Karakterisert av en nedgang i fysiologiske funksjoner i individuelle organsystemer
Sep 15, 2022
Ta kontakt for mer informasjon
SAMMENDRAG
Svart te er den mest brukte tedrikken i verden og har konsekvent blitt rapportert å ha anti-aldringsfordeler. Hvorvidt teaflaviner, en type av de karakteristiske fytokjemikaliene i sort teekstrakter, er involvert i å regulere aldring og levetid hos forbrukere, er fortsatt stort sett ukjent. I denne studien viser vi at theaflaviner spiller en gunstig rolle i å forhindre aldersbegynnende tarmlekkasje og dysbiose, og forsinker dermed aldring i Drosophila. Mekanistisk regulerer theaflaviner kