgruppe [d 2.00 (3H, s)] og en trans-kaffeoylgruppe {en trans-olefifin [d 6.26, 7.59 (1H hver, begge d, J{{ 114}},0 Hz, 8-, 7-H)] og orto- og metakoblede aromatiske protoner av ABC-typen [d 6,77 (1H, d, J 8,2 Hz, 5- H), 6,95 (1H, dd, J- 1,8, 8,2 Hz, 6-H), 7,04 (1H, d, J 1,8 Hz, 2-H)]}. 1H- og 13C-NMR-spektrene på 1 kunne legges over de til campneosid I1,8—10) (6), bortsett fra signalene som skyldes acetylgruppen. Forbindelsene til aminoglykosid- og acyldelene i 1 ble bekreftet av eksperimentet med heteronukleær multiple bond correlation (HMBC), som viste langdistanse-korrelasjoner mellom følgende proton- og karbonpar: 7-OCH3 og 7-C ( dC 83,3); Glc-1-H og 8-C (dC 74,1); Glc-2-H [d 4,91 (1H, dd, J- 7,8, 9,2 Hz)] og acetylkarbonylkarbonet (dC 171,4); Glc-4-H [d 4,99 (1H, dd, J 9,2, 9,6 Hz)] og trans-kaffeoylkarbonylkarbonyl (dC 168,1); og Rha-1-H og Glc-3-C (dC 80,5) (fig. 1). Til slutt frigjorde alkalisk hydrolyse av 1 med 5 prosent kaliumhydroksid (KOH) trans-koffeinsyre, som ble identifisert ved HPLC-analyse, sammen med et deacylert produkt. Det deacylerte produktet ble suksessivt behandlet med 1,0 M saltsyre (HCl) for å frigjøre L-rhamnose og D-glukose, som ble identifisert ved HPLC-analyse ved bruk av en optisk rotasjonsdetektor.1—5) Dermed ble strukturen til kankanosid J1 belyst til å være 2-metoksy-2-(3,4-dihydroksyfenyl)etyl OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-2-O-acetyl-4-O-trans- caffeoyl-bD-glukopyranosid (1).

Kankanoside J2 (2) ble isolert som et hvitt pulver med negativ optisk rotasjon ([a]D 25 - 18.1 grad i MeOH). Ved høyoppløselig, positiv-ion FAB-MS-måling, ble molekylformelen til 2 funnet å være den samme som for 1. 1H- og 13C-NMR-dataene til 2 (CD3OD, tabell 1, 2) var svært lik de til 1, bortsett fra signalene som skyldes etylbroen til aglykondelen {en metoksygruppe [d 3,24 (3H, s, 7-OCH3)], en metylen [d 3,63 (1H, m) , 3,83 (1H, dd, J- 3.2, 11.0 Hz), 8-H2] og et metin som bærer en oksygenfunksjon [d 4.22 (1H, dd, J{ {38}}.2, 8.2 Hz, 7-H)]}. Alkalisk hydrolyse av 2 med 5 prosent KOH frigjorde trans-koffeinsyre sammen med et deacylert produkt, og det deacylerte produktet ble suksessivt behandlet med 1.0 M HCl for å frigjøre L-rhamnose og D-glukose. Som vist i fig. 1 ble de samme langdistansekorrelasjonene som i tilfelle 1 observert i HMBC-eksperimentet. Følgelig ble den plane strukturen til kankanosid J2 (2) avslørt å være den samme som den til 1, og ble belyst å være 7-isomer av 1. 11)

Strukturer av kankanosidene K1 (3) og K2 (4) Kankanosidene K1 (3) og K2 (4), C36H48O21, ble også oppnådd som hvite pulvere med negative optiske rotasjoner (3: [a]D 25 - 75,3 grader ; 4: [a]D 25 - 7,4 grader begge i MeOH). 1H- og 13C-NMR-spektrene til 3 og 4 (CD3OD, tabell 1, 2) viste signaler som kan tilordnes en metoksygruppe [3: d 3,23 (3H, s, {{30}} OCH3) ; 4: d 3,25 (3H, s, 7-OCH3)], en metylen og metin som bærer en oksygenfunksjon {3: d [3,62 (1H, dd, J- 3.4,11.{{ 52}} Hz), 4.{{70}}2 (1H, dd, J- 8.1, 11.0 Hz), 8-H2] , 4,34 (1H, dd, J- 3,4, 8,1 Hz, 7-H); 4: d [3,72 (1H, dd, J- 9.1, 11.{{110}} Hz), 3.84 (1H, dd, J- 3.1, 11.0 Hz), 8-H2], 4,37 (1H, dd, J- 3,1, 9,1 Hz, 7-H)}, orto- og metakoblede aromatiske protoner av ABC-type [ 3: d 6,68 (1H, dd, J- 2,0, 8,1 Hz, 6-H), 6,76 (1H, d, J- 8,1 Hz, 5- H), 6,80 (1H, d, J- 2,0 Hz, 2-H); 4: d 6,67 (1H, dd, J- 1,9, 8,2 Hz, 6-H), 6,76 (1H, d, J- 8,2 Hz, 5- H), 6,78 (1H, d, J- 1,9 Hz, 2-H)], to bD-glukopyranosylgrupper [3: d 4,31 (1H, d, J- 7. 9 Hz, terminal-Glc-1-H), 4,40 (1H, d, J- 7,9 Hz, indre-Glc-1-H); 4: d 4,26 (1H, d, J- 7,7 Hz, terminal-Glc-1-H), 4,44 (1H, d, J- 7,9 Hz, indre-Glc{ {164}}H)], og en aL-rhamnopyranosyldel [3: d 1,08 (3H, d, J 6,4 Hz, Rha-6-H3), 5,19 (1H, d, J- 1. 7 Hz, Rha-1-H); 4: d 1,08 (3H, d, J- 6,2 Hz, Rha-6-H3), 5,20 (1H, d, J- 1,6 Hz, Rha-1- H)] sammen med en trans-kaffeoylgruppe {en trans-olefifin [3: d 6,27, 7,60 (1H hver, begge d, J- 15.8 Hz, 8-, 7- H); 4: d 6,28, 7,60 (1H hver, begge d, J- 15,8 Hz, 8-, 7-H)] og orto- og metakoblede aromatiske protoner av ABC-type [ 3: d 6,78 (1H, d, J- 8,3 Hz, 5-H), 6,96 (1H, dd, J- 1,9, 8,3 Hz, 6- H), 7,05 (1H, d, J- 1,9 Hz, 2-H)]; 4: d 6,78 (1H, d, J- 8,4 Hz, 5-H), 6,96 (1H, dd, J- 1,9, 8,4 Hz, 6- H), 7,05 (1H, d, J- 1,9 Hz, 2-H)}. Proton- og karbonsignalene i 1H- og 13C-NMR-spektrene på 3 og 4 kunne legges over signalene til echinacoside, 1,4,12) bortsett fra signalene på grunn av 7-metoksygruppen. Forbindelsene til trans-kaffeoylgruppen og glykosyldelene i 3 og 4 ble belyst på grunnlag av HMBC-eksperimenter som vist i fig. 1. Til slutt ga alkalisk hydrolyse av 3 og 4 med 5 prosent KOH de deacylerte produktene sammen med trans -koffeinsyre. Disse deacylerte produktene ble suksessivt behandlet med 1,0 M HCl for å frigjøre henholdsvis L-rhamnose og D-glukose. Følgelig ble strukturen til kankanosidene K1 og K2 bestemt til å være 2-metoksy-2-(3,4-dihydroksyfenyl)etyl OaL-rhamnopy-ranosyl-(1→3)-[bD -glucopyranosyl-(1→6)]-4-O-trans-caf-feel-bD-glucopyranosid (3 og 4).11,13)

akteosidicistanchehar mange effekter på hukommelsen

Tidligere har metanolisk ekstrakt fra stilker av C.tubulosaog flere fenyletanoid-bestanddeler som echinacoside,akteosid, ogisoakteosidble funnet å vise hepatobeskyttende effekter på D-galaktosamin (D-GalN)/lipopolysakkarid-indusert leverskade hos mus og hemmende effekt på D-GalN-indusert cytotoksisitet i primære dyrkede musehepatocytter.1) Vi undersøkte videre hemmende effekter av kankanosidene K1 ( 3) og K2 (4), og isocampneosid I (5) på D-GalN-indusert cytotoksisitet i primære dyrkede hepatocytter. Selv om aktivitetene deres var svakere enn de for echinacoside (IC50 10,2 mM),akteosid(4,6 mM), og isoacteosid (5,3 mM), de viktigste fenyletanoid-bestanddelene fra stammer av C. tubulosa, 1) 3-5 viste moderat aktivitet.14)

Eksperimentell

Følgende instrumenter ble brukt for å innhente spektrale og fysiske data: spesifikke rotasjoner, Horiba SEPA-300 digital polarimeter (l- 5 cm); UV-spektre, Shimadzu UV-1600-spektrometer; IR-spektre, Shimadzu FTIR-8100-spektrometer; 1H- og 13C-NMR-spektre, JEOL JNM-ECA600 (600, 150 MHz) og JEOL JNM-ECS400 (400, 100 MHz) spektrometre med tetrametylsilan som intern standard; FAB-MS og høyoppløselig FAB-MS, JEOL JMS-SX 102A massespektrometer; HPLC-detektor, Shimadzu RID-10A brytningsindeks, Shimadzu SPD-10A UV–VIS og Shodex OR-2 optiske rotasjonsdetektorer. HPLC-kolonne, Cosmosil 5C18-MS-II og pNAP (Nacalai Tesque Inc., 250 4,6 mm id) og (250 20 mm id) kolonner ble brukt til henholdsvis analytiske og forberedende formål.

akteosidicistanchehar god effekt på nyrene

Følgende eksperimentelle forhold ble brukt for kromatografi: normalfase silikagelkolonnekromatografi (CC), silikagel 60N (Kanto Chemical Co., Ltd., 63—210 mesh, sfærisk, nøytral); omvendt fase silikagel CC, Diaion HP-20 (Nippon Rensui) og Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silesia Chemical, Ltd., 100–200 mesh); normalfase TLC, forhåndsbelagte TLC-plater med silikagel 60F254 (Merck, 0,25 mm); omvendt fase TLC, forhåndsbelagte TLC-plater med silikagel RP-18 F254S (Merck, 0,25 mm); omvendt fase HPTLC, forhåndsbelagte TLC-plater med silikagel RP-18 WF254S (Merck, 0,25 mm), påvisningen ble oppnådd ved å spraye med 1 prosent Ce(SO4)2–10 prosent vandig H2SO4, etterfulgt av oppvarming .

Plantemateriale

Dette elementet ble beskrevet i en tidligere rapport.1)

