Endringer i aminosyreprofiler og bioaktive forbindelser av thailandske silkekokonger som påvirkes av vannutvinning del 2
Mar 19, 2022
Ta kontaktoscar.xiao@wecistanche.comhvis du vil ha mer informasjon
2.8. Korrelasjoner
En korrelasjonsanalyse (Pearson-test) ble brukt til å gjøre sammenligninger (som korrelasjonskoeffisienter,r) mellom og mellom verdier for totalt fenolisk innhold, totalt flavonoidinnhold, DPPHradical-scavenging aktivitet, ABTS +, FRAP analyse, anti-α-amylase, anti-α-glukosidase, og anti-glycation av SPE i Nangsew og Eri stammer (tabell 5 og 6). Hver parameter hentet fra studien viste sterke positive sammenhenger mellom TPC, TFC, DPPH, ABTS, FRAP anti-α-amylase, anti-α-glukosidase og anti-glykasjon. Dette kan skyldes at de bioaktive forbindelsene som finnes i silkeekstraktet er i stand til å scavenging ulike frie radikaler og anti-α-amylase, anti-α-glukosidase, og anti-glykasjon. Våre funn har også vist at det er en svært signifikant lineær sammenheng mellom resultatene for de to stammene. Disse resultatene var i samsvar med Benzie og Stezo [29], som fant en sterk positiv sammenheng mellom totalt fenolisk innhold og FRAP-analyse. Lignende resultater ble også funnet mellom TPC og DPPH(R2=0,711) og FRAP (R2=0,948), henholdsvis i bitter gourd som rapportert av Kubola [30]. Kumar et al.[31] gjennomførte en evaluering av antioksidantaktivitet og total fenol i forskjellige varianter av Lantana Camara blader. Ekstraktene viste sterke sammenhenger mellom fenolisk innhold og DPPH, FRAP og ABTSscavenging aktiviteter. Den høyeste korrelasjonen (r = 0,998, R2 = 0,997) ble funnet mellom totalt fenolisk innhold og ABTS-scavenging analyse. I tillegg er positive sammenhenger mellom ABTSand TPC(R2=0,885) og DPPH(R2=0,999) i Gynura procumbens blader rapportert av Kaewseejan et al. [32].
Sammenhengene mellom biologiske egenskaper og hemmende aktivitet ble funnet i forskningen til Quan et al.[33] som undersøkte antioksidanten og potensielle diabetiske hemmende egenskaper til C.tramdenum bark ekstrakter. Resultatene deres fant også atAntioksidant(inkludert DPPH, ABTS, reduksjon av kraft og nitrogenoksid) var sterkt korrelert med α-amylase og α-glukosidasehemmeri ved p<>
3. Materialer og metoder 3.1.Silk Coc00ns
Nangsew og Eri stammer av thailandske silke kokonger ble samlet inn. DenNangsew-stammen(gule kokonger) ble hentet fra Baan Hua Saban, Phutthaisong District, Buriram-provinsen, Thailand. Eri-stammen (hvite kokonger) kom fra Nong Ya Plong Community, Mancha Khiri, Khon Kaen-provinsen, Thailand.
3.2. Kjemikalier og reagenser
Alle standarder ble hentet fra Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA), inkludert essensielle aminosyrer: fenylalanin, valin,Tryptofan,threonine,isoleucin,metionin, histidin, arginin, lysin og leucin. De ikke-essensielle aminosyrene som ble studert var glycin, glutaminsyre, aspartinsyre, glutamin, serin, tyrosin, alanin og aspargin. Antioksidantaktivitetsbestemmelsesreagensene ble hentet fra Sigma-Aldrich Co:Folin-Ciocalteu reagens,2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH),2,4,6-tripiridyl-s-triazine (TPTZ), 2,2'-og-bis(3-thylbenzthiazoline-6-sulfonsyre)(ABTS). Løsningsmidlene og reagensene som ble brukt i HPLC-analysen ble kjøpt fra Merck (Darmstadt, Tyskland). Den α-amylase (fra Aspergillus oryzae), α-Glukosidase (fra Bacillus stearothermophilus), p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNP-G), bovint serumalbumin (BSA) og natriumazid ble kjøpt fra Sigma-Aldrich Co.
