CDPS reduserer celleapoptose indusert av en 25–35 gjennom hjerneavledet nevrotrofisk faktor regulert av epigenetisk modulering

WU Yan1, LIU Dan-dan1, MA Zi-xing1, MIAO Xin1, ZHANG Xiao-fei1, LI Gang1,2 ( 1 Inner Mongolia Medical University, Department of Pharmacy, HOHHOT 010110, Kina; 2 State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences og Peking Union Medical College, Beijing 100050, Kina)

[Abstrakt]Mål: Å undersøke den regulatoriske effekten av Cistanche polysaccharides (CDPS) på de epigenetiske endringene av BDNF-genet indusert av A 25 - 35 i rotte adrenale sinofile tumorceller (PC12), og å analysere effekten av histonacetylering på BDNF-gentranskripsjon. Metoder: Apoptosen av PC12-celler ble indusert av A 25 – 35 in vitro. Alzheimers sykdom (AD) modell ble etablert in vitro. De apoptotiske cellene ble påvist ved flowcytometri etter at det positive legemidlet ginsenosid Ｒd (GSrd) og CDPS ble gitt. Endringene i cellemorfologi ble observert ved Hoechst33258-farging. Nivåene av HAT, HDAC2 og BDNF ble påvist ved hjelp av ELISA-metoden. Ekspresjonsnivået til P300- og HDAC2-protein ble påvist ved Western Blotting. Endringene av histon H3-acetylering og HDAC2 i BDNF-ekson Ⅳ ble observert og analysert ved kromatin-immunutfelling (CHIP) .

Kinesisk urt cistanche-Anti Alzheimers sykdom

Resultater: Etter eksponering av PC12-cellene 48 timer med 20 μmol·L － 1 A 25 － 35, ble modellen for AD-celleapoptose etablert. Sammenlignet med modellgruppen øker hver gruppe HATs uttrykk(P＜0．05),HDAC2-reduksjon (P＜0．05), og BDNF-nivåer øker(P＜0．05),og det er doseavhengige.ChIP-analyse bekreftet at etter A 25–35-induserte P12-celler, sank nivåene av BDNF exon Ⅳ histon H3 acetyleringsprotein betydelig, og reduksjonen av histonacetylering er HDAC2-avhengig.48 timer etter CDPS administrasjon, BDNF exon Ⅳhistone H3 acetyleringsproteinnivåer økte betydelig, og nivået av HDAC2 sank. Konklusjon: CDPS hadde betydelige beskyttende effekter på PC12-celler utsatt for A 25–35. Mekanismen kan være at reduksjonen av acetylering av HDAC{{11 }}avhengig histon H3 induserte undertrykkelsen av kontinuerlig transkripsjon av BDNF-genet.

［Stikkord］Cistanchepolysakkarider; PC12-celler; histon deacetylase 2; histon H3

Cistanche desert cola YCMa er en tørr, skjellete, kjøttfull stilk av Orobaceae-planten Cistanche desert cola YCMa eller Cistanche tubulosa (Schrenk) R. Wight. Å gå inn i nyremeridianen kan fylle nyre-yang og dra nytte av essens og blod; Å gå inn i tykktarmens meridian kan fukte tarmene og lindre forstoppelse. Forskning har vist at de fleste medisinske plantepolysakkarider har betydelige biologiske aktiviteter, som immunregulering, antialdring, anti-inflammatorisk og leverbeskyttelse, og anti-tumoreffekter.

Cistanche tubulosa

Cistanche desert cola YCMa

Alzheimers sykdom (AD) er en progressiv nevrodegenerativ sykdom. Kognitiv svikt er det viktigste patologiske trekk ved denne sykdommen, men årsakene til kognitiv svikt er foreløpig uklare og det er mangel på effektive behandlingsmetoder. 

Effekter av Cistanche-Anti Alzheimers sykdom

Klikk her for å se produkter fra Cistanche som forbedrer hukommelsen og forebygger Alzheimers sykdom

【Ask for more】 Email: xue122522@foxmail.com /  Whats App:  0086 18599088692 /  Wechat:  18599088692

Tallrike studier [4] har funnet at unormal histonacetylering er en vanlig epigenetisk abnormitet i patogenesen av AD. I studiet av den patologiske mekanismen for karakteristiske symptomer på AD, som kognitiv svikt, ble det funnet at histonacetyleringsmodifikasjon regulerer uttrykket av minnerelaterte gener[5-7]. Den dynamiske balansen av histonacetylering reguleres i fellesskap av to aktive enzymer, histonacetylaser (HAT) og histondeacetylaser (HDAC). HAT-er utfører hovedsakelig reversibel acetylering på lysinrestene ved den N-terminale halen av kjernehistonet til kromatin-nukleosomet, nøytraliserer den positive ladningen mellom DNA og tilstøtende histoner, fremmer DNA-avvikling, slapper av strukturen til kromatin og letter bindingen av transkripsjon faktorer med DNA-funksjonelle områder, og aktiverer til slutt transkripsjon. Den for tiden oppdagede histonacetylasen involvert i læring og hukommelse er P300/CBP [8]. I tillegg har studier vist at nedgangen i HATs aktivitet er involvert i nevrodegenerative sykdommer.