Ekstraksjon og isolasjon

Friske stilker av C.tubulosa(2,98 kg) ble finskåret og ekstrahert tre ganger med metanol under tilbakeløp i 3 timer. Fordampning av løsningsmidlet under redusert trykk ga en metanolisk ekstrakt (249,1 g, 8,36 prosent). Metanolekstraktet ble utsatt for Diaion HP- 20 CC (5,0 kg, H2O→MeOH) for å gi H2O- og MeOH-eluerte fraksjoner (167,84 g, 5,63 prosent og 81,21 g, 2,73 prosent, henholdsvis). Den MeOH-eluerte fraksjonen (61,00 g) ble utsatt for normalfase silikagel CC [1,8 kg, CHCl3–MeOH–H2O (15 : 3 : 0.4→1{{36 }} : 3 : 0.5→6 : 4 : 1, v/v/v)→MeOH] for å gi syv fraksjoner [Fr. 1 (1,12 g), 2 (9,56 g), 3 ({{1{{109}}4}},89 g), 4 (1{{12{{130 }}}}.69 g), 5 (8.84 g), 6 (12.52 g) og 7 (4.60 g)], som beskrevet tidligere.1) Fraksjonen 4 (1{{167} },69 g) ble separert med reversfase silikagel CC [500 g, MeOH–H2O (30: 70, v/v) →MeOH→aceton] for å gi fire fraksjoner [Fr. 4-1 (878,2 mg), 4-2 (7.06 g), 4-3 (1,57 g) og {{8{{2{{2{{251 }}7}}2}}}} (792,8 mg)]. Fraksjonen 4-3 (1,57 g) ble renset ved HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 prosent vandig AcOH (20: 80, v/ v)] for å gi 11 fraksjoner {Fr. 4-3-1 (30,4 mg), 4-3-2 (55,2 mg), 4-3- 3 [ campneosid I (6, 22,1 mg, 0,0010 prosent )], 4-3-4 [ acteosid (224,6 mg, 0,010 prosent )], 4-3-5 (27,4 mg), 4-3-6 (43,6 mg), 4-3-7 [ isoacteosid (825,0 mg, 0,037 prosent )], 4-3-8 [ syringalid A 3 -OaL-rhamnopyranosid (37,6 mg, 0,0017 prosent )], 4-3-9 (39,8 mg), 4-3-10 [ 2 -acetylakteosid (85,4 mg, 0,0038 prosent )], og 4-3-11 (64,6 mg)}, som beskrevet tidligere.1) Fraksjonen 4-3-5 (27,4 mg) ble ytterligere renset ved HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 prosent vandig AcOH (18 : 82, v/v)] til gi isocampneosid I (5, 8,5 mg, 0,0004 prosent). Fraksjonen 4-3-6 (43,6 mg) ble ytterligere renset ved HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 prosent vandig AcOH (18:82, v/v)] for å gi 5 (3,7 mg, 0,0002 prosent) sammen med kankanosider H 1 1) (17,0 mg, 0,0008 prosent) og H2 1) (3,3 mg, 0,0001 prosent). Fraksjonen 4-3-9 (39,8 mg) ble ytterligere renset ved HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 prosent vandig AcOH (18 : 82, v/v)] for å gi kankanosider J1 (1, 3,7 mg, 0,0002 prosent) ) og J2 (2, 3,5 mg, 0,0002 prosent) for sammen med kankanosid I1) (15,4 mg, 0,0007 prosent) og isoacteosid1) (3,1 mg, 0,0001 prosent). Fraksjon 5 (8,84 g) ble separert med revers-fase silikagel CC [400 g, MeOH–H2O (20 : 80 → 30 : 70, v/v) → MeOH → aceton] for å gi syv fraksjoner [Fr. 5-1 (870,2 mg), 5-2 (478,9 mg), 5-3 (3,72 g), 5-4 (979,9 mg), 5-5 (1,19 g), 5-6 (1,27 g) og 5-7 (130,1 mg)]. Fraksjonen 5-3- 4 (72,3 mg) ble ytterligere renset ved HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 prosent vandig AcOH (10:90, v/v)] for å gi kankanosidene K1 (3, 5,1 mg, 0,0002 prosent) og K2 (4, 10,6 mg, 0,0005 prosent) sammen med campneosid II1) (7, 10,6 mg, 0,0005 prosent).

akteosidicistanchekan behandlenyresykdom forbedresnyrefunksjon

Alkalisk og sur hydrolyse av kankanosidene J1 (1), J2 (2), K1 (3) og K2 (4)

