Karakterisering av kaffeoylkinsyrer fra Lepisorus Thunbergianus og deres melanogenese-hemmende aktivitet

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Hak Hyun Kim, Jae Kwon Kim, Jaehyun Kim, Se-Hui Jung,* og Kooyeon Lee*

ABSTRAKT:Hyperpigmentering som følge av overaktivering av tyrosinase fører til mørkere flekker eller flekker på menneskehuden. Selv om disse fenomenene er ufarlige, er det fortsatt stor etterspørsel etter melanogenese-hemmere for å forhindre hyperpigmentering ved å hemme tyrosinase, et hastighetsbegrensende enzym i melanogenese. Selv om Lepisorus thunbergianus har blitt brukt i folkemedisiner som et vanndrivende og hemostatisk middel, har dens effekt på melanogenese ennå ikke blitt rapportert. I denne studien forberedte vi et L.thunbergianus-ekstrakt og dets løsemiddelfraksjoner og evaluerte deres biologiske aktivitet mot frie radikaler og melaninsyntese. Ekstrakten av L. thunbergianus hemmet sopptyrosinaseaktivitet mer effektivt enn, og med lignende antioksidantaktivitet som arbutin in vitro. Sammenlignende evaluering av anti-melanogenese og anti-tyrosinase aktiviteten til L. thunbergianus løsemiddelfraksjoner viste at ved å hemme tyrosinaseaktivitet, har butanolfraksjonen det høyeste potensialet for hemming av melanogenesisin melanomceller. Vi fant ved strukturell analyse ved bruk av høyytelses væskekromatografi (HPLC) og NMR-spektroskopi at hovedforbindelsene i butanolfraksjonen var tre kaffeoylkinsyrederivater. De tre derivatene hadde lignende radikalfjernende og anti-tyrosinase-aktiviteter in vitro, mens bare 5-kaffeoylkinsyre hadde en hemmende effekt på -MSH-indusert melanogenese. Den hemmende effekten av 5-kaffeoylkinsyre ble verifisert ved å bestemme melanininnholdet og tyrosinaseaktiviteten i melanom etter behandling av cellene med en kommersiell forbindelse. Videre avslørte vi at 5-kaffeoylkinsyre hemmet melanogenese ved å chelatere et kobberkation fra et kobber-tyrosinasekompleks. Derfor kan 5-kaffeoylkinsyre eller butanol fraksjonert fra L. thunbergianus være nyttig i kosmetikk som et hudblekende middel.

Cistanche tubulosa: hudblekende middel.

INTRODUKSJON

Melanin, en gruppe naturlige pigmenter som finnes i de fleste organismer, spiller en viktig rolle i bruningen av frukt, sopp og grønnsaker og pigmenteringen i menneskets hud.1 Melaninis produsert fra aminosyretyrosin via en flertrinnsprosess som inkluderer enzymatisk oksidasjon og polymerisering. 2 Inhumans, melanin pigment syntetiseres av spesialiserte dendrittiske celle melanocytter lokalisert i krysset mellom epidermis og dermis der syntesen initieres ved eksponering for ultrafiolette (UV) stråler.3 Melanin pigment transporteres til keratinocytter for å beskytte huden mot UV-stråler og frie radikaler; derfor bestemmes hudfargen av fordelingsmønsteret til melaninpigmentet.2 Dysregulering av melaninsyntesen fører til mange former for hyperpigmentering, som melasma, fregner, aldersflekker, solar lentigo, postinflammatorisk hyperpigmentering og andre hyperpigmenteringssyndromer.4 Mer enn en hundre proteiner er relatert til tomelaninsyntese, og blant dem er tyrosinase det hastighetsbegrensende enzymet som er anerkjent som ansvarlig formelaninsyntese.5 Derfor er de fleste forskningsarbeid for å forhindre hyperpigmentering fokusert på identifisering, isolering, syntese og karakterisering av nye potente tyrosinasehemmere for forebygging av melanogenese.1,6 En rekke tyrosinasehemmere, som kojinsyre, arbutin, hydrokinon, azelainsyre, ellaginsyre og traneksaminsyre, har blitt populært brukt i kosmetikkindustrien som anti-melanogenesemidler; men på grunn av begrensningene til kjemiske legemidler, som inkluderer cytotoksisitet og bivirkninger, er det fortsatt etterspørsel etter nye materialer med forbedret sikkerhet, stabilitet og effektivitet.7