Cistanche kan forbedre immuniteten
3.3. Ekstraksjon med destillert vann
Utvinning ble utført ved hjelp av metoden TilSangwong et al. [34]. Silke kokonger ble kuttet i små biter. To gram av disse stykkene ble ekstrahert med 200 ml destillert vann ved 100 °C for de angitte ekstraksjonstidene. Ekstraktene ble sentrifugert ved 5000× g i 10min av sentrifuge (Universal 320/320R, Hettich, Boucherville, QC, Canada). Ekstraktene ble filtrert gjennom Whatman No.1 papir under vakuum for å fjerne uoppløselig materiale, og dermed produsere silkeproteinekstraktet (SPE).
3.4. Proteinbestemmelse
Proteinbestemmelse ble bestemt beskrevet av Bradford-analysen [35]. SPE (0,5 ml) ble lagt til 1,0 ml Bradford-løsning og inkubert ved romtemperatur i 5 minutter. Bovine serumalbumin (BSA) ble brukt som et standard referanseprotein. Absorbansen av prøver ble målt til 595 nm med et synlig spektrofotometer (DR 2700rM Portable Spectrophotometer, Hach, Loveland, CO, USA).
3.5.Amin0-syreinnhold av LCMS/MS
Aminosyreanalysen involverte et LC-MS-MS (Shimadzu LCMS-8030) trippel-quadrupole massespektrometer, en elektrosprayioniseringsmodus (ESI), etterfulgt av analyse i et Shimadzu HPLC-system (Shimadzu, Kyoto, Japan)(Chumroenphat et al. [36). HPLC-analysen involverte en strømningshastighet på 0,2 ml/min; temperaturen i søyleovnen var 38 °C, og autosampleren var ved 4 °C. De mobile fasene ble tilberedt (A)vandig maursyre 0,1% (o / o) og (B) metanolvannet (50:50);da var blanderen maursyre 0,1% (o / v). Autosampler nålen ble renset med metanol før og etter aspirasjon av prøven. Analysene ble utført i triplikat.
3.6. Totalt fenolisk innhold (TPC)
Totalt fenolinnhold i silkeproteinekstraktet ble analysert etter Folin-Ciocalteu-metoden [30]. Kort sagt ble 0,3 ml SPE blandet med 2,25 ml 10% Folin-Ciocalteu reagens oppløst i destillert vann. Etter 5 min inkubasjon ble 2,25 ml 6% natriumkarbonat (NazCO)-løsning tilsatt og blandingene ble igjen å stå i 90 minutter ved romtemperatur. Absorbansen av løsningsprøvene ble målt til 725 nm ved hjelp av et spektrofotometer. TPC i bønner ble uttrykt som mg gallsyreekvivalenter (GAE) per g tørrvekt (mg GAE/g DW). Analysene ble utført i triplikat.
3.7. Totalt flavonoidinnhold (TFC)
Totalt flavonoidinnhold i SPE ble bestemt i henhold til Kubota og [30], modifisert. Kort ble 0,5 ml av hver prøveløsning blandet med 2,25 ml destillert vann og 0,15 ml 5% NaNO, oppløsning (m/ v). Løsningen fikk lov til å stå i seks minutter, og deretter ble 0,3 ml 10%AlCl3(w/v)lagt til løsningen. Etter 5 min,0,1 ml 1 M NaOH (m/ø)løsning ble tilsatt og deretter ble absorbansen målt til 510 nm ved hjelp av et spektrofotometer. Resultatene ble uttrykt som mg rutinekvivalenter (RE) per g tørrvekt (mg RE/g DW).