Hjerneavledet nevrotrofin (BDNF), et viktig nevrotrofin av nevroner og glia, regnes som et av nøkkelproteinene i prosessen med minnedannelse og er nødvendig for overlevelse og normal fysiologisk funksjon av nevroner i det modne sentrale og perifere nervesystemet [ 10-11]. Noen studier har vist at BDNF er sterkt uttrykt i det granulære cellelaget (GCL) i dentate gyrus, noe som indikerer at det deltar i synaptisk plastisitet og nevronal utvikling gjennom TrkB-reseptorer. I tillegg kan BDNF-ekspresjon og frigjøring også gjennomgå genetiske og epigenetiske variasjoner, slik som histonmodifikasjoner [12-13]. P300/CBP er en transkripsjonell koaktivator med HAT-aktivitet, som har en viktig innvirkning på langtidsminneprosessen, avhengig av de novo-genekspresjonen [14], og uttrykket av BDNF er regulert av P300/CBP-aktivitet [14] 15]. Forskning har bekreftet [16] at ikke bare miljøfaktorer kan forårsake langsiktige epigenetiske endringer i BDNF-promoterregionen, men også medikamentstimulering, slik som imipramin som forsterker H3-acetylering av bdnf P4 og P6 gjennom nedregulering av HDAC5. Imidlertid er vi fortsatt uklare om disse raske epigenetiske endringene er involvert i administreringen av Cistanche deserticola polysaccharides (CDPS) 25-35 induserer BDNF-transkripsjonsuttrykk i PC12-celler.

Denne studien brukte GRsd som et positivt medikament [17], og resultatene bekreftet at i A AD-cellemodellen indusert av 25-35 ble administrert med tre aktive ingredienser av Cistanche deserticola, og balansen mellom Ac-H3 og HDAC2 var rekonstruert for å øke BDNF-ekspresjonen, og dermed forbedre og fremme nevronal overlevelse. Denne studien antyder at uttrykket og frigjøringen av BDNF er nært knyttet til epigenetiske modifikasjoner, spesielt histonacetyleringsendringer regulert av HDAC og HAT.

Materialer og metoder

1 Legemidler og reagenser

DMEM-kulturmedium (Gibco, USA, batchnummer 12491-015); FBS (Gibco, USA, batchnummer 10099141); MTT (Sigma, USA, batchnummer M5655); BDNF Enzyme Linked Immunoassay Kit (Wuhan Xinqidi Biotechnology Co., Ltd., batchnummer 3374518); HATs enzymkoblede immunosorbentanalysesett (Wuhan Xinqidi Biotechnology Co., Ltd., batchnummer: 6907299); HDAC2 enzym-koblet immunosorbent analysesett (Wuhan Xinqidi Biotechnology Co., Ltd., batchnummer: 6907236); Ginsenoside (Chengdu Manchester Biotechnology Co., Ltd., batchnummer A0245); A 25-35 (Shanghai Jier Biochemical Co., Ltd., batchnummer: 10-375); HDAC2 polyklonalt antistoff (Abcam UK, batchnummer: ab32117); P300 polyklonalt antistoff (Abcam UK, batchnummer: ab142163); - Actin polyklonalt antistoff (Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd., batchnummer: ZM-0001); HRP sau-anti-kanin sekundært antistoff (Abcam Company, Storbritannia, batchnummer: ab205718); Farge forhåndsfarget proteinmolekylvektstandard (Sigma Company, USA); ECL fargeløsning (Thermo Fisher Scientific, batchnummer 10318H08); Kjernefysisk proteinekstraksjonssett (Kangwei Century Biotechnology Co., Ltd., batchnummer: CW0199S); Proteinfosfataseinhibitorblanding (Kangwei Century Biotechnology Co., Ltd., batchnummer: CW2383S); Chromatin immunoprecipitation kit (Merck Millipore, Tyskland, batchnummer: 17-371).

2 Hovedinstrumenter

PL 203 elektronisk balanse (Mettler Toledo Instruments Shanghai Co., Ltd.); TGL 16 ultra-lav temperatur sentrifuge (Changsha Pingfan Instrument Co., Ltd.); TU 1901 ultrafiolett spektrofotometer (Shanghai Precision Instruments and Meters Co., Ltd.); DYY 6C elektroforese instrument strømforsyning (Beijing Liuyi Instrument Factory); Polyakrylamidgelelektroforese (Western Blotting-elektroforese, Beijing Liuyi Instrument Factory); Membrankonverteringsenhet (Bio RAD, USA); WH 1 mikro virvelmikser (Shanghai Huxi Analytical Instrument Factory); 1/100000 elektronisk balanse (Mettler Toledo, USA); ti μ L, 100 μ L, 200 μ L og 1000 μ L pipettepistol (Rainin Instrument, USA); MDF U3386S lavtemperatur kjøleskap (Sanyo Company, Japan); SB2200 T ultralydrenser (Shanghai Bineng Xin Ultrasonic Co., Ltd.); Modell 680 ELISA (Bio RAD, Japan); C6 flowcytometri (BD Ac curi, USA); Odyssey dual color infrarød fluorescens bildesystem (LI-COR selskapet i USA); UH 100A Ultrasonic Cell Pulverizer (Tianjin Otsaines Co., Ltd.).

3 Forberedelse og identifisering av 3 CDPS

Det medisinske råmaterialet til Cistanche deserticola mabløtlegges i varm etanol i 3 timer, filtreres med gasbind, og filtratet kastes. Kok den medisinske resten med vann tre ganger, hver gang i 1-2 timer, filtrer og bland filtratet (viser en brunrød farge). Etter fordampning og konsentrering, sentrifuger ved 5000 r · min-1 i 10 minutter for å felle ut. Supernatanten ble utfelt med 2-3 ganger volumet av 95 prosent etanol og fikk stå ved 4 grader i 24 timer. Neste dag, sentrifuger ved 6000 r · min-1 (4 grader) i 20 minutter for å samle opp bunnfallet. CDPS ble oppnådd fra bunnfallet etter vannsolubilisering, deproteinisering, dialyse og frysetørking. Innholdet av polysakkarider er mer enn 90 prosent ved UV-spektrofotometri, og resten er noen få monosakkarider og oligosakkarider.

Kinesisk urt cistanche

4 celler

PC12-cellelinje (Beijing Xiehe Cell Resource Center).

5 Etablering av en 5-cellemodell

Ta PC12-celler med logaritmisk vekstfase, og mål dem med en hastighet på 3 prosent per milliliter × Inokuler 104 stykker tetthet i en 96-brønnkulturplate, med 0,1 ml per brønn. Etter 48 timers dyrking, bruk A 25-35 og CDPS (50 og 150 μ Etter 48 timers samhandling med g · mL-1 ble celler samlet for eksperimentet.

6 Påvisning av apoptose ved flowcytometri

Bruk avionisert vann til å blande 10 × Binding Buffer fortynnet til 1 × Binding Buffer; Sentrifuger ved 2000 r · min-1 (romtemperatur) i 5-10 minutter for å samle celler; Cellevask: forhåndsavkjølt ved 4 grader med 1 × resuspenderte PBS-celler, sentrifugert ved 2000 r · min-1 i 5-10 minutter, og vasket celler; Tilsett 300 μ 1 L × Binding Buffer suspensjonsceller; Annexin VFITC-flagg: Tilsett 5 μ Bland Ls Annexin V-FITC godt og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter på et mørkt sted; Legg til 5 minutter til før du starter maskinen μ PI-farging av L. Utfør flowcytometrideteksjon og observasjon innen 1 time.

7 Enzymkoblet immunsorbentanalyse for bestemmelse av HAT, HDAC2 og BDNF

Etter medikamentbehandling ble PC12-cellekulturmediet samlet, sentrifugert ved 2500 r · min-1 i 10 minutter, og supernatanten ble tatt for testing. Lag en standardkurve, følg operasjonstrinnene til reagenssettet, tilsett det angitte volumet av deteksjonsreagens og inkuber i mørke i 30 minutter. Mål absorbansverdien (A) ved 450 nm på en enzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA) og beregn innholdet av HAT, HDAC2 og BDNF. Hver forsøksgruppe ble satt opp med 3 sammensatte brønner, og forsøket ble gjentatt 3 ganger.

8 Western blotting-elektroforese

RIPA-buffer ble brukt til å lysere PC12-celler, ekstrahere kjerneproteiner og kvantifisere proteininnhold ved å bruke BCA-metoden. Legg til RIAP-buffer og juster proteinnivåene til hver gruppe for å være konsistente. SDS-PAGE-elektroforese ble utført inntil bromfenolblått nådde bunnen av separasjonsgelen og ble overført til NC-membranen (100 V, 2 timer). Proteinmarkøren ble forhåndsfarget for å bestemme standard molekylvektposisjonen til proteinet. Forsegl med 50 g · L-1 skummet melkepulver i 1 time. Første antistoff P300/CBP (1:5000), HADC2 (1:5000), og - Aktin (1:200) polyklonalt antistoff ble fortynnet proporsjonalt med en blokkeringsløsning, inkubert over natten ved 4 grader og deretter avfarget 3 ganger med TBS i 10 minutter hver gang. Det pepperrotperoksidase-merkede geit-anti-kanin polyklonale antistoffet (1:5000) ble inkubert ved romtemperatur i 1 time, og DAB ble tilsatt for fargeutvikling. Båndgråskalaen ble analysert ved bruk av Bandscan-analyseprogramvare for semikvantitativ komparativ analyse, og selv-gråskalaverdier ble brukt for å korrigere båndgråskalaen til målgenet og husholdningsfaktoren - Gråskalaforholdet til aktin representerer proteinekspresjonsnivået.

