Kapittel 1: Krϋppel-lignende faktor 15 undertrykker nyre glomerulær mesangial celleproliferasjon via forbedring av P53 SUMO1-konjugasjon

For mer info. ta kontakt medtina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt

Mesangial celle (MC)spredninger et nøkkelpatologisk trekk hos en rekke vanlige menneskernyresykdommer, inkludert mesangial proliferativ nefritis og diabetiske nefropatier. Kunnskap om MC-responser på patologiske stimuli er avgjørende for forståelsen av disse sykdomsprosessene. Vi har tidligere bestemt at Krüppel-lignende faktor 15 (KLF15), en nyre-anriket sink-finger transkripsjonsfaktor, var nødvendig for hemming av MC-proliferasjon. I denne studien undersøkte vi det direkte målgenet og den underliggende mekanismen som KLF15 regulerte mesangial spredning. Først screenet vi liten ubiquitin-relatert modifikator 1 (SUMO1) som det direkte transkripsjonsmålet for KLF15 og validerte dette funnet med ChlP-PCR og luciferaseanalyser. Videre demonstrerte vi at overuttrykk av KLF15 eller SUMO1 forbedret stabiliteten til P53, som blokkerte cellesyklusen til humane nyre-MC-er (HRMC-er) og derfor opphevet celleproliferasjon. Motsatt kunne ikke knockdown av SUMO1 i HRMC-er, selv de som ble overuttrykt med KLF15, hemme HRMC-spredningshastigheter og øke SUMOylering av P53. Til slutt viste resultatene at nivåene av SUMOylert P53 i nyrebarkene til anti-Thy 1-modellrotter ble redusert under spredningsperioder. Disse funnene avslører den kritiske mekanismen som KLF15 målretter mot SUMO1 for å formidle spredning av MC-er.

SØKEORD: KLF15, Mesangial celleproliferasjon, P53, SUMO1

Klikk her for å bli kjent med fordelene vedcistancheog hvor du kan kjøpe cistanche tubulosa

1| INTRODUKSJON

Mesangiale celler (MC-er) utgjør omtrent en tredjedel av cellepopulasjonen i glomerulus. De spiller viktige roller i homeostase ved å opprettholde den strukturelle arkitekturen til glomerulus, produsere og vedlikeholde den mesangiale matrisen, regulere filtrasjonsoverflaten og fagocytere apoptotiske celler eller immunkomplekser.1 I mange glomerulære sykdommer, som mesangial proliferativ nefritis og diabetisk MC-er er skadet og gjennomgår en stor endring i fenotype, noe som resulterer i ukontrollert mesangial proliferasjon og overdreven avsetning av mesangial matrise.2-4 I tillegg til å hyperproliferere og øke produksjonen av ekstracellulære matriseproteiner (ECM) og matrisemetalloproteinaser, kan MC-er frigjør inflammatoriske faktorer, noe som resulterer i glomerulær sklerose og interstitiell fibrose; ytterligere forverre nyreskade, og forårsake progresjon til irreversibel sluttstadium nyresykdom.5-Kunnskap om MC-responsen på patologiske stimuli er avgjørende for utviklingen av behandlinger for å redusere nyreskaden forårsaket av unormal spredning av MC-er og forsinke progresjon inn i sluttstadiet av nyresykdom.

De Krüppel-lignende faktorene (KLF) er en gruppe av sinkfinger DNA-bindende transkripsjonsfaktorer. Økende bevis tyder på at denne familien er involvert i en rekke cellulære prosesser, som celledifferensiering, hjerteremodellering, hematopoiesis og skjebnebestemmelse av stamceller.8-10 KLF-familien består av atten medlemmer, blant dem er KLF15 vidt distribuert. inyre, bukspyttkjertelen, hjerte,lever, og skjelettmuskulatur. Tidligere studier har vist at KLF15 er en sentral transkripsjonsregulator i forskjellige fysiologiske prosesser, inkludert glukoneogenese,immunresponser, og adipocyttdifferensiering.1-14 Vår tidligere studie har vist at KLF15 er nødvendig for å hemme spredningen av MC-er.15 Denne studien hadde som mål å klargjøre det direkte målgenet og nedstrømsmekanismen som KLF15 regulerer mesangial proliferasjon med.

2|MATERIALER OG METODER

2.1 |Anti-Thy1 nefritt modell

Wistar-hannrotter (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.) som veier mellom 200 og 220 g ble tilfeldig allokert til kontroll- og anti-Thy1-gruppene. Alle rottene ble holdt i et dyrepleieanlegg under en lys/mørke syklus på 12/12 timer med fri tilgang til mat og vann. Velferdsrelaterte vurderinger og intervensjoner ble utført gjennom hele forsøket. Totalt har 28 rotter injisert et muse anti-Thy1 monoklonalt antistoff, som beskrevet tidligere, 16 og sju ble injisert med saltvann (kontroller). Glomeruli ble renset fra nyrebarkvevet ved å bruke en siktingsmetode. Sera ble samlet for målinger av serum urea nitrogen og kreatinin nivåer. Anti-Thy1-modellrotter ble drept på dagene O,3,5,7 og 10, og deres glomeruli ble høstet. Alle dyrevelferds- og eksperimentelle prosedyrer ble utført i strengt samsvar med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (USA National Research Council, 1996).