Naturlige produkter, inkludert planter, bakterier og sopp, har blitt alternative kilder for oppdagelsen av effektive hudblekende ingredienser på grunn av deres mindre toksisitet og bedre biokompatibilitet og biotilgjengelighet.1,8 Lepisorus thunbergianusis en bregne som tilhører Polypodiaceae, som vokser knyttet til gamle bergarter eller barken av trær og er distribuert i de tempererte områdene i Øst-Asia, som Korea, Japan, Kina, Filippinene og Indokina. L. thunbergianus har blitt brukt som adiuretisk, hemostatisk middel og er hostestillende i koreanske folkemedisiner. Tidligere studier rapporterte at et L. thunbergianusekstrakt har topisk antilipidperoksidasjonsaktivitet i lokal og antioksidantaktivitet.9 Videre viste L. thunbergianusekstraktet betydelig konsentrasjonsavhengig vekstinhibering i munnhulekreft og tykktarmskreftceller.10 L. thunbergianusekstraktet kan ha potensielle bruksområder. i kosmetikkindustrien fordi denne planten inneholder forskjellige flavonoidforbindelser og en rekke bioaktive molekyler, som inkluderer quercetin 3-metyleter-glukosid, vitexin, orientalsk, periodisk-glukosid, isovitexin, orientin, Corentin og koffeoylkinikacid-effekten.9a L. thunbergianus ekstrakt onmelaninsyntese i melanocytter har ennå ikke blitt belyst.

Figur 1. Analyse av L. thunbergianus-ekstraktet for (A) ABTS-radikalfjerning, (B) anti-tyrosinase og (C) intracellulær ROS-rensende aktiviteter

I denne studien forberedte vi L. thunbergianus-ekstraktet og dets løsemiddelfraksjoner via seriell fraksjonering og undersøkte de hemmende effektene av løsningsmiddelfraksjonene på melaninbiosyntese i B16F10 melanomceller. Vi identifiserte butanol (n-BuOH)-fraksjonen som en hoveddel som inneholder den naturlige inhibitoren og karakteriserte ytterligere effektene av kaffeoylkinsyrederivater isolert fra L. thunbergianus-ekstraktene på hemming av melaninbiosyntese.

cistanche anmeldelse: antioksidasjon

RESULTATER OG DISKUSJON

Etanolekstrakt av L. thunbergianus fjerner 2,2′-Azinobis(3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre (ABTS) radikal og hemmer tyrosinaseaktivitet.

Utvinningen av L. thunbergianus med 70 prosent etanol (EtOH) ble utført for å vurdere den potensielle hemmende aktiviteten til naturlige forbindelser i planten. Den radikalfjernende aktiviteten til L.thunbergianus-ekstraktet ble bestemt i konsentrasjonsområdet 2-200 ug/ml. Etanolekstraktet viste konsentrasjonsavhengig radikalfjernende aktivitet med maksimal effekt ved 50 ug/ml hvor resultatet var i overensstemmelse med arbutin brukt som en positiv kontroll (figur 1A).

Vi evaluerte også den hemmende effekten av ekstraktet på sopptyrosinaseaktivitet ved å måle hastigheten på dopakromsyntese katalysert av tyrosinase. Etanolekstraktet hemmet 87 prosent av tyrosinaseaktiviteten ved 500 ug/ml, mens arbutin bare hemmet 38 prosent av tyrosinaseaktiviteten ved samme konsentrasjon (figur 1B). Deretter evaluerte vi den rensende aktiviteten til ekstraktet på intracellulær ROS økt med 100 μM hydrogenperoksid. Behandling med hydrogenperoksid induserte en ca. 2.1- ganger økning i det intracellulære ROS-nivået til B16F10-celler (figur 1C). Vi fant at den hydrogenperoksid-medierte økningen av intracellulær ROS ble fjernet av ekstraktet på en doseavhengig måte: den maksimale renseaktiviteten ved 100 ug/ml var 78 prosent (figur 1C). Disse resultatene tyder på at etanolekstraktet av L. thunbergianus inneholder bioaktive ingredienser som hemmer tyrosinaseaktivitet, så vel som fjerner ABTS-radikal og intracellulær ROS.

cistanche deserticola-ekstrakt: hemmer tyrosinaseaktivitet.

Hemmende potensial for L. thunbergianus fraksjoner mot melanogenese.