9 kromatin immun coprecipitation (ChIP)

Dyrk PC12-celler i en 150 mm kulturskål som inneholder 20 ml vekstmedium til en tetthet på 80 prosent til 90 prosent, og rør ved romtemperatur med 1 prosent formaldehyd i 15 minutter. Tilsett glycin (125 mmol · L-1 sluttkonsentrasjon) for å avslutte fikseringen. Vask vevet i PBS og suspender bunnfallet i SDS-lysebuffer (50 mmol · L-1 Tris, 10 mmol · L-1 EDTA, 1 prosent SDS). 6 × kromatin ble behandlet med ultralyd på is i 10 s for å oppnå fragmenter på omtrent 200 ~ 400 bp. Spar 1/10 av det sprukkede produktet som input for ChIP-standardisering. Legg til polyklonale antistoffprøver rettet mot acetylerte histon H3- eller HDAC2-antistoffer til hver gruppe og inkuber dem forsiktig ved 4 grader over natten, med kanin- eller muse-IgG som negativ kontroll. Inkuber immunkomplekset med magnetiske perler (livsteknologier) i 4-6 timer, vask deretter med 150 mmol · L-1 NaCl-lavsaltbuffer og 500 mmol · L-1 NaCl-høysaltbuffer, resuspendert i 120 ml 1 prosent SDS som inneholder 0,1 mol · L-1 NaHCO3 og inkubert over natten ved 65 grader. De tverrbundne prøvene ble behandlet med RNase og protease K (Sigma Aldrich, USA), og DNA (Qiagen) ble renset ved bruk av et QIQuick PCR-rensesett. Kvantitativ sanntids-PCR ble utført på immunutfellings-DNA-prøver. PCR-amplifisering av den transkripsjonelle kontrollregionen til målgenet (omtrent 200 bp). Primerdesignet er som følger: bdnf ekson IV (5 '- TCAGGAGTACATATCGGCCACCA-3', 5 '- GTAGGC CAAGTGCCTTGTCCGT-3') GAPDH (5 '- AGACAGC CGCATCTTCTTGT-3', 5 ' - CTGCGGAGAAGAAGT CAG-3').

10 Statistisk behandling

Alle data er uttrykt i x ± s. SPSS-programvare ble brukt for statistisk analyse, og enkeltfaktor-variansanalyse ble brukt for å sammenligne flere eksperimentelle grupper. P<0.05 indicates a statistically significant difference.

resultat

1 CDPS vs. en beskyttende effekt av 25-35 indusert skade

Resultatene viser at A Etter 48 timers behandling med 25-35 celler, sank celleoverlevelsesraten til (42,91 ± 4,59) prosent, med en statistisk signifikant forskjell sammenlignet med kontrollgruppen (P<0.05). The positive drug ginsenoside (GSrd) has a protective effect on cells, with a statistically significant difference compared to the model group (P<0.05); CDPS (50 and 150 μ G · mL-1) has a protective effect on AD model cells, and is dose-dependent, with a statistically significant difference compared to the model group (P<0.05).

Resultatene av MTT-metoden er vist i tabell 1.

Tabell 1 CDPS for A Effekten av 25-35 på celleoverlevelsesraten for PC12 indusert av n=6, x ± s

Sammenlignet med normalgruppen, en: P<0.05; Compared with the model group, b: P ＜ 0.05

2 Effekten av 2 CDPS på apoptose av skadede celler

2.1 Flowcytometrideteksjon av celleapoptosehastighet

Fra figur 1 kan det sees at apoptosefrekvensen til normalgruppen er 0.0 prosent , som alle er levende celler; Sammenlignet med normalgruppen økte apoptosefrekvensen til modellgruppen signifikant (33 7 prosent ), forskjellen var statistisk signifikant (P<0 05), Description A β 25-35 causes apoptosis of PC12 cells; Compared with the model group, the cell apoptosis rate significantly decreased to (0.8%) after administration of GSrd. Give CDPS (50 and 150 μ After the intervention of group g · mL -1, the apoptosis rate of cells was significantly reduced in a dose-dependent manner, with 18.1% and 12.1%, respectively, indicating that CDPS can inhibit A β 25-35 induces apoptosis in PC12 cells, as shown in Table 2.

Figur 1 Flowcytometrianalyse av CDPS på en beskyttende effekt av 25-35-indusert apoptose i PC12-celler

Tabell 2 CDPS for A Effekten av 25-35 på apoptosehastigheten til PC12-celler n=4, x ± s

Sammenlignet med normalgruppen, en: P<0.05; Compared with the model group, b: P ＜ 0.05

2.2 Effekt av CDPS på HAT-er og HDAC2-innhold i PC12-celler

Resultatene viste at sammenlignet med HATs aktivitetsmodellgruppe, ble den tomme kontrollgruppen signifikant redusert; HDAC2 aktivitetsmodellgruppen viste en signifikant økning sammenlignet med den tomme kontrollgruppen; Etter administrering av GSrd økte aktiviteten til HAT betydelig, mens aktiviteten til HDAC2 ble betydelig redusert. Gi CDPS (50 og 150 μ Etter g · mL-1 intervensjon, sammenlignet med modellgruppen, var aktiviteten til HAT signifikant økt, mens aktiviteten til HDAC2 var signifikant redusert, og det var en doseavhengig sammenheng. Forklaring En histonacetyleringsmodifikasjon er involvert i apoptoseprosessen til PC12-celler indusert av 25-35, og endringer i enzymaktiviteten til HAT-er og HDAC2 har innvirkning på overlevelsen til PC12-celler. Resultatene er vist i figur 2.

Sammenlignet med normalgruppen, en: P<0.05; Compared with the model group, b: P ＜ 0.05

Figur 2 CDPS vs. A Effekter av 25-35-induserte HAT-er og HDAC2 i PC12-celler

3 Effekt av 3 CDPS på ekspresjonen av P300/CBP- og HDAC2-proteiner i PC12-celler

P300/CBP er for tiden oppdaget som en HAT relatert til læring og minne, mens HDAC2 er anerkjent som en HDAC relatert til læring og minne. I denne studien ble Western Blot brukt til å analysere uttrykket av P300/CBP og HDAC2 i hver gruppe av celler. Resultatene viste at sammenlignet med den tomme kontrollgruppen, viste modellgruppen en reduksjon i P300/CBP-uttrykk (P<0 05) ; After administration of GSrd, the expression of P300/CBP increased (P<0 05) ; Give CDPS (50 and 150 μ After g · mL-1 intervention, the expression of P300/CBP increased (P<0 05), and it is dose-dependent. The results are consistent with the enzyme activity detection results (see Figure 3).

Sammenlignet med normalgruppen, en: P<0.05; Compared with the model group, b: P ＜ 0.05

Figur 3 Effekt av CDPS på ekspresjonen av P300/CBP (A) og HDAC2-protein (B) i PC12-celler

4 Effekt av 4 CDPS på BDNF-sekresjon i PC12-celler

BDNF spiller en viktig rolle i overlevelse, differensiering, vekst og utvikling av nevroner, forhindrer nevronal død fra skade, forbedrer den patologiske tilstanden til nevroner og fremmer regenerering og differensiering av skadde nevroner. For å utforske virkningen av CDPS på A. Den beskyttende mekanismen til 25-35-indusert apoptose i PC12-celler. Vi brukte ELISA for å oppdage sekresjonen av BD NF-protein i cellekulturmediet til hver gruppe. Resultatene viste at sammenlignet med den tomme kontrollgruppen, hadde modellgruppen en reduksjon i BDNF-sekresjon (P<0.05); After administration of GSrd, BDNF secretion increased (P<0.05); Give CDPS (50 and 150 μ After intervention with g · mL-1, the secretion of BDNF increased (P<0.05) in a dose-dependent manner. The neuroprotective effect mediated by CDPS is enhanced with the increase of BDNF secretion, as shown in Table 3.

5 Effekten av 5 CDPS på H3-acetyleringsnivå i PC12-celler

Studier har vist at utskillelsen av BDNF påvirkes av modifikasjoner av histonacetylering. For å bestemme om histonacetyleringsmodifikasjonen av BDNF i PC12-celler i denne studien er påvirket av A 25-35, brukte vi kromatinimmun-samutfellingsmetoden for å analysere nivåene av AC-H3 og HDAC2 i celler i hver gruppe. ChIP-analyse viser i A Etter 25-35-induksjon var HDAC2-nivåene (Figur 4A) og H3-acetyleringsnivåene (Figur 4B) av BDNF-ekson IV betydelig redusert, i samsvar med nedreguleringen av BDNF-ekspresjon (se Tabell 3). Etter administrering av CDPS økte H3-acetyleringsnivået i BDNF ekson IV-regionen (Figur 4B), og viser en signifikant forskjell sammenlignet med modellgruppen. Økningen i H3-acetyleringsnivået til BDNF ekson IV-regionen i GSrd-gruppen er i samsvar med rapporten i litteraturen [17]. Fra resultatene ovenfor kan det sees at den nevrobeskyttende prosessen mediert av CDPS er ledsaget av en betydelig økning i BDNF-sekresjon, som er regulert av Ac-H3 og HDAC2, som vist i tabell 4.

Tabell 3 CDPS vs. A Effekten av 25-35-indusert BDNF-sekresjon i PC12-celler n=5, x ± s

Sammenlignet med normalgruppen, en: P<0.05; Compared with the model group, b: P ＜ 0.05

Sammenlignet med normalgruppen, en: P<0.05; Compared with the model group, b: P ＜ 0.05

Figur 4 Effekt av CDPS på acetyleringsnivåene til HDAC2 (A) og Accty-H3 (B) i PC12-celler

Tabell 4 CDPS vs. En effekt av 25-35-indusert Acety-H3 på PC12-celler n=5, x ± s

Sammenlignet med normalgruppen, en: P<0.05; Compared with the model group, b: P ＜ 0.05

Diskusjon

En unormal generasjon og avsetning er tidlige hendelser og kjernepatologiske endringer i AD. Formidle toksiske effekter som celleapoptose [18], inflammatorisk kaskaderespons [19], oksidativt stress og mitokondriell dysfunksjon, og forverre utviklingen av AD. Både in vivo og in vitro-studier har vist at A 25-35 med A 1-42 har lignende koagulasjonsegenskaper og toksiske effekter, som kan forårsake nevronal skade, svekket læring og hukommelsesevner, og er mye brukt i A på grunn av dens fordeler som lett oppløsning Forskning på skader og toksiske effekter [20]. MTT-resultatene indikerer at A 25-35-konsentrasjon 20 μ PC12-celler dyrket under tilstanden mol · L-1 i 48 timer viser betydelige apoptotiske egenskaper, noe som gjør den til en ideell AD-cellemodell. V-FITC og PI dobbel farging flowcytometri ble brukt for å oppdage apoptose av PC12-celler i forskjellige eksperimentelle grupper. A Apoptosefrekvensen til PC12-celler økte signifikant etter behandling med 25-35 og reduserte signifikant på en doseavhengig måte etter administrering av CDPS. Dette indikerer at CDPS har effekten av å hemme celleapoptose, så cellemodellen i denne studien kan brukes til å evaluere effekten av CDPS på A En ideell cellemodell for å indusere beskyttende effekter mot PC12-celleskade ved 25-35.

Cistanche deserticola polysakkarider--Anti Alzheimers sykdom

GSrd er en monomer komponent isolert fra naturlige planter og har aktiv biologisk aktivitet. Forskning [21] indikerer at GSrd kan redusere nivåene av reaktive oksygenarter i PC12-celler, og motstå hydrogenperoksid-indusert cytotoksisk skade ved å redusere malondialdehydinnholdet og øke aktiviteten til antioksidantenzymer. In vivo-eksperimenter har funnet at GSrd kan forbedre og fremme nevronal overlevelse ved å gjenoppbygge balansen mellom Ac-H3 og HDAC2, øke BDNF-uttrykk og forbedre kronisk hjerneskade [17]. CDPS, i likhet med GSrd, er isolert fra naturlige planter av tonifiserende klasse og har både nevrotrofiske og nevrobeskyttende effekter. Forskning har funnet at CDPS kan forbedre lærings- og hukommelsesevnen til AD-modellrotter ved å øke uttrykket av Bcl-2, redusere uttrykket av caspase-3 og hemme hippocampus neuronal apoptose. Våre tidligere eksperimentelle resultater [22-26] viste at CDPS betydelig kunne øke ekspresjonen av synaptophysin-vekstrelatert protein 43 (GAP-43), øke antall synapser i hippocampus, øke plastisiteten til synapser, og lindre ytelsen til lærevansker hos mus med skopolamin-indusert lærings- og hukommelsesforstyrrelser. Det ble observert at CDPS kunne øke aktiviteten til SOD i hjernevev hos aldrende mus indusert av D-neneneba-galaktose, redusere innholdet av MDA, forbedre nevronal skade i hjernevev og aktivere cAMP/PKA/CREB-signalveien for å forbedre læringen. og hukommelsessvikt. Derfor ble GSrd valgt som et positivt medikament i denne studien.

Denne studien utforsker oppreguleringsmekanismen til BDNF mediert av CDPS. Studier har vist at BDNF spiller en viktig rolle i synaptisk tredannelse, nevrogenese og celleoverlevelse [27]. Imidlertid trekker disse reguleringsmekanismene seg gradvis tilbake mot epigenetiske mekanismer, og gjennom epigenetiske modifikasjoner spiller genuttrykk en viktig rolle i ulike menneskelige sykdommer. Histonlysinrester acetyleres under påvirkning av histonacetyltransferaser HAT-er, og løsner dermed strukturen til kromatin, eksponerer bindingsstedene til transkripsjonsfaktorer og DNA og starter transkripsjonsmekanismen. Histon deacetylase HDAC er relatert til transkripsjonshemming. HDAC2 er en av de mest uttrykte klasse I HDAC-ene i hjernen [28]. Økningen av HDAC2 kan følge med den kognitive nedgangen i den menneskelige nevrodegenerative hjernen [28-29], og HDAC2 regulerer også negativt hukommelse og synaptisk plastisitet i hjernen til friske mus [30-31]. Denne studien avslører mekanismen som gjør at H3-acetyleringsnivåene reduseres betydelig og HDAC2 økes betydelig i AD-cellemodellen. Denne studien antyder at BDNF er regulert av epigenetiske veier.

