Karakteristisk HPLC–MS-profil av Cistanche Deserticola Formula Granulat
Oct 13, 2025
Forfattere: Mao Dan; Yu Hong; Mao Xiuhong; Hu Qing; Ji Shen*
Tilknytning: Shanghai Institute for Food and Drug Control; NMPA Key Laboratory for Quality Control of Traditional Chinese Medicines, Shanghai 201203, Kina
Abstrakt
En karakteristisk kromatografisk profileringsmetode for Cistanche deserticola-formelgranulat ble etablert basert på HPLC-MS. Ved å bruke autentiserte Cistanche deserticola-avkoksstykker og et echinacoside-referansestoff som referanse, ble ti partier med prøver ekstrahert direkte med 50 % metanol og analysert ved HPLC. Separasjon ble utført på en Phenomenex Luna C18-kolonne (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) med en gradient av acetonitril-0,1 % maursyre ved 1,0 mL/min, 30 grader og UV-deteksjon ved 330 nm. Et referansekarakteristisk kromatogram med ni vanlige topper ble konstruert, blant dem ble fem topper identifisert av LC/Q-TOF-MS. De ti partiene viste likhet større enn eller lik 0,981. Presisjons-, stabilitets- og repeterbarhetsmålinger for den karakteristiske profilen var tilfredsstillende. Metoden er enkel, identifiserer effektivt Cistanche deserticola-formelgranulat, og kan brukes til kvalitetsevaluering.
Nøkkelord: Cistanche deserticola; formel granulat; karakteristisk kromatogram; echinacoside; verbascosid (akteosid); HPLC; LC–Q‑TOF‑MS; cistanche fordeler; beste cistanche til salgs
Introduksjon av Cistanche
Cistanche (Rou Cong Rong)er en kjent tonic tradisjonell kinesisk medisin (TCM) med nyreforsterkende, essens-nærende og avføringseffekt. Det ble først spilt inn i Shennongs Classic of Materia Medica og oppført som et stoff av overlegen kvalitet. 2020-utgaven av Pharmacopoeia of the People's Republic of China (Del I) definerer de autentiske kildene som de tørkede, skjellete, kjøttfulle stilkene til Cistanche deserticola YC Ma eller Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, med prosesseringsmetoder inkludert råproduktet og vinproduktet. Viktige kjemiske komponenter inkluderer fenyletanoidglykosider (PhGs), iridoider, lignaner og sukkerarter, som underbygger farmakologiske aktiviteter som nevrobeskyttelse, antialdring, hepatobeskyttelse og avføring; kliniske anvendelsesutsikter er brede. Blant disse er PhG-er de mest aktive bestanddelene.
Cistanche deserticola-formelgranulat er enkelt-urtgranulat fremstilt av bearbeidet C. deserticola ved bruk av moderne produksjonsteknikker for bruk i kliniske resepter. Det er foreløpig ingen nasjonal standard for deres kvalitetskontroll. Tidligere studier rapporterte om innholdsbestemmelsesmetoder eller fingeravtrykk for C. tubulosa formelgranulat, men ingen litteratur om karakteristiske kromatogrammer spesifikt for C. deserticola formelgranulat. I denne studien ble ti batcher samlet for å etablere, for første gang, en HPLC-karakteristisk profil for C. deserticola formelgranulat, med fem topper identifisert av LC–MS. Denne profilen gir et effektivt og vitenskapelig grunnlag for streng kvalitetskontroll av C. deserticola formelgranulat.
Eksperimentell av cistanche
1.1 Instrumenter og reagenser
Agilent 1100 HPLC med UV–Vis-detektor og ChemStation (Agilent, USA)
Agilent 1290 Infinity HPLC og Agilent 6530 Q-TOF MS med ESI-kilde (Agilent, USA)
Sartorius elektronisk balanse (Sartorius Scientific Instruments, Beijing, Kina)
Elmasonic P ultralydrenser (Elma, Tyskland)
Referanseavkoksbiter av Cistanche deserticola og referansesubstanser av echinacoside og verbascoside (acteosid) ble kjøpt fra National Institutes for Food and Drug Control (batchnr.. 121101-201603, 111670-201907-1415311, 14125301). Cistanoside A, tubulosid A og isoverbascosid ble oppnådd fra Shanghai Tauto Biotech (batch nr. . 21040621, 20061231, 21040824). Acetonitril (HPLC-kvalitet) var fra Merck; andre reagenser var analytisk kvalitet (Shanghai Lingfeng Chemical Reagents). Ti partier med C. deserticola-formelgranulat (PFKL1–PFKL10), tre partier med C. deserticola-avkoksstykker (YP1–YP3), og tre partier med C. deserticola-standardavkok (BZTJ1–BZTJ3) ble levert av Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Ltd.