3.8. DPPH Radikal scavenging aktivitet
Spes antioksidantaktiviteter ble bestemt som den scavenging aktiviteten til den stabile 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) frie radikal ifølge Brand-Williams et al.[37]. Silkeproteinekstrakt 0,1 ml ble tilsatt til 3 ml a0,001 M DPPHin metanol. Blandingen ble holdt i 30 min i mørket ved romtemperatur. Absorbans ble bestemt ved 517 nm ved hjelp av et spektrofotometer. Ligningen for beregning av DPPH-hemmingen var som følger:
(1) Hemming (%)=[(Abs. kontroll- Abs.sample)/Abs. kontroll]×100)
der Abs. prøven er absorbansen av prøven og Abs. kontroll er absorbansen av kontrollen.
3.9.Antioksidantaktivitet ved ABTS-analyse
ABTS's radikale kationmetode For Re et al. (1999) [22] ble modifisert for å evaluere de frie radikal-scavenging effektene. ATBS arbeidsløsning ble utarbeidet ved å kombinere 7,4 mM ABTS og 2,6 mM kaliumpersulfat i et forhold på 1: 1 (v / v), slik at den kan reagere i mørket i 12 timer ved romtemperatur, og deretter fortynne den med deionisert vann. Absorbansen ble bestemt ved 734 nm ved hjelp av et spektrofotometer til det nådde 1,1 ±0,02.Deretter ble 150 μL av SPE og 2850 μL av ATBS arbeidsløsning reagert i mørket i 2 timer med blanding, og absorbansen ved 734 nm ved hjelp av et spektrofotometer; 100% metanol ble brukt som kontroll. Ligningen for beregning av hemmingen var som ligning(1).
3.10. Ferric reduksjon / antioksidant kraftanalyse (FRAP)
Reduksjonskraften til ekstrakter var basert på FRAP-analysen [23]. Det ferske FRAP-reagenset ble fremstilt ved å blande 100 ml acetatbuffer (0,3 mol L-I, pH 3,6), 10 ml TPTZsolution oppløst i 10 ml 40 mmol L-1HCland 10 ml 20 mmolL-1Cl; i forholdet 10∶1∶1 og 120 ml destillert vann ved 37 °C. Kort sagt ble 60 μL SPE og 180uL av deionisert vann tilsatt til 1,8 ml FRAP-reagens. Løsningen ble ristet av virvelblanding. Etter at oppløsningen ble inkubert i et vannbad ved 37 °C i 4 minutter, ble absorbansen målt til 593 nm mot en kontroll. FRAPvaluer ble vist som mg FeSO4 per g tørr basis (mg FeSO4/g DW).
3.11.Hemmende aktivitet mot enzymet α-amylase
α-Amylase enzymhemmelig aktivitet ble målt ved hjelp av metoden xiao et al. (2006)[38] med små modifikasjoner. Substratet ble tilberedt ved å koke 100 mg potetstivelse i 5 ml fosfatbuffer (pH 7,0) i 5 min, og deretter avkjøles til romtemperatur. SPE (50μL), substrat (300μL) og 5μg/ml α-amylaseoppløsning (20μL) ble blandet og oppløsningen ble inkubert ved 37 °C i 15 minutter. Reaksjonen ble stoppet ved å tilsette 50 μL 1 M HCl, og deretter ble 50μL jodoppløsning tilsatt. Absorbansen ble målt til 650 nm av en mikroplateleser. Acarbose ble brukt som en positiv kontroll. Hemmingsprosenten av x-amylase ble vurdert som ligning (1).
3.12.Hemmende aktivitet mot enzymet α-glukosidase
Den α-glukosidase enzyminhiberingsanalyse ble utført i henhold til metoden til Wang og Zhao[39]. SPE (2 ml oppløst i dimetylsulfoksid; DMSO) og 0,5 U/ml a-glukosidase (40 ml) ble blandet i 120 ml 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,0). Etter 5 min pre-inkubasjon ble 5 mM p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside løsning (40 ml) tilsatt, og løsningen ble inkubert ved 37 °C i 30 minutter. Absorbansen ble målt til 405 nm av UV/Vis absorbansspektrofotometermikroplateleser. Hemmingsprosenten av α-glukosidase ble vurdert som ligning (1).