For tiden er det oppnådd lovende resultater i farmakologiske behandlinger rettet mot å øke histonacetylering for å reversere kognitiv svikt gjennom bruk av ikke-selektive HDAC-hemmere [32-33]. Denne studien viser at nivået av HDAC2 øker og utskillelsen av BDNF reduseres i AD-cellemodellen; Blokkering av HDAC2 med GSrd øker uttrykket av BDNF, og resultatene er like etter behandling med CDPS. Basert på de ovennevnte in vitro-eksperimentene, vil vårt forskningsteam videre undersøke effekten av CDPS på acetyleringsnivået til histoner i en AD-patologisk tilstand, og gjennomføre påfølgende eksperimenter.

[Henvisning]

［1］Li Jiawei, Zhou Wan, Li Junsong. Forskning på opprinnelsen til Cistanche deserticola i farmakopéen til Folkerepublikken Kina [J]. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2014, 32 (7): 1756-1760

［2］Sui Yurong. Forskningsfremgang på polysakkaridmedisiner [J]. Tianjin Pharmacy, 2013, 25 (2): 41-43

［3］ LIN W,ZHANG J,LIU Y, et al. Studier av diagnostiske biomarkører og terapeutisk mekanisme for Alzheimers sykdom gjennom metabolomikk og hippocampus proteomikk［J］． Eur J Pharm Sci, 2017,8( 105): 119 – 126．

［4］ ZHANG J,ZHANG Ｒ,ZHAN Z, et al. Gunstige effekter av sul foraphane-behandling ved Alzheimers sykdom kan formidles gjennom redusert HDAC1/3 og økt P75NTＲ uttrykk ［J］． Front Aging Neurosci,2017,5( 1): 1 – 12.

［5］ TＲAN HT, LAFEＲLA FM, HOLTZMAN DM, et al. Kontrollert cortical impact traumatisk hjerneskade i 3xTg-AD mus forårsaker en søt intra-aksonal amyloid-beta akkumulering og akselererer uavhengig utviklingen av tau abnormiteter［J］． J Neurosci, 2011, 31( 26): 9513 – 9525.

［6］ SＲIVASTAVA S,HAIGIS MC. Ｒole av sirtuiner og kalorirestriksjon i nevrobeskyttelse: implikasjoner i Alzheimers og parkinsons sykdommer［J］． Curr Pharm Des,2011,17 ( 31): 3418 – 3433.

［7］ MA T,TAN MS,YU JT, et al. Ｒesveratrol som et terapeutisk middel for Alzheimers sykdom［J］. Biomed Ｒes Int,2014,11 ( 26): 1 – 13．

［8］ GIZEM D OUTEIＲO TF. SIＲT1 og SIＲT2: fremvoksende mål i nevrodegenrasjon［J］． EMBO Mol,2013,5( 3): 344 – 352.

［9］ ADWAN L,ZAWIA NH. Epigenetikk: en ny terapeutisk tilnærming for behandling av Alzheimers sykdom［J］． Pharma T her,2013,139( 1): 41 – 50.

［10］ JI JF,JI SJ,SUNＲ, et al. Tvunget løpetrening demper svekkelse av hoftepocampus nevrogenese og de nevrokognitive underskuddene indusert av helhjernebestråling via den bdnf-medierte banen ［J］． Biochem Bio Ｒes Co, 2014,443( 2): 646 – 651．

［11］ LEAL G,AFONSO PM,DUAＲTE CB. Nevronal aktivitet induserer synaptisk levering av hnＲNP A2 /B1 ved en BDNF-avhengig mekanisme i dyrkede hippocampale nevroner［J］． PLoS One,2014,9 ( 10): 1 – 10.

［12］ BAＲICHELLO T,GENEＲOSO JS,SIMOES LＲ, et al. Natriumbutyrat forhindrer hukommelsessvekkelse ved å reetablere BDNF- og GDNF-ekspresjon i eksperimentell pneumokokkmeningitt ［J］． Mol Neurobiol, 2015,52( 1): 734 – 740.

［13］ VALOＲ LM, PULOPULOS MM, JIMENEZ-MINCHAN M, et al. Ablasjon av CBP i hovednevroner i forhjernen forårsaker beskjedne hukommelses- og transkripsjonsdefekter og en dramatisk reduksjon av histonacetylering, men påvirker ikke cellelevedyktighet［J］． J Neuros ci,2011,31( 5): 1652 – 1663.

［14］ PETＲIJ F,GILES ＲH,DAUWEＲSE HG, et al. Ｒubinstein-Taybi syndrom forårsaket av mutasjoner i den transkripsjonelle ko-aktivatoren CBP［J］． Nature,1995,376( 6538): 348 – 351．

［15］ PODDA MV, COCCO S, MASTＲODONATO A, et al. Anodal tran-scranial likestrømsstimulering øker synaptisk plastisitet og hukommelse hos mus via epigenetisk regulering av Bdnf-uttrykk［J］． Sci Ｒep,2016,24( 6) : 1 – 19．

［16］ KOPPEL I, TIMMUSK T. Differensiell regulering av Bdnf-uttrykk i kortikale nevroner ved klasse-selektiv histon-deacetylase i hibitorer［J］． Neuropharmacology, 2013,75( 12): 106 – 115.