A crude EtOH extract was fractionated with various solvents including hexane (Hex), methylene chloride (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc), and butanol to identify and characterize ingredients inhibiting melanogenesis. To identify which solvent fractions have the potential against melanin synthesis, we performed a comparative analysis of four different L. thunbergianus solvent fractions for the radical scavenging and anti-tyrosinase activities. First, to evaluate the antioxidant activity of the four solvent fractions of the L. thunbergianus extract, we determined the ABTS radical scavenging activities in the concentration range of 2−200 μg/ mL. All fractions showed a concentration-dependent increase in ABTS radical scavenging activity (Figure 2A). In particular, EtOAc and n-BuOH fractions completely scavenged the ABTS radical at a 50 μg/mL concentration. The ABTS radical scavenging activity was in the order of n-BuOH > EtOAc >CH2Cl2 > Hex, som er i samsvar med forrige rapport.10b Videre økte de hemmende effektene av ulike løsemiddelfraksjoner ontyrosinaseaktivitet på en konsentrasjonsavhengig måte: de maksimale hemmende aktivitetene til n-Hex og CH2Cl2fraksjoner var under 65 prosent, men de av EtOAc og n-BuOH-fraksjoner var over 70 prosent (figur 2B). Den hemmende aktiviteten var i størrelsesorden n-BuOH > EtOAc > CH2Cl2 > n-Hex. Disse resultatene tyder på at flere hydrofile fraksjoner, inkludert n-BuOH og EtOAc fraksjoner, viste høyere radikalfjernende aktivitet og bedre hemmende aktivitet enn de lipofile n-Hex og CH2Cl2 fraksjoner .

Deretter ble effekten av L. thunbergianus løsemiddelfraksjonene på melanomcelleproliferasjon undersøkt ved å behandle B16F10-celler med 200 ug/mL hver av forskjellige fraksjoner eller 2mg/mL arbutin i tilstedeværelse av et -melanocytt-stimulerende hormon (-MSH), som er velkjent for å fremme melanogenese gjennom mikroftalmiassosiert transkripsjonsfaktor (MITF) induksjon.11 Resultatene viste at ingen av fraksjonene hadde noen signifikant effekt på melanomcelleproliferasjon (Figur 2C). Vi undersøkte deretter den hemmende effekten av løsemiddelfraksjonene på melanogenese stimulert av -MSH i melanomceller. Behandling med -MSH induserte en ca. 2.0- ganger økning i det intracellulære melanininnholdet i B16F10-celler (figur 2D). Vi fant at -MSH-mediert melanogenese ble fullstendig hemmet av n-BuOH-fraksjonen (p < 0,01)="" og="" delvis="" hemmet="" av="" etoacfraksjonen="" (40="" prosent="" ,="" p="">< 0,01),="" mens="" -msh-mediert="" melanogenese="" ikke="" ble="" signifikant="" endret="" av="" n-hex="" og="" ch2cl2-fraksjoner="" (figur="" 2d).="" videre="" ble="" de="" hemmende="" effektene="" av="" løsemiddelfraksjoner="" på="" tyrosinaseaktivering="" mediert="" av="" -msh="" bestemt="" siden="" tyrosinase="" spiller="" en="" nøkkelrolle="" i="" melanogenese.="" av="" -msh,="" mens="" n-hex-="" og="" ch2cl2-fraksjoner="" ikke="" gjorde="" det,="" som="" vist="" i="" figur="" 2e.="" dessuten="" ble="" den="" rensende="" effekten="" av="" forskjellige="" løsningsmiddelfraksjoner="" på="" den="" intracellulære="" ros-økningen="" stimulert="" av="" hydrogenperoksid.="" alle="" løsemiddelfraksjoner="" reverserte="" den="" intracellulære="" ros-økningen="" mediert="" av="" hydrogenperoksid,="" som="" vist="" i="" figur="" 2f.="" disse="" resultatene="" indikerer="" at="" buoh-fraksjonen="" til="" l.="" thunbergianus="" inhiberte="" -msh-indusert="" melaninsyntese="" ved="" å="" hemme="" den="" intracellulære="" tyrosinaseaktiviteten="" i="" b16f10-celler.="" videre="" tyder="" disse="" resultatene="" på="" at="" de="" bioaktive="" ingrediensene="" som="" hemmer="" melaninsyntesen="" var="" hydrofile="" og="" hovedsakelig="" ble="" funnet="" i="">

Figur 2. Effekter av løsemiddelfraksjoner på ABTS-radikalfangende, anti-tyrosinase- og anti-melanogenese-aktiviteter.

Identifikasjon og karakterisering av bioaktive forbindelser av L. thunbergianus-ekstrakt.