1.2 Utarbeidelse av løsninger
1.2.1 Referanseløsninger
Referanseurteløsning: Vei 1 g av autentiserte C. deserticola-avkoksstykker i en konisk kolbe med propp, tilsett 25 mL 50 % metanol, soniker (250 W, 35 kHz) i 30 minutter, avkjøl, bland og sentrifuger. Bruk supernatanten som referanseurteløsning.
Referansestoffløsning: Forbered echinakosid med 0,2 mg/ml i 50 % metanol.
1.2.2 Testløsning
Mal prøven; vei nøyaktig ca. 1 g i en 100 mL gul målekolbe. Tilsett 50 ml 50 % metanol, propp, rist, vei, bløtlegg i 30 minutter og soniker i 40 minutter (250 W, 35 kHz). La det avkjøles, vei på nytt og fyll opp den tapte vekten med 50 % metanol. Bland, stå, filtrer og samle det påfølgende filtratet for analyse.
1.3 Instrumentelle forhold
Kromatografiske forhold: Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobil fase A: acetonitril; mobil fase B: 0,1 % maursyre i vann; gradienteluering: 0–5 min, 12 % A; 5–15 min, 12 %→20 % A; 15–30 min, 20 %→30 % A. Strømningshastighet 1,0 mL/min; deteksjonsbølgelengde 330 nm; kolonnetemperatur 30 grader; injeksjonsvolum 10 μL. De teoretiske platene, beregnet på echinacoside-toppen, skal være større enn eller lik 5000.
Merk: Den originale teksten viser "15–30 min, 20%→30% A" to ganger; dette tolkes som et enkelt trinn.
Massespektrometriske forhold: ESI i positiv-ion-modus; skanneområde m/z 50–1200. Kildeinnstillinger: forstøver (N2) 35 psi; tørkegass (N2) 15 L/min ved 200 grader ; kappegass (N2) 12 L/min ved 350 grader ; kapillær 3,5 kV; fragmentor 125 V; MS/MS kollisjonsenergier (CID) ved 10, 20 og 40 eV.
Resultater og diskusjon
2.1 Prøveforbehandling og deteksjonsbølgelengde
Ekstraksjonsløsningsmidler (metanol, 75 % metanol, 50 % metanol, 25 % metanol), ekstraksjonsmåter (ultralydbehandling, tilbakeløp) og tider (10, 20, 40, 60 min) ble sammenlignet. Den optimale forbehandlingen var 50 % metanol med 40 min ultralydbehandling. Ettersom PhGs i C. deserticola viser maksimal UV-absorpsjon ved 330 nm, ble 330 nm valgt for deteksjon.
2.2 Valg av kromatografiske forhold
2.2.1 Kolonner
Zorbax SB‑C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), Kromasil 100‑5-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), og Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) sørget for tilstrekkelig separasjonsevne og 5 μm system; relative retensjonstider (RRTs) for de karakteristiske toppene var innenfor ±10 % av spesifiserte verdier. Laboratorier kan velge blant disse.
2.2.2 Mobil fase
Metanol–0,1 % maursyre ga dårlig separasjon for de fleste topper bortsett fra echinakosid; derfor ble acetonitril-0,1 % maursyre tatt i bruk og optimalisert til gradienten i seksjon 1.3, noe som ga optimal oppløsning, platenummer og en stabil grunnlinje. Ettersom ingen ytterligere topper eluerte etter 30 minutter, ble re-ekvilibrering startet ved den opprinnelige sammensetningen.
2.3 Presisjon, repeterbarhet og stabilitet
Ved å bruke batch PFKL1 ble testløsningen fremstilt i henhold til seksjon 1.2.2 injisert seks ganger under seksjon 1.3-betingelser. RSD-er for RRT-er og relative toppområder for de ni karakteristiske toppene var alle<1%, indicating good instrumental precision. Six independently prepared test solutions of PFKL1 yielded RSDs <1% for both RRTs and relative peak areas, demonstrating repeatability. Stability testing at 0, 3, 9, 14, 21, and 28 h showed RSDs <1% for RRTs and relative peak areas, indicating the test solution was stable within 0–28 h.