Løsninger på 1–4 (hver 1,0 mg) i 5 prosent vandig kaliumhydroksid (KOH, 0,5 ml) ble omrørt ved 40 grader i 1 time. Hver løsning ble nøytralisert med Dowex HCR W2 (H-form), og harpiksen ble fjernet ved filtrering. Fordampning av løsningsmidlet fra filtratene under redusert trykk ga de tilsvarende deacylerte produktene, som ble underkastet HPLC-analyse [kolonne: Cosmosil pNAP, 250-4.6 mm id; mobil fase: CH3CN–1 prosent vandig AcOH (15:85, v/v); deteksjon: UV (254 nm); stipendhastighet: 1.0 ml/min] for å gi trans-koffeinsyre (tR 9,9 min fra 1–4). Deretter ble hver oppløst i 1,0 M HCl (1,0 ml) og oppvarmet til 80 grader i 3 timer. Etter å ha blitt avkjølt ble reaksjonsblandingen nøytralisert med Amberlite IRA-400 (OH-form), og harpiksene ble fjernet ved filtrering. Etter fjerning av løsningsmidlet under redusert trykk, ble resten separert av Sep-Pak C18 patronkolonnen (H2O→MeOH). Den H2O-eluerte fraksjonen ble utsatt for HPLC-analyse under følgende betingelser: HPLC-kolonne, Kaseisorb LC NH2-60-5, 4,6 mm id- 250 mm (Tokyo Kasei Co., Ltd., Tokyo, Japan); deteksjon, optisk rotasjon [Shodex OR-2 (Showa Denko Co., Ltd., Tokyo, Japan); mobil fase, CH3CN–H2O (85:15, v/v); stipendhastighet 0,8 ml/min]. Identifikasjon av L-rhamnose (i) og D-glukose (ii) fra 1–4 tilstede i de H2O-eluerte fraksjonene ble utført ved sammenligning av retensjonstider og optisk rotasjon med de for autentiske prøver [i, tR 9,9 min ( negativ)] og [ii, tR 17,9 min (positiv)].

Anerkjennelser

TM, KN og OM ble støttet av 'High tech Research Center' Project for Private Universities: matchende fondstilskudd fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT) i Japan, 2007–2011 og også støttet av en Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning fra MEXT. MY og HM ble støttet av det 21. COE-programmet, Academic Frontier Project og en Grant-in-Aid for Scientific Research fra MEXT.

Referanser og notater

1) Del XXXV: Morikawa T., Pan Y., Ninomiya K., Imura K., Matsuda H., Yoshikawa M., Yuan D., Muraoka O., Bioorg. Med. Chem., 18, 1882—1890 (2010).

2) Morikawa T., Xie H., Wang T., Matsuda H., Yoshikawa M., Chem. Biodiv., 6, 411—420 (2009).

3) Muraoka O., Morikawa T., Zhang Y., Ninomiya K., Nakamura S., Ma tsuda H., Yoshikawa M., Tetrahedron, 65, 4142—4148 (2009).

4) Yoshikawa M., Matsuda H., Morikawa T., Xie H., Nakamura S., Mu raoka O., Bioorg. Med. Chem., 14, 7468—7475 (2006).

5) Xie H., Morikawa T., Matsuda H., Nakamura S., Muraoka O., Yoshikawa M., Chem. Pharm. Bull., 54, 669—675 (2006).

6) Si C.-L., Liu Z., Kim J.-K., Bae Y.-S., Holzforschung, 62, 197—200 (2008).

7) 1H- og 13C-NMR-spektrene på 1-4 ble tildelt ved hjelp av forvrengningsfri forbedring ved polarisasjonsoverføring (DEPT), dobbel kvantefilterkorrelasjonsspektroskopi (DQF COSY), heteronukleær multippel kvantekoherens (HMQC) og heteronukleær multiple bond correlation (HMBC) eksperimenter.

8) Imakura Y., Kobayashi S., Mima A., Phytochemistry, 24, 139-146 (1985).

9) Wu J., Huang J., Xiao Q., Zhang S., Xiao Z., Li Q., ​​Long L., Huang L., Magn. Res. Chem., 42, 659-662 (2004).

10) Kitagawa S., Tsukamoto H., Hisada S., Nishibe S., Chem. Pharm. Bull., 32, 1209-1213 (1984).

11) Stereokjemi for 7-posisjon i 1–4 er ikke bestemt.

12) Kobayashi H., Oguchi H., Takizawa N., Miyase T., Ueno A., Usmanghani K., Ahmad M., Chem. Pharm. Bull., 35, 3309-3314 (1987).