For å identifisere og karakterisere ingredienser som hemmer melanogenese, ble det utført høyytelses væskekromatografi (HPLC) analyse for alle løsemiddelfraksjoner. HPLC-analyse av løsemiddelfraksjoner viste at alle fraksjoner inneholder tre hovedforbindelser ved retensjonstider på 21, 28 og 29 minutter for henholdsvis forbindelse 1, 2 og 3 (figur 3A-D). Disse tre hovedforbindelsene ble ytterligere isolert ved preparativ HPLC-rensing. Mengdene av de tre hovedforbindelsene i n-BuOH-fraksjonen ble bestemt ved bruk av kommersielle kaffeoylkinsyrederivater som interne standardmolekyler, i henhold til forrige rapport.12

De isolerte forbindelsene ble deretter identifisert ved sammenligning av deres 1H og 13C NMR-data med litteraturen og ble funnet å være i samsvar med de foreslåtte strukturene (Figur 4).13 Figur 3E viser molekylstrukturen til de tre forbindelsene. Forbindelse 1 (utbytte, 3,2 ± 0,1 mg/100 mg n BuOH-fraksjon) ble oppnådd som et blekgult pulver. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) 5 9,66 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,49 (1H, d, J=15,9 Hz), 7,04 (1H, s), 6,99 ( 1H, d, J=8,2 Hz), 6,78 (1H, d, J=8,1 Hz), 6,23 (1H, d, J=15,9 Hz), 5,20( 1H, m), 5,08 (1H, brs), 4,89 (1H, brs) 4,13 (1H, m), 3,84 (1H, m), 3,56 (1H, s), 3,35 (1H, s), 1,99 (1H, m), 1,92 (1H, m), 1,89 (1H, m), 1,79 (1H, m). 13C{1H} NMR (100 MHz, DMSO-d6) 8 (176,42, 168,10, 148,14, 145,53, 144,75, 125,65, 121,07, 115,75, 111,42, 7, 72, 71, 72, 7, 72, 7, 7, 7, 7, 7, 7, 7, 7, 7, 7, 7, 7. Forbindelse 1 ble identifisert som 3-kaffeoylkinsyre ved NMR-analyse og ved sammenligning med forrige litteratur.13b

Forbindelse 2 (utbytte, 14,1 ± 0,1 mg/100 mg n-BuOH-fraksjon) ble oppnådd som et blekgult pulver. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) 5 9,64 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,52 (1H,d, J=15,9 Hz), 7,06 (1H, s), 7,02 ( 1H, d, J=8,1 Hz) 6,79 (1H, d, J=7,9 Hz), 6,30 (1H, d, J=15,9 Hz), 4,85 ( 1H, brs), 4,70 (1H, d, J=4,9 Hz), 4,12 (1H, brs), 3,95 (1H, m), 1,97 (2H, m), 1,88 (1H, m), 1,83 (1H, m). 13C{1H} NMR (100MHz, DMSO-d6) 8 (176.02, 166.27, 148.28, 145.55, 144.77, 125.54, 121.19, 115.76, 1114.68, 7.6, 4.6, 4.6, 4.6, 7.6, 7.6. Forbindelse 2 ble identifisert som 5-kaffeoylkinsyre ved NMR-analyse og ved sammenligning med tidligere litteratur.13c

Forbindelse 3 (utbytte, 3,9 ± 0,2 mg/100 mg n-BuOH-fraksjon) ble oppnådd som et blekgult pulver. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) 5 9,64 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,52 (1H,d, J=15,9 Hz), 7,06 (1H, s), 7,02 ( 1H, d, J=8,1 Hz) 6,79 (1H, d, J=7,9 Hz), 6,30 (1H, d, J=15,9 Hz), 4,85 ( 1H, brs), 4,70 (1H, d, J=4,9 Hz), 4,12 (1H, brs), 3,95 (1H, m), 1,97 (2H, m), 1,88 (1H, m), 1,83 (1H, m). 13C{1H} NMR (100MHz, DMSO-d6) 8 (176.02, 166.27, 148.28, 145.55, 144.77, 125.54, 121.19, 115.76, 1114.68, 7.6, 4.6, 4.6, 4.6, 7.6, 7.6. Forbindelse 3 ble identifisert som 4-kaffeoylkinsyre ved NMR-analyse og ved sammenligning med tidligere litteratur.13a

Figur 3. HPLC-kromatogrammer av (A) n-Hex, (B) CH2Cl2, (C) EtOAc og (D) n-BuOH fraksjoner av L. thunbergianus og (E) struktur av de tre hovedforbindelsene.

Inhiberende potensiale for kaffeoylkinsyrederivater isolert fra L. thunbergianus mot melanogenese.

Deretter, for å identifisere den biologisk aktive ingrediensen som ligger til grunn for den potente anti-melanogenesen, bestemte vi den hemmende aktiviteten til de tre kaffeoylkinsyrederivatene isolert fra L. thunbergianus mot melaninsyntese i melanomceller. Først ble effekten av de tre derivatene på ABTS-radikaloppfanging undersøkt. Resultatene viste at de tre derivatene hadde lignende ABTS-radikalfjernende aktiviteter (figur 5A). Vi undersøkte deretter den hemmende effekten av de tre derivatene isolert fra L. thunbergianus ontyrosinaseaktivitet. De tre derivatene viste konsentrasjonsavhengig hemming av tyrosinaseaktivitet, med maksimal hemming ved en 200 μM konsentrasjon (Figur 5B). Videre undersøkte vi den hemmende effekten av de tre derivatene på -MSH-indusert melaninsyntese i B16F10-celler. Behandling med -MSH induserte en ca. 2.0- ganger økning i det intracellulære melanininnholdet i B16F10-celler (figur 5C). Interessant nok økte forbindelsene 1 (3-caffeoylquinicacid) og 3 (4-caffeoylquinic acid) melaninsyntesen signifikant med henholdsvis 25 og 23 prosent (Figur 5C, s.< 0.001),="" while="" compound="" 2="" (5-caffeoylquinic="" acid)="" completely="" reversed="" α-msh-induced="" melanogenesis="" (p="" <="" 0.001).="" these="" results="" suggest="" that="" the="" three="" caffeoylquinic="" acid="" derivatives="" with="" similar="" structures="" but="" different="" substitution="" sites="" have="" different="" biological="" activities="" on="" melanogenesis.="" furthermore,="" 5-caffeoylquinic="" acid="" has="" potent="" inhibitory="" activity="" against="">

Figur 4. 1H NMR-spektre for (A) 3-kaffeoylkinsyre, (B) 4-kaffeoylkinsyre og (C) 5-kaffeoylkinsyre og 13C NMR-spektre av (D) {{ 6}}kaffeoylkinsyre, (E) 4-kaffeoylkinsyre og (F) 5-kaffeoylkinsyre

Verifikasjon av anti-melanogenese-effekten til 5-kaffeoylkinsyre.

For å bekrefte den hemmende effekten av {{0}}kaffeoylkinsyre mot melanogenese, bestemte vi den hemmende effekten av kommersiell 5-kaffeoylkinsyre på melaninsyntese mediert av -MSH. Behandling med lavere konsentrasjoner av 0.1 og 0.2 mM 5-kaffeoylkinsyre økte litt melaninsyntese og intracellulær tyrosinaseaktivitet, mens høyere konsentrasjoner på 0,5 og 1 mm av forbindelsen reverserte -MSH-mediert melanogenese og intracellulær tyrosinaseaktivitet (Figur 6A, B) der resultatene er i samsvar med forrige rapport.14

Kaffeoylkinsyre er en fenolforbindelse dannet av en esterbinding mellom koffeinsyre og L-kinsyre. Kaffeoylkinsyre-derivater har vært kjent for å ha anti-melanogenese og anti-tyrosinase-aktiviteter samt ROS-rensende aktivitet. Tyrosinase er et multifunksjonelt kobberholdig metalloenzym med toverdige kobberkationer.1 Kaffeoylkinsyrederivater kan hemme tyrosinaseaktiviteten ved å chelatere et kobberkation som er ansvarlig for å opprettholde den aktive tilstanden til tyrosinase. For å forutsi interaksjonen mellom 5-kaffeoylkinsyre og tyrosinase, ble det utført en beregningsmolekylær dokkingstudie ved hjelp av Maestro-programmet. Den beste posisjonen for forbindelsen, dokket totyrosinase, er avbildet i figur 6C, D. Den molekylære dokkingstudien viste at 5-kaffeoylkinsyre interagerer med kobberion i en avstand på 2,43 Å og etablerer en serie π−πstabling med His 259, Asn 260, His 85 og His 263 rester og en H-binding med Arg 268. Videre var bindingsenergien mellom tyrosinase og 5-kaffeoylkinsyre -4,425 kJ/mol. Disse resultatene indikerer at 5-kaffeoylkinsyre kan hemme tyrosinaseaktivitet ved kobberkelering. For å bekrefte den hemmende mekanismen for melanogenese av 5-kaffeoylkinsyre, bestemte vi kobberchelateringsevnen til 5-kaffeoylkinsyre. Kobberchelateringsevnen til 5-kaffeoylkinsyre ble økt på en konsentrasjonsavhengig måte (Figur 6E). Dette resultatet antyder at 5-caffeoylquinicacid hemmer melaninsyntesen ved å chelatere en kobberkation som interagerer med tyrosinase.

Figur 5. Effekter av de tre caffeoylquinic acid derivater på radikal scavenging, in vitro anti-tyrosinase, og anti-melanogenese aktivitet i B16F10 celler.

MATERIALER OG METODER

Materialer

L. thunbergianus ble kjøpt fra nettmarkedet www.jirisangol.com (Korea) og tørket under omgivelsesforhold før bruk i denne studien. Reagenser, slik som 2,2'-sinkbis(3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre (ABTS) og 3-(4,5-dimetyltiazol-2- yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), et -melanocyttstimulerende hormon (-MSH), og enzymer, som sopptyrosinase, ble hentet fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaliumpersulfat (K2S2O8), pyrokatekolfiolett og 3,4-dihydroksy-L-fenylalanin (L-DOPA) ble kjøpt fra Alfa Aesar (Haverhill, MA, USA).

Ekstraksjon og fraksjonering av L. thunbergianus.

Tørket L. thunbergianus (80 g) ble pulverisert ved hjelp av en pulverisator (HBL-3500S, Samyang Electronics, Korea) og ekstrahert med 70 prosent EtOH tre ganger (800 ml, hver gang ) ved 70 grader i 3 dager. Det resulterende ekstraktet ble vakuumfiltrert ved bruk av Advantec-filterpapir nr. 1 og 2 (Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Japan) og konsentrert ved bruk av en Hei-Vap Advantage rotasjonsfordamper (Heidolph, Tyskland) for å oppnå 17,2 g av EtOHcrude-ekstraktet. Dette råekstraktet ble suspendert i dH2O (180 ml) og suksessivt fraksjonert med Hex, CH2Cl2, EtOAc og n-BuOH for å gi Hex (1,51 g, 8,8 prosent), CH2Cl2 (0,88 g, 5,1 prosent), EtOAc (3,95 g, 3,95 g). prosent), og n-BuOH (3,02 g, 17,6 prosent), som tidligere beskrevet.15 De resulterende ekstraktene og fraksjonene ble frysetørket og lagret ved -80 grader før bruk.

Bestemmelse av ABTS Free Radical ScavengingActivity.

For å evaluere antioksidantaktiviteten til L.thunbergianus-ekstrakter og dets løsemiddelfraksjoner, ble ABTS-radikalfjernende aktivitet bestemt, som tidligere beskrevet.16 For å generere ABTS-radikalet ble 10 mL 7 mMABTS blandet med 176 μL 140 mM kaliumperoksydisulfat i dH2O og inkubert i mørket ved romtemperatur (RT) i 16 timer før bruk. ABTS-radikalløsningen ble fortynnet med absolutt metanol for å oppnå en absorbans på nær 0,7 ved 734 nm. Alikvoter på 100 μL av hver ekstrakt eller fraksjoner i det angitte konsentrasjonsområdet på 2-200 ug/ml ble tilsatt 100 μL av den fortynnede ABTS-radikalløsningen og inkubert i 10 minutter i mørket ved romtemperatur. Absorbansen ble deretter målt ved 732 nm ved bruk av en SpectraMaxM5 multimodus mikroplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). ABTS-radikalfjerningsaktiviteten ble beregnet som følger

ABTS radikal rensende aktivitet ( prosent ) =1−(Asample/Acontrol)×100 (1)

In vitro tyrosinasehemming.

Den hemmende effekten av L.thunbergianus-ekstrakter og dets løsemiddelfraksjoner på tyrosinaseaktivitet ble vurdert ved mengden dopakromsyntetisert fra den katalytiske reaksjonen til tyrosinase. U/ml sopptyrosinase i 50 mM fosfatbufret saltvann (PBS; 8,1 mM Na2HPO4, 1,2 mM KH2PO4, pH 6,8, 2,7 mMKCl og 138 mM NaCl) i en 96-brønnplate og inkubert i 30 minutter ved RT. Deretter ble 100 μL 1 mM L-DOPA tilsatt hver brønn etterfulgt av inkubering i ytterligere 10 minutter ved 37 grader. Absorbansen til den resulterende løsningen ble målt ved 475 nm ved bruk av SpectraMax M5 multimodus mikroplateleser.

Cellekultur.

B16F10 murine melanomceller ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, USA) supplert med 10 prosent varmeinaktivert føtalt bovint serum (Gibco), 100 enheter/ml penicillin og 100 ug/ml strepcomycin (3G/mL) under fuktet 5 prosent CO2.

Cellelevedyktighet.

Levedyktigheten til B16F10-celler ble bestemt ved hjelp av en MTT-analyse, som tidligere beskrevet.18 Kort fortalt ble B16F10-celler sådd i 24-brønnplater med en tetthet på 1 × 104 celler pr. brønn. Etter 24 timer ble cellene behandlet med de angitte konsentrasjonene av L. thunbergianus-ekstrakter eller fraksjoner i 48 timer. Cellene ble deretter inkubert med MTT-løsning i 4 timer, og de reduserte formazankrystallene ble oppløst i DMSO. Den resulterende løsningen ble overført til 96-brønnplater, og absorbansen ble målt ved 540 nm ved bruk av SpectraMax M5multimode mikroplateleser.

Bestemmelse av intracellulære reaktive oksygenarter (ROS).

Det intracellulære ROS-nivået ble målt ved hjelp av et DCF/H2DCFDA cellulært ROS-analysesett (ab113851, Abcam), i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble B16F10-celler sådd i 48-brønnplater med en tetthet på 2 × 104 celler per brønn. Etter en 24 timers kultur ble cellene behandlet i 1 time med de angitte konsentrasjonene av L. thunbergianus-ekstrakter eller løsemiddelfraksjoner i 0,1 prosent bovint serumalbumin (BSA)-holdig kulturmedium uten fenolrødt. Cellene ble deretter inkubert med 100 μM hydrogenperoksid i 30 min. Etter vask med PBS ble cellene behandlet med 25 μMH2DCFDA i PBS i 45 min. ROS-nivået ble analysert av en mikroplateleser (Synergy H1, Biotek, Vermont, USA) utstyrt med et fluorescensfilter ved 485/545 nm (eksitasjons-/emisjonsbølgelengde). Den gjennomsnittlige relative fluorescensintensiteten for kontroll ble likestilt til 100 prosent, med behandlingsbetingelser beregnet proporsjonalt.

Bestemmelse av melanininnhold.

Melanininnholdet ble bestemt, som tidligere beskrevet, med noen modifikasjoner.19 Melanomcellene ble dyrket i en seks-brønns plate i 24 timer. De ble behandlet med de angitte konsentrasjonene av L. thunbergianus-ekstraktet eller dets løsningsmiddelfraksjoner i ytterligere 48 timer i nærvær av 100 nM -MSH. Etter vask to ganger med avkjølt Dulbeccos fosfatbufret saltvann supplert med kalsiumklorid og magnesiumklorid (D-PBS, Gibco), ble de resulterende cellene løsnet ved inkubering med en trypsin-EDTA-løsning. Etter sentrifugering ved 1000 rpm i 3 minutter ble cellepelleten oppløst i 150 μL 1 M NaOH inneholdende 10 prosent DMSO i 1 time ved 60 grader i 1 time. Melanininnholdet ble bestemt av absorbansen ved 405 nm ved bruk av mikroplateleseren.

Cistanche-ekstrakt hemmer melanin.

Bestemmelse av cellulær tyrosinaseaktivitet i melanomceller.

Tyrosinaseaktivitet i B16F10-celler ble undersøkt basert på mengden dopakrom produsert fra den katalytiske reaksjonen av intracellulær tyrosinase.20 Kort fortalt ble melanomceller dyrket i en seks-brønns plate i 24 timer etterfulgt av behandling med forskjellige konsentrasjoner av L.thunbergianus-ekstraktet eller dets løsningsmiddel. fraksjoner i ytterligere 48 hin tilstedeværelse av 100 nM -MSH. Etter vask to ganger med iskald D-PBS, ble cellene lysert i 200 μL radioimmunutfellingsanalyse (RIPA) buffer (Sigma-Aldrich) inneholdende protease- og fosfatasehemmere. Etter sentrifugering av cellelysatet samlet fra hver brønn ved 15, 000 g i 15 minutter, ble 100 μL av supernatanten blandet med 100 μL 1 mM L-DOPA i PBS (pH 6,8) etterfulgt av inkubering i 30 minutter ved 37 grader . Absorbansen til dopakrom ble målt ved 475 nm ved bruk av mikroplateleseren. Data ble normalisert med proteinkonsentrasjon bestemt av bicinchoninsyreanalysen.

Isolering og karakterisering av bioaktive forbindelser ved bruk av HPLC.