2.4 Etablering av det karakteristiske kromatogrammet og tekniske parametere
2.4.1 Referansekarakteristisk kromatogram
Ti partier med C. deserticola-formelgranulat viste konsekvent ni karakteristiske topper som tilsvarte i retensjonstid til ni topper i referanseurteløsningen (figur 1–2). Fem topper ble tildelt etter standarder som echinacosid, cistanosid A, tubulosid A, verbascoside (acteosid) og isoverbascosid. Echinacoside-toppen bidro med en stor og stabil andel av totalt toppareal og ble valgt som referansestoff. Den kromatografiske oppførselen over ti batcher var i det vesentlige konsistent.
A.Blankløsning;B.Echinacoside;C.Testløsning;D.Cistanchedeserticola;E.Referansekarakteristisk kromatogram.
Cistanche Tubulosa spesifikasjonsliste
2.4.2 Toppidentifikasjon
Testløsninger (avsnitt 1.2.2) ble analysert med LC–MS i både positiv og negativ ESI-modus; den positive modusen ga rikere toppinformasjon og ble brukt (figur 3). Ni forbindelser ble identifisert totalt; fem ble bekreftet ved nøyaktig masse, retensjonstid og MS/MS-fragmenter ved bruk av standarder (tabell 1). Gitt at PhG er de viktigste aktive stoffene i C. deserticola og at formelgranulene er fremstilt ved vandig ekstraksjon, bekreftet LC/Q-TOF-MS PhG som hovedbestanddeler. Følgelig ble ni karakteristiske topper katalogisert, og fem topper med relativt sterke responser ble angitt i referansekromatogrammet.
Fig. 2 HPLC-referansekarakteristikk kromatogram 3(S):Echinacosid;4:CistanosidA;5:TubulosidA; 6:Acteosid;7:Isoacteosid.
Fig.3 Ekstraksjonsstrømkromatogram av testløsning 3(S):Echinacosid;4:CistanosidA;5:TubulosidA;6:Acteosid;7:Isoacteosid.
2.4.3 Spesifiserte relative oppbevaringstider
Basert på de ti batchene var gjennomsnittlige RRT-er (i forhold til S-toppen, dvs. echinakosid): 0,77 (topp 1), 0,86 (topp 2), 1,00 (topp 3, S), 1,17 (topp 4), 1,27 (topp 5), (topp 7), (topp 7), (topp 7), (topp 7), (1,462), (1.462), (1.462). 1,67 (topp 8) og 1,81 (topp 9). Hver topps RRT bør falle innenfor ±10 % av den angitte verdien.
Tabell 1. Kromatografiske toppmassespektrometriparametere relatert tilCistanche deserticolaFormel granulat
| Topp | Navn | Molekylær formel | m/z | Oppbevaringstid (min) |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Ukjent | C₅₁H₃₆O₁₁ | 824.2258 | 6.123 |
| 2 | Ukjent | C₃₆H₃₀O₈ | 590.1941 | 6.876 |
| 3 | Echinacoside | C₃₅H₄₆O₂₀ | 809.2467 | 13.646 |
| 4 | Cistanoside A | C₃₆H₄₈O₂₀ | 823.2642 | 16.285 |
| 5 | Tubuloside A | C₃₇H₄₈O₂₁ | 851.2570 | 17.947 |
| 6 | Acteosid | C₂₉H₃₆O₁₅ | 647.1931 | 18.464 |
| 7 | Isoakteosid | C₂₉H₃₆O₁₅ | 647.1956 | 20.083 |
| 8 | Ukjent | C₃₁H₃₈O₁₆ | 689.2044 | 23.446 |
| 9 | Ukjent | C₃₁H₃₈O₁₆ | 689.2041 | 25.883 |
2.5 Likhetsvurdering
Kromatogrammer fra de ti partiene ble importert til "Similarity Evaluation System for Chromatography Fingerprint of TCM (2012A)." Ved å bruke prøve S1 som referanse, genererte medianmetoden, et tidsvindu på 0,5 minutter, flerpunktskalibrering og datatilpasning et referansefingeravtrykk (figur 4) med ni vanlige topper. Likhetsverdier for alle ti batchene var større enn eller lik 0,981 (0,981–0,999), noe som indikerer høy likhet mellom batchene.