2.2|Human renal MC (HRMC)kultur og behandling

Primære nyre-HRMC-er ble kjøpt fra ScienCell (San Diego, CA). HRMC-er fra tredje til sjette passasje ble opprettholdt i MC Medium (MsCM; ScienCell) i henhold til produsentens instruksjoner. For eksperimenter ble cellene dyrket til sammenløp, vekst stoppet i redusert serum (0,5 prosent FBS) i 24 timer og delt inn i forskjellige eksperimentelle grupper.

For behandling med ulike konsentrasjoner av glukose ble cellene inkubert i MsCM inneholdende enten 5 mmol/L glukose (normal glukose) eller 30 mmol/L glukose (høy glukose, HG) i 48 timer ved 37 grader C. Celler inkubert under identiske eksperimentelle forhold med 5 mmol/L glukose og 25 mmol/L mannitol i stedet for 30 mmol/L glukose ble brukt som osmotiske kontroller. For behandling med PDGF-BB ble cellene inkubert i MsCM inneholdende 20 ng/ml PDGF-BB(R&D Systems, Minneapolis, MN) i 48 timer ved 37 grader C.

2.3|Immunhistokjemi (IHC)

Parafininnstøpt nyrevev ble snittet i 4 μm tykkelse, og snittene ble farget for IHC. Skivene ble inkubert med 3 prosent H, O, for å blokkere endogen peroksidase etter avparafinisering. Etter antigeninnhenting og blokkering ble skivene inkubert med anti-KLF15(ab81604, Abcam), anti-liten ubiquitin-relatert modifikator 1(SUMO1, ab32058, Abcam) og anti-PCNA(ab92552, Abcam) antistoffer ved 4 grader C Skivene ble deretter inkubert med et sekundært antistoff merket med pepperrotperoksidase ved 37 grader i 30 minutter, og den immunhistokjemiske reaksjonen ble observert i henhold til produsentens instruksjoner med 3,3'-diaminobenzidin (DAB, ORIGINE, CN) som det kromogene middelet. . Deretter ble objektglassene motfarget med hematoxylin-eosin og avbildet med et lysmikroskop (Olympus). Immunhistokjemisk farging ble evaluert med Image J-programvare i henhold til den gjennomsnittlige optiske tettheten (AOD).

2.4 |Kromatinimmunutfelling (ChlP) med parallell sekvensering (ChIP-Seq)

ChIP ble utført ved å bruke et Simple ChlP Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads; Cell Signaling Technology) i henhold til produsentens protokoll. Kort fortalt ble HRMC-er overuttrykt med enten KLF15 eller scramble ved en celletetthet på 2,0×10³celler/ml og tverrbundet med 1,7 prosent formaldehyd i PBS i 5 minutter ved romtemperatur (RT) ). Tverrbundne celler ble lysert for å oppnå kjernefraksjonen, som ble sonikert i 1 x ChIP-buffer. Lysatene ble klaret ved sentrifugering ved 9300×g i 10 minutter ved 4 grader. Kromatinprøver ble inkubert med enten et anti-KLF15-antistoff (ab81604, Abcam) eller et anti-lgG-antistoff (bakgrunnskontroll) over natten ved 4 grader. De antistoffbundne kompleksene ble fanget ved inkubering med protein G magnetiske kuler. ChlP-Seq-biblioteker for sekvensering ble forberedt ved å bruke et TruSeq ChlP Sample Prep Kit (Illumina). Bibliotekene ble utsatt for parallell sekvensering med en HiSeq2500-sekvenser (Illumina) ved bruk av en-ende 50 bp sekvenseringslengdeprotokollen. Neste generasjons sekvensering (NGS) rådata ble konvertert til FASTQ-filer ved hjelp av CASAVA-programvare (versjon 1.8.2), og hvert datasett ble justert til det menneskelige referansegenomet (UCSC hg19) ved hjelp av Burrows-Wheeler Aligner (versjon 0.7.12) ).17 ChIP-Seq toppanrop ble utført ved bruk av MACS2-programmet (versjon 2.0.1) med standardparametere, men en aq-verdi på 0,05, med inngangsdata for subtraksjon.18 Peak-sammenligning med den krypterte kontrollen (foreldrecellene) og overekspresjonsprøver ble utført med Diffbind, en R-pakke, ved bruk av DeSeq2-algoritmen, og en falsk oppdagelsesrate på 0,1 ble ansett for å indikere signifikans.1 Superenhancers ble identifisert fra settet med topper detektert i DMSO-behandlede HRMCer med superenhanceren programvare ROSE.2 grad ChIP-Seq-toppene ble annotert med R-pakken ChlPpeakAnno, og promotere ble definert som KLF15-anrikede regioner innenfor 1 kb fra transkripsjonsstartstedet.21 Genet med transkripsjonsstartstedet nærmest c enter av hver super-enhancer ble definert som målgenet til den super-enhancer.

