Kort innånding av sevofluran kan redusere gliaarrdannelse etter hypoksisk-iskemisk hjerneskade hos neonatale rotter del 2

Sanntids PCR

Totalt RNA ble ekstrahert fra hippocampusvevet til valper 12, 24 og 48 timer etter operasjonen ved bruk av TRIzolreagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Komplementært DNA ble syntetisert ved bruk av et avansert Superscript II RT-PCR-sett (Invitrogen).

Hypoksisk-iskemisk skade refererer til en patologisk tilstand forårsaket av cerebral iskemi, hypoksi, metabolsk forstyrrelse og nervecelleskade på grunn av forstyrrelser i det kardiovaskulære og cerebrovaskulære systemet. Med sosial fremgang og livsstilsendringer blir hypoksisk-iskemisk skade mer og mer vanlig. Denne tilstanden kan forårsake mange skader på menneskers helse, inkludert å påvirke ens intelligens og hukommelse.

Selv om hypoksi og iskemi kan forårsake en nedgang i hjernefunksjonen, betyr det ikke at hukommelsen vil bli negativt påvirket. Tvert imot kan vi forbedre hukommelsen og øke hjernens effektivitet gjennom de riktige metodene. Her er noen måter å forbedre hukommelsen på:

1. Sunt kosthold: Kostholdets innvirkning på hukommelsen er svært viktig. Mat rik på protein, vitaminer og mineraler kan bidra til å opprettholde et sunt nervesystem og tenkefunksjon.

2. Tren mer: Fysisk trening kan fremme blodsirkulasjonen, øke oksygenstrømmen, forbedre kroppens immunitet og redusere risikoen for sykdom. Gjennom trening kan du forbedre hukommelsesevnen din.

3. Styrk selvtillit: Selvtillit er en viktig faktor i en persons hukommelse. Hvis du tror at du kan fullføre en bestemt oppgave, vil du enkelt oppnå de resultatene du ønsker, og du kan også effektivt forbedre hukommelsen.

Det kan sees at hypoksisk-iskemisk skade ikke er en tilstand som uunngåelig vil skade menneskets hukommelse. Så lenge vi mestrer de riktige metodene og tar godt vare på hjernen vår, kan vi omfavne en sunn fremtid med en positiv holdning. Det kan sees at vi trenger å forbedre hukommelsen, og Cistanche deserticola kan forbedre hukommelsen betydelig, fordi Cistanche deserticola har antioksidant-, anti-inflammatoriske og antialdringseffekter, som kan bidra til å redusere oksidasjon og inflammatoriske reaksjoner i hjernen, og dermed beskytte helsen til nervesystemet. I tillegg kan Cistanche deserticola også fremme vekst og reparasjon av nerveceller, og dermed forbedre tilkoblingen og funksjonen til nevrale nettverk. Disse effektene kan bidra til å forbedre hukommelse, læring og tenkehastighet, og kan også forhindre utvikling av kognitiv dysfunksjon og nevrodegenerative sykdommer.

Klikk vet måter å forbedre hjernens funksjon

Fluorescerende SYBR Green I-fargestoff (SYBR Green PCRMaster Mix, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og 1μL revers transkribert komplementært DNA ble brukt for å oppdage DNA-syntese ved sanntids-PCR med HIF-1 -spesifikke primere.

I rotorgenet sanntids DNA-amplifikasjonssystem (Corbett Research, Sydney, Australia), ble PCR utført med følgende sykluser: denaturering ved 95 grader i 15 minutter; 40 sykluser på 95 grader (20 sekunder), annealing ved 58 grader i 25 sekunder , og trekk ned ved 72 grader i 35 sekunder. Overvåking av det fluorescerende produktet ble utført i lengre tid ved 72 grader.

Rotorgenanalyseprogramvare (Corbett Research) ble brukt til å standardisere husholdningsgenet GAPDH og kvantifisere relativ genuttrykk. Alle primersekvenser er vist i tabell 1.

Nissl-farging
Rottehjerner ble preparert i skiver 28 dager etter operasjonen som beskrevet ovenfor for immunhistokjemi. Hver hjerne ble seksjonert fortløpende, og tre lignende deler av hjernen ble valgt for Nissl-farging.

Ved å bruke et Nikon C1 digitalt mikroskopkamera (Nikon Corporation, Tokyo, Japan), ble typiske mikrofotografier av hippocampus CA1, CA3 og DGareas tatt. Flere celler telt i hver av de tre seksjonene ble utført på en blind måte ved bruk av ImageJ-programvare.

Atferdstester

Rotter ble avvent etter 3 uker, delt inn i tre til fem grupper og holdt i bur i henhold til gruppeoppgave. Atferdstester ble utført på P28–P33 (dvs. 21–26 dager etter operasjonen) rotter, som tidligere beskrevet (Wang et al., 2019a) ), men med en liten modifikasjon. For å utelukke påvirkningen av østrussyklusen på gnagers oppførsel, ble bare hannrotter testet.