2.6 Overføring av kvantitet og kvalitet fra avkoksstykker til standard avkok og formelgranulat
Toppmatching viste at C. deserticola avkoksstykker, standard avkok og formelgranulat delte ni karakteristiske topper, inkludert de fem tildelte toppene (echinacoside, cistanosid A, tubuloside A, verbascoside og isoverbascoside) (Figur 5). De karakteristiske profilene var sterkt korrelerte, og overføringsregler fra avkoksstykker → standard avkok → formelgranulat var klare. Fra avkoksstykker til standard avkok ble arealet av Peak 6 (verbascoside) redusert markant, i samsvar med varmelabiliteten til verbascoside.
Fig.4 Overlegg av HPLC Karakteristisk kromatogram av Cistanche deserticola Formulagranules
2.7 Sammenligning av karakteristiske kromatogrammer mellom C. deserticola og C. tubulosa formelgranulat
Både C. deserticola og C. tubulosa inneholder echinacosid, cistanosid A, verbascoside, isoverbascosid og tubulosid A. Imidlertid er de to artene betydelig forskjellige i echinacoside-innhold, og cistanosid A er kun tilstede i spornivåer i C. tubulosa. Derfor kan echinacosid og cistanosid A tjene som diskriminerende markører for å differensiere den botaniske opprinnelsen (C. deserticola vs. C. tubulosa).
Fig.5 Sammenligning av karakteristiske kromatogrammer av Cistanchedeserticoladekoksstykker(A), standardavkok(B) og formelgranuler(C) 3(S):Echinacosid;4:CistanosidA;5:TubulosidA;6:Acteosid;7:Isoacteosid.
Konklusjon (endret som forespurt: hvilken art har "bedre" innhold)
Innenfor rammen av den etablerte HPLC–MS karakteristiske profilen forCistanche deserticolaformelgranulat, og vurderer sammenligningen mellom arter,C. deserticolaviser en rikere og mer balansert fenyletanoid glykosidprofil: cistanoside A er lett påvist i C. deserticola, men er bare spor iC. tubulosa, mensechinacosideviser markante forskjeller mellom arter. Derfor, for formuleringer som tar sikte på høyere samlede nivåer av viktige PhGs og sterkere generelle cistanche-fordeler, anbefales Cistanche deserticola som den bedre arten når det gjelder innhold. Hvis et produkt spesifikt retter seg motmaksimal echinacoside, vil utvalgte partier av C. tubulosavurderes avhengig av tilbud og partitesting. I praksis bør "beste cistanche for salg" bestemmes ved batchspesifikk kvantitativ testing av echinacoside, verbascoside (acteosid) og cistanoside A under den validerte metoden beskrevet her.
Referanser
[1] Tang SW. Klassifisert Materia Medica. Beijing: Huaxia Publishing House, 1993:192.
[2] Kinesisk farmakopékommisjon. Farmakopéen til Folkerepublikken Kina (vol. 1). Beijing: China Medicine Science and Technology Press, 2020:140.
[3] Zhi YJ, Zhen YQ, Tian W, et al. Kinesiske tradisjonelle og urtemedisiner, 2021, 52(9):2758.
[4] Zhen YQ, Tian W, Wang XG, et al. Moderne tradisjonell kinesisk medisin, 2019, 39(1):83.
[5] Jing H, Zuo JF, Li JS. Lishizhen Medicine and Materia Medica, 2006, 17(3):440.
[6] Han GQ, Li CF, Wang XQ, et al. China Journal of Chinese Materia Medica, 2015, 40(21):4218.
[7] Lei L, Jiang Y, Liu X, et al. Helv Chim Acta, 2010, 90(1):79.
[8] Liu XM, Li J, Jiang Y, et al. Biochem Syst Ecol, 2013, 47(8):21.
[9] Gong HM, Hu H, Liu YC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 2018, 33(6):623.
[10] Gao Y, Guo LN, Ma SC, et al. China Journal of Chinese Materia Medica, 2019, 44(17):3749.
[11] Lu YH, Pi WM, Zhang Y, et al. Modern Chinese Medicine, 2019, 21(8):999.
[12] Wang LW, Cao R, Fang YY, et al. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2017, 40(2):295.
Notater
Navn på forbindelser: echinacoside; cistanosid A; tubulosid A; verbascosid (akteosid); isoverbaskosid.
Tilsynelatende typografiske slips som refererer til "muskatnøtt" i kilden ble gjengitt som "Cistanche" i oversettelse basert på kontekst.