2.5|ChIP-kvantitativ sanntids-PCR (ChlP-PCR)

ChlP-PCR-prosedyren var lik prosedyren beskrevet ovenfor. ChIP-DNA fra anti-KLF15 antistoff-behandlede celler ble brukt for å oppdage assosiasjonen mellom KLF15 og SUMO1. DNA fra anti-lgG antistoff-behandlede celler fungerte som kontroll. Renset DNA ble brukt for analyse av SUMO1 proksimale promoterregion ved sanntids PCR på en ABI PRISM 7600 ved bruk av SYBR GreenER qPCR Supermix. SUMO1-primerne var som følger: fremover: 5'-AGCAGCGGTCTTTAGCATCA-3';reverse:5'-TCGGTTAACCAGCACCCTTG-3'. Den relative amplifikasjonen av promotorsekvensen til genet ble beregnet ved å bruke {{18 }}AcT-metoden, og normalisering ble utført mot en 1:100 fortynning av input-DNA.

2.6|Cellemerking og stabil isotopmerking med aminosyrer i cellekulturanalyse (SILAC)

Celler ved 15 prosent konfluens ble sådd i det passende komplette mediet (for HRMCer: MsCM). Merkingen og SILAC-prosedyrene er beskrevet i tidligere forskning.22 Kort, etter å ha blitt merket med lett (13C,-merket) eller tung (15N,-merket) lysin og lett(1c-merket) eller tung(15N-merket) )arginin, ble celler transfektert med et KLF15-overekspresjonsplasmid eller et kontrollplasmid. Etter behandling ble cellene trypsinisert og talt for å oppnå en cellepellet av 2×10'celler/tilstand, og cellene ble utsatt for SILAC-analyse ved bruk av massespektrometri. De tunge og lette cellepelletene ble lysert i radioimmunutfellingsbuffer tilsatt protease- og fosfataseinhibitorer ved bruk av korte 15-sekunders sonikeringsutbrudd. Lysatene ble sentrifugert ved 14,000 rpm i 20 minutter. Etter sentrifugering ble supernatantene samlet, og proteinkonsentrasjonen ble målt ved bruk av en Hitachi L-8900 aminosyreanalysator. Alikvoter på 200 ug protein ble fremstilt fra prøvene, kombinert og utfelt ved bruk av en metanol-kloroform-utfellingsmetode. Proteinpelletene ble resuspendert i 8 mol/L urea/0,4 mol/L ammoniumbikarbonatbuffer, redusert med 45 mmol/L DTT i 30 minutter ved 37 grader C, alkylert med 100 mmol/L jodacetamid i 30 minutter i mørket ved RT og fordøyd med Lys-C protease (1:20 w/w) over natten (~16 timer) ved 37 grader. Lys-C fordøyelsen ble ytterligere fortynnet og spaltet med trypsin (1:20 vekt/vekt) i 8 timer ved 37 grader. Fordøyelsen ble avsaltet med en MacroSpin-kolonne (The Nest Group, Inc) og tørket i en SpeedVac-konsentrator. De avsaltede peptidene ble deretter beriket med fosfopeptider ved bruk av titandioksidharpiks innebygd i 10 μL tips (Glygen Corp). Gjennomstrømningene ble reservert, og de anrikede peptidene ble eluert ved å bruke et forhold på 1:33 av ammoniumhydroksid til vannet. De SpeedVac-tørkede gjennomstrømnings- og elueringsfraksjonene ble resuspendert i buffer A (0,1 prosent maursyre i vann) og utsatt for væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC/MS)-analyse.

2.7| Dual-luciferase reporteranalyse

Villtype human SUMO1(NM_001005781)-promoter med 1604bp(-1474nt- pluss 129nt) inkludert det potensielle bindingsstedet (-205nt--199nt) ble oppnådd ved bruk av PCR amplifisere og subklone inn i en pGL3-Basisk vektor (Cat.# E1751 Promega) med SacI- og Bglll-restriksjonsenzymseter, kalt pGL3-WT-SU. Bindingsstedet-CACCCA-i promoteren til SUMO1 ble også mutert til -CGTTTG-, kalt pGL3-MT-SU. Plasmid (pReceiver-M94) inneholdt det humane KLF15 full-lengde cDNA ble oppnådd fra GeneCopoeia. KLF15-overekspresjonsplasmidet og pGL3-WT-SU eller pGL3-MT-SU ble transfektert inn i HEK293T-celler med Lipofectamine 2000-reagens. Prøvene ble deretter kotransfektert med et pRL-TK(Cat #E2241, Promega) plasmid som uttrykker Renilla luciferase. Etter 24 timers transfeksjon ble cellene lysert. Firefly og Renilla luciferase aktivitetsnivåer ble undersøkt ved bruk av et dual-luciferase reporter assay system (Biotek).