［17］ WAN Q,MA X,ZHANG ZJ, et al. Ginsenosid reduserer kognitiv svekkelse under kronisk cerebral hypoperfusjon gjennom hjerneavledet nevrotrofisk faktor regulert av epigenetisk modulasjon［J］． Mol Neurobiol, 2017,54( 4): 2889.

［18］ DIAS IH,MISTＲY J,FELL S, et al. Oksiderte LDL-lipider ved produksjon av crease-amyloid av SH-SY5Y-celler gjennom glutathi-one-utarming og lipidflåtedannelse［J］． Gratis Ｒadic Biol Med, 2014,11( 75): 48 – 59．

［19］ Liu Xuhua, Wang Xiaoqing, Wang Zhongsu, et al. curcumin svekket En nevroinflammatorisk reaksjon av primær rottemikroglia indusert av 25-35 ［ J ］. Kinesisk patofysiologi diverse志,2016, 32( 9): 1635 － 1641．

［20］ MELCANGI ＲC,CAＲUSO D,LEVANDIS G, et al. Modifikasjoner av nevrosteroidnivåer i en eksperimentell modell for nigrostriatal degenerering: potensiell relevans for patofysiologien til Parkinsons sykdom［J］． J Mol Neurosci, 2012,46( 1): 177 – 183.

［21］ DIVATE ＲD,WANG PM,WANG CC, et al. Beskyttende effekt av medisinsk sopp Xylaria nigripes mycelieekstrakter mot hydrogenperoksid-indusert apoptose i PC12-celler［J］． Int J Immuno pathol Pharma, 2017,30( 1): 105 – 112．

［22］Tao Zunwei, Zheng Duo, Di Minglei, et al. Forskningsfremgang i plantepolysakkarider [J]. Legemiddelvurderingsforskning, 2014,33( 2): 148 – 152.

［23］ Li Gang. Eksperimentell studie av den intellektuelle fremmende effekten av fenyletanolglykosider fra Cistanche deserticola ［ J］. Journal of Inner Mongolia Medical University, 2011, 33( 2): 141 – 143.

［24］ BENITO E,UＲBANKE H,ＲAMACHANDＲAN B, et al. HDAC-hemmeravhengig transkriptom og gjenoppretting av minne i modeller for kognitiv nedgang［J］． J Clin Invest, 2015,125 ( 9):3572 – 3584.

［25］Li Gang, Yin Ruoxi, Yu Tengfei, et al. Beskyttende effekt av Cistanche deserticola-polysakkarid på synaptisk plastisitet i skopolaminindusert lærings- og hukommelsessvikt modellmus ［ J］. Chinese Pharmacological Bulletin, 2014,30( 5): 1 – 6.

［26］ Ma Hui, Yin Ruoxi, Li Gang, et al. Effekt av Cistanche deserticola-polysakkarid på CREB-ekspresjon i aldrende modellmus indusert av D-neneneba-galaktose ［ J］. Kinesiske eksperimentelle oppskrifter, 2014,20( 20): 137 – 141．

［27］ PAＲK H,POO MM. Neurotrofinregulering av utvikling og funksjon av nevrale kretser［J］. Nat Ｒev Neurosci,2013,14( 1): 7 – 23.

［28］ YAO ZG,ZHANG L,HUANG L, et al. Ｒregional og celletypespesifikk distribusjon av HDAC2 i den voksne musehjernen［J］． Brain Struct Funct,2013,218( 2): 563 – 573． ［29］ GＲAFF J,ＲEI D,GUAN JS, et al. En epigenetisk blokade av kognitive funksjoner i den nevrodegenererende hjernen［J］. Nature, 2012,483( 7388): 222 – 226．

［30］ GUAN JS, HAGGAＲTY SJ, GIACOMETTI E, et al. HDAC2 regulerer hukommelsesdannelse og synaptisk plastisitet negativt［J］． Nature,2009,459( 7243): 55–60．

［31］ MONTGOMEＲY ＲL,DAVIS CA, POTTHOFF MJ, et al. Histondeacetylaser 1 og 2 regulerer redundant hjertemorfogenese, vekst og kontraktilitet［J］． Genes Dev,2017,21( 14): 1790 – 1802.

［32］ MENG J,LI Y,CAMAＲILLO C, et al. Antitumor-histondeacetylase-hemmeren SAHA og den naturlige flavonoiden curcumin viser synergistisk nevrobeskyttelse mot amyloid-beta-toksisitet ［J］． PLoS One,2014,9( 1): e85570．

［33］ GILLAND KE. Kortsiktige effekter av et vestlig kosthold på antall hjernestyrte nevrotrofisk faktor immunreaktive nevroner i hypothalamus bue, ventromedial og paraventrikulær kjerne［D］． ProQuest Dissertations Publishing, 2015: 1 – 71.