Morris vannlabyrint

Morris vannlabyrint-testing ble brukt til å evaluere romlige lærings- og minneevner til P28–P33-rotter (Wang et al., 2019a).

Testingen besto av to faser inkludert treningsseksjonen og romlig søketest. I 5 påfølgende dager ble fire treningsseksjoner implementert daglig med start kl. 8:00am. For plattformdeteksjonstesting ble 10 rotter fra hver gruppe individuelt plassert i vannet på forskjellige steder, stokastisk, vendt mot bassengets vegg.

Hvis en rotte klarte å oppdage plattformen innen 90 sekunder, ble den tvunget til å forbli på plattformen i 20 sekunder, og tiden det tok å oppdage plattformen ble registrert som rømningsforsinkelse. Hver testrunde var på 90 sekunder, og rømningslatensen ble målt som tiden fra rotten ble plassert i vannet til vellykket ombordstigning av plattformen.

Hvis rotten ikke klarte å finne plattformen innen 90 sekunder, ble opptaket stoppet og læring og minneveiledning ble utført (eksperimenteren brukte en lang stang for å lede rotten til plattformen og lot dem bli på plattformen i 20 sekunder for å lære). Under testen ble rømningslatensen til rotter som ikke klarte å komme inn på scenen registrert som 90 sekunder.

I spatialprobe-testen implementert på den sjette testdagen, ble plattformen fjernet og rotten ble plassert i motsatt kvadrant og fikk svømme i 90 sekunder. Svømmingshastigheten, fluktforsinkelsen og antall ganger de krysset stedet der plattformen tidligere var plassert, ble registrert av videosporingssystemet (Shanghai MobileDatum Ltd., Shanghai, Kina).

Suspensjonstest

Suspensjonstesten ble utført på P28–P32-rotter for å evaluere deres motoriske funksjon, og startet kl. 15.00 hver dag. Horisontalt plasttau med en 0,5 cm diameter ble plassert i en avstand på 45 cm fra bakken, og rotter ble ledet til å holde plasttauet med begge øvre lemmer, hvorpå tiden til rotten falt ble målt som suspensjonsforsinkelse. Testen ble avsluttet hvis: (i) rotten falt; (ii) suspensjonslatensen var mer enn 60 sekunder; eller (iii) tauet ble fanget av bakre lemmer.

Åpen felttest

Åpen felttesting ble utført på P28-rotter ved bruk av utendørsutstyr bestående av en pleksiglassboks (100 cm × 100 cm; Borj Sanat, Teheran, Iran) omgitt av en 45-cm høy vegg, med et gulv delt i 16 firkanter. Det sentrale området var området på 50 cm × 50 cm i sentrum av arenaen. Hver rotte ble individuelt plassert i sentrum av arenaen og fikk lov til å utforske uten begrensninger i 10 minutter.

Et videosporingssystem (Borj Sanat) ble brukt til å registrere og analysere totalreiseplanen (som en indikator på treningsaktivitet) og tid brukt i det sentrale området (som en indikator på angstadferd) (Zhai et al., 2019).

Golgi-farging

Etter fullført atferdstesting (dvs. 26 dager etter operasjonen), ble fem rotter tilfeldig valgt fra hver gruppe. Golgi-farging ble utført på 150-μm-tykke frosne hjerneseksjoner ved bruk av et FD Rapid Golgi-fargesett (FDNeuroTechnologies, Columbia, MD, USA) i henhold til produsentens protokoll.

ImageJ-programvare ble brukt for å analysere ryggradens tetthet (ryggradsnummer per 10 μm) til hvert nevron. Rygger ble telt på to eller tre sekundære dendrittsegmenter.

Statistisk analyse

SPSS 17.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) ble brukt til å analysere dataene, som vises som gjennomsnitt ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM). Shapiro-Wilk-testen ble brukt for å teste antakelsen om normalitet blant alle kontinuerlige variabler. I tillegg ble enveis variansanalyse etterfulgt av Tukeys post hoc multiple sammenligningstester benyttet i en rekke eksperimenter.

Hvis dataene ikke oppfylte normalitetsantakelsen, ble Kruskal-Wallis H-testen eller Mann-Whitney Utest fullført separat. Escape latency ble analysert basert på toveis variansanalyse for iterative målinger. P-verdier < 0.05 ble sett på som statistisk signifikante.

Resultater

SPC forbedrer hippocampus neuronal celletap

Hippocampus, inkludert de tre undersøkte regionene, er assosiert med læring og hukommelse (Jung et al., 2020). Etter atferdstesting ble Nissl-farging utført for å undersøke hippocampus arkitektur.