2.8 |RNA-preparering, cDNA-syntese og RT-qPCR-analyse

Totalt RNA ble ekstrahert ved bruk av TRlzol (Invitrogen) og renset ved bruk av et RNeasy Mini Kit (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA ble generert ved bruk av et ProtoScript førstestrengs cDNA-syntesesett (New England Biolabs. Kvantitativ PCR ble utført ved bruk av Power SYBR Green Master Mix(Life Technologies). Oligonukleotidsekvensene brukt for RT-qPCR er gitt i tabell 1.

2.9 |Celleproliferasjonsanalyse

Menneskelig SUMO1-cDNA(NM_003352.8) oppnådd fra OriGene Technologies (Beijing, Kina) ble satt inn i pCMV6-entry-plasmidet (CAT#: RC200633). Celleproliferasjon ble analysert med et Click-iT⑧ Plus EdU Alexa Fluor⑧555 Imaging Kit (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble celler inkubert i en 6-brønnkulturplate og transfektert med et KLF15-kontrollplasmid (Scramble, VECTOR-gruppen), et KLF15-overekspresjonsplasmid (det samme ovenfor, KLF15-gruppen), en ekspresjonsvektor for SUMO1 (VECTOR-gruppen), et SUMO1-overekspresjonsplasmid (SUMO1-gruppen), negativ kontroll siRNA (SI CON-gruppen), SUMO1 siRNA (SI SUMO1-gruppen), et KLF15-overekspresjonsplasmid med SUMO1 siRNA (KLF15 pluss SI SUMO1-gruppen) eller et KLF15-overekspresjonsplasmid med negativ kontroll siRNA (KLF15 pluss SICON-gruppen) i 24 timer. Deretter ble mediet erstattet med et medium supplert med 20 ng/mL PDGF-BB i 48 timer, og en optimalisert EdU-konsentrasjon på 10 μmol/L ble tilsatt ca. 12 timer før PDGF-BB-stimulering. Etter behandling ble cellene fiksert med 4 prosent formaldehyd, permeabilisert med 0,5 prosent Triton X-100, vasket med 3 prosent BSA i PBS, inkubert med Click-iT⑧-reaksjonscocktail i 30 minutter ved RT, og inkubert med DAPIre-handlingsbuffer i 10 minutter ved RT mens den er beskyttet mot lys. Cellene ble observert ved fluorescensmikroskopi (Olympus, Tokyo, Japan). Kjernene til prolifererende celler ble deretter farget røde.

2.10|Western blot-analyse og immunutfelling (IP)

Celler ble lysert ved bruk av RIPA-buffer (Thermo Scientific), og det totale proteinet i supernatantene ble kvantifisert ved å bruke et BCA-proteinanalysesett (Thermo Scientific). Western blot-analyse og IP ble utført som beskrevet tidligere. 23.24Anti-KLF15-antistoff (AV32587, Merk), anti-SUMO1-antistoff (S8070, Merk) og anti- -aktin (A5316, Sigma) ble brukt for Western blot-analyse. Anti-P53-antistoff (P5813, Merk) ble brukt for IP-analyse.

2.11 |Bioinformatikkanalyse

Kandidater fra ChIP-Seq eller SILAC viste minst todelt berikelse i forhold til kontrollene. Gene Ontology (GO) analyse ble utført med Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID; versjon 6.7). P-verdier ble justert for multiple hypotesetesting ved bruk av Benjamini-Hochberg-metoden. Betydelig berikede kategorier i funksjonssubontologi- og KEGG-veiene med en justert P-verdi<.05 were="" chosen.="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa)="" of="" 52="" intersecting="" genes="" or="" proteins="" between="" chlp-seq="" and="" silac="" was="" performed="" on="" the="" qiagen="" ipa="" platform(https://digitalinsights.qiagen.com/),="" and="" the="" motifs="" in="" the="" target="" genes="" were="" analyzed="" using="" meme="" suite="" 5.3.0.="">

2.12|Statistisk analyse

Alle eksperimenter ble utført i tre eksemplarer, og resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SE. Alle data ble analysert ved hjelp av SPSS-programvare (ver.20.0; SPSS Inc) og sammenlignet med Students t-test eller enveis ANOVA. En P-verdi<.05 was="" considered="" to="" reflect="" statistical="">