HPLC ble utført på YL{{0}}(Young Lin Instrument, Korea), utstyrt med en TC-C18-kolonne (4,6 mm, 250 mm og 5 μm, Agilent, USA), inkonjunksjon med et gradientsystem som består av løsemiddel A(0,2 prosent maursyre) og løsningsmiddel B (MeOH). Løsningsforholdet for hellingen ble satt til 0-5 min, 15 prosent B; 5−10 min, 15−20 prosent B; 10–15 min, 20–30 prosent B; 15–30 min, 30–40 prosent B; 30–37 min, 40–60 prosent B; 37–40 min, 60–100 prosent B; 40–45 min, 100 prosent B; 45–50 min, 100–15 prosent B; og 50−55 min, 15 prosent B. For å identifisere ingrediensene i løsemiddelfraksjoner ble den mobile fasen levert med en strømningshastighet på 1 ml/min, og påvisningen av eluering ble utført ved 330 nm. For å samle de bioaktive ingrediensene i løsemiddelfraksjonene, ble den mobile fasen levert med en strømningshastighet på 15,0 ml/min, og påvisningen av eluering ble utført ved 330 nm ved bruk av prep-HPLC (YL-9100 s, Young Lin Instrument, Korea ), utstyrt med en prep-C18 kolonne (4,6 mm, 212 mm, 10 μm, Agilent, USA), i forbindelse med et gradientsystem sammensatt av løsemiddel A (0,2 prosent maursyre) og løsningsmiddel B(MeOH). Hellingsløsningsmiddelforholdet ble satt til 0-10 min, 10 prosent B; 10-20 min, 10-15 prosent B; 20–40 min, 15 prosent B; 40–60 min, 15–20 prosent B; og 60–70 min, 30 prosent B.

Molekylær modellering.

Krystallstrukturen til sopptyrosinase for molekylær modellering var en Agaricusstyrosinase (PDB gjør: 2Y9X) hentet fra Protein DataBank (PDB). Enzymet ble fremstilt ved å bruke arbeidsflyten for forberedelse av proteinveiviseren innebygd i Maestro-programmet (Maestro, versjon 11.9.011, Schrödinger, LLC, NewYork, NY, USA, 2019). Vann og alle de andre molekylene som var tilstede i PDB-filene ble fjernet. Molekylær dokking ble utført ved bruk av induced fit docking (IFD)-protokollen (Schrödinger Suite 2019 Induced Fit Docking-protokoll), som tidligere rapportert.21

Kobberchelaterende evne.

Kobberchelateringsevnen til forbindelsene isolert fra L. thunbergianus ble bestemt i henhold til forrige rapport.22 Hvert kaffeoylkinsyrederivat (10 μL) i den angitte konsentrasjonen ble blandet med 280 μL 50 mM natriumacetatbuffer (pH 6,0), 6 μL 4 mM pyrokatekolfiolett løsning tilberedt i samme buffer, og 10 μL 1 ug/μL CuSO4·5H2O. Forsvinningen av den blå fargen ble observert ved å måle absorbansen ved 632 nm ved bruk av SpectraMax M5 multimodus mikroplateleser. Vann ble brukt som en kontroll i stedet for en prøve. Prosent kobberchelateringsaktivitet ble beregnet fra absorbansen ved 632 nm, som er som følger

kobberchelateringsevne( prosent )=1− (En prøve/en kontroll)×100 (2)

Statistisk analyse.

Alle data i denne studien ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) fra tre uavhengige eksperimenter. Statistiske analyser ble utført med GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Forskjellene mellom gjennomsnittsverdiene for kontrollen og de eksponerte gruppene ble analysert ved å bruke en enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Dunnetts post hoctest. Terskelen for statistisk signifikans for alle analyser var p < 0.05="">

KONKLUSJONER

I denne studien demonstrerte vi at L. thunbergianus-ekstraktene fjerner ABTS-radikaler og viser en kraftig hemmende effekt på melaninbiosyntesen uten signifikant cytotoksisitet. Abioaktiv ingrediens som eksisterer i L. thunbergianus og som inhiberer melanogenese ble isolert i n-BuOH-fraksjonen. Videre fant vi at de tre caffeoylquinic acid-derivatene er hovedforbindelser som finnes i n-BuOH-fraksjonen og at 5-caffeoylquinic acid er en viktig ingrediens for undertrykke melanogenese i melanomceller ved å hemme den cellulære tyrosinaseaktiviteten. Her isolerte vi en naturlig sammensatt hemmer 5-kaffeoylkinsyre fra L.thunbergianus-ekstraktet for å forhindre hyperpigmentering og avslørte dens hemmingsmekanisme som ligger til grunn for melanogenese. Derfor tyder våre funn på at 5-kaffeoylkinsyre og n-BuOH-fraksjonen isolert fra L. thunbergianus kan være nyttige i kosmetikk som hudblekende midler.

cistanche skiver