I HI-gruppen ble levedyktig nevronaldensitet redusert sammenlignet med den falske gruppen. Imidlertid ble antallet nevroner økt hos dyr som ble eksponert for SPC; denne effekten ble reversert av YC-1, som reduserte nevronal tetthet (figur 1A). Dette fenomenet ble observert i CA1-, CA3- og DG-regionene i hippocampus (P< 0.05; Figure 1B–D).

SPC forbedrer og reduserer dendritisk ryggradstetthet i hippocampus CA1-området

Golgi-farging ble brukt til å oppdage CA1 pyramidal neuronaldendritisk ryggradstetthet (figur 2A). Fordi størrelsene på pigger er svært varierte (f.eks. forgrenede dendritter, tynne eller sopp), fant vi bare ut at tettheten av dendritiske pigger var signifikant økt i HIS-gruppen sammenlignet med HI-gruppen (P < 0).{{6 }}5), mens tettheten av dendrittiske ryggradene ble redusert i HIS + YC-1-gruppen sammenlignet med HIS-gruppen (P < 0,01; figur 2B).
SPC forbedrer PSD95 og GAP43 uttrykk i hippocampus

Vi evaluerte uttrykket av synapseassosierte proteiner GAP43 og PSD95 for å bestemme om de ble hemmet av gliaarr. HI reduserte PSD95 (P < 0.01) og GAP43 (P < 0,05) signifikant proteinekspresjon sammenlignet med shamgruppen (figur 2C–E). Sammenlignet med HIS-gruppen var uttrykksnivåene for PSD95 og GAP43 merkbart redusert etter YC-1injeksjon.

Dannelse av astrogliose og gliaarr skader hippocampus arkitektur etter HI

Deretter prøvde vi å verifisere om sevofluran forbedret læring og hukommelsesfunksjon ved å beskytte hippocampalarkitekturen og dempe astrogliose. Neonatal HIE-indusert neuronal apoptose i hippocampus, samt reaktiv astrogliose i infarktregionen som deretter utvikler seg til et gliaarr (Rolls et al., 2009).

I HI-gruppen viste CA1- og CA3-pyramidelagene og DG-regionen tydelige reduksjoner i nevroner (P < 0.01, P < 0.001; figurer 3E og 4C), samt økt antall astrocytter med distinkte morfologiske endringer (P < 0,001; figur 3C og 4B). Vi evaluerte uttrykket av GFAP og NeuN i de tre områdene av venstre hippocampus ved å bruke immunhistokjemi og western blotting-analyse.

Resultatene våre viste at sammenlignet med sham-gruppen ble astrocytter aktivert i HI-gruppen, satt inn i CA1 (Figur 4A) og CA3 (Figur 3A) pyramidale lag, og omringet nevroner i DG (Figur 3B). Overdreven astrogliose resulterte i ytterligere utvidelse av gliale prosesser mot normale nevronale strukturer, og dannet et avvikende vegglignende astrocyttnett (figur 3A, B og 4A).

Dessuten ble GFAP-immunreaktivitet (figur 3C, D og 4B, E) og proteinnivåer økt (P < 0.01; figur 4E), mens NeuN-immunreaktivitet ble redusert (P < {{7} }.01 eller P < 0.001; Figur 3E, F og 4C). For ytterligere å verifisere gliaarrdannelse, evaluerte vi nevrokanproteinekspresjonsnivåer og immunreaktivitet i hippocampus (figur 5A, B og 6A).

Resultater av dobbeltmerkende immunfluorescens avslørte bemerkelsesverdige forskjeller i fluorescensintensiteten til neurocan+/GFAP+-immunfarging mellom HI- og falske grupper (P < 0.001, P < 0,05, P < 0,01; Figurene 5G, H og 6D), i samsvar med Western blot-resultater (P< 0.01; Figure 6F).

SPC demper astrogliose og gliaarrdannelse i hippocampus

Deretter undersøkte vår studie om SPC svekket glial arrdannelse. Sammenlignet med HI-gruppen var immunreaktiviteten til GFAP (figur 5C, D og 6C) og neurocan (figur 5E,F og 6B) i HIS-gruppen markert nedregulert i hippocampus (P < 0).{{6} }1 eller P < 0,001).

I motsetning til dette var uttrykk for GFAP og nevrokan i HIS + YC-1-gruppen betydelig økt sammenlignet med HIS-gruppen og var ikke forskjellig fra HIS + YC-1- og HI-gruppene (P > 0.05; Figur 6E og F).

I tillegg ble NeuN immunopositivitet oppregulert og strukturer virket mer ryddige i HIS-gruppen sammenlignet med HI-gruppen, som ble reversert av YC-1 (figur 3E, F og 4C).

For more information:1950477648nn@gmail.com