3.13.Evaluering av anti-AGEs formasjonsaktivitet
De hemmende kapasitetene ved AGEs dannelse av silkeproteinet og dets fraksjoner ble målt ved hjelp av metoden vinson og howard [40]. Det totale volumet av glykasjonsreaksjonsløsning (2,5 ml) ble fremstilt ved å blande 500 μL SPE, 500 μL 20 mg/ml BSA i fosfatbuffer, 500 μL 0,5 M glukose i fosfatbuffer og 1 ml 0,1 M fosfatbuffer ved pH 7,4 som inneholder 0,02 % (w/v)natriumazid. Denne blandingen ble inkubert ved 37 °C i 5 dager i mørket, og deretter ble antallet fluorescerende AGEer dannet bestemt ved hjelp av et fluorescerende spektrometer med en eksitasjonsbølgelengde på 330 nm og utslippsbølgelengde på 410 nm. Prosentandelen av anti-AGE-dannelse ble beregnet basert på den resulterende fluorescerende intensiteten (FI) ved hjelp av følgende ligning:(2) n =[1-(FIsample - FIsample blank)/(kontroll-kontroll tom)]×100 der Flsample er den fluorescerende intensiteten i prøven, prøve blank er den fluorescerende intensiteten til prøven tom, kontroll er den fluorescerende intensiteten til kontrollen og FIcontrol blank er den fluorescerende intensiteten til prøvekontrollen tom.
3.14. Statistisk analyse
Alle data ble analysert av SPSS-programvaren (IBM SPSS, Chicago, IL, USA). Resultatene rapporteres som gjennomsnittlig ± standardavvik (SD) av tre replikeringer og data ble analysert ved hjelp av enveisanalyse av varians (ANOVA)med den minst signifikante forskjellen (LSD)-testen for å bestemme betydningen i forhold til kontrollen og Pearsons korrelasjonstest for å vurdere korrelasjonene mellom midlene. I alle tilfeller kan p<0.05 was="" considered="">
4. Konklusjoner
Vår studie av effekten av å trekke ut silkeprotein involverte ekstraksjon med destillert vann ved 100 °C i seks timer; denne prosedyren ga de høyeste verdiene av proteininnhold, aminosyrer, totalt fenolinnhold (TPC), totalt flavonoidinnhold (TFC), DPPH radikal-scavenging aktivitet, ABTS radikal scavenging kapasitet assay, FRAP analyse, anti-α-amylase, anti-a-glukosidase, og anti-glykasjon sammenlignet med andre ekstraksjonstider. I tillegg ga SPE av Nangsew-stammene høyere innhold av alle disse ernæringsmessig fordelaktige stoffene, sammenlignet med ekstrakter av Eri-stammene. Resultatene tyder på at Nangsew ville være de foretrukne stammene for våre pågående planer om å utvikle et naturlig tilsetningsstoff for funksjonelle matvarer, basert på sericin ekstrahert under kokongbehandling, noe som gir muligheter for et alternativ i produksjon av funksjonelle drikker.
Forfatterbidrag:Konseptualisering, C.B. og S.S.; Metodikk, C.B.og S.S.; Validering, C.B. og S.S.; Formell analyse, C.B.og S.S.; Etterforskning, C.B.og S.S.; Skriving – Opprinnelig kladdeforberedelse, C.B. og S.S.; Skriving – Gjennomgang og redigering, C.B. og S.S.; Visualisering, C.B.ogS.S. Alle forfattere har lest og sagt ja til den publiserte versjonen av manuskriptet.
Finansiering:Denne forskningen ble finansiert av Thailand Science Research and Innovation (TSRI) og Siam Natural Products Co., Ltd.
Institusjonell gjennomgangsnemnderklæring:Gjelder ikke.
Informert samtykkeerklæring:Gjelder ikke. Erklæring om datatilgjengelighet: Gjelder ikke.
Bekreftelser:Laboratorieutstyrssenteret ved Mahasarakham University for samarbeid og vitenskapelige hjelpemidler. Takk også til Colin Wrigley, University of Queensland, Australia, for engelsk korrekturlesing.
Interessekonflikter:Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Denne artikkelen er hentet fra Molecules 2021, 26, 2033. https://doi.org/10.3390/molecules26072033 https://www.mdpi.com/journal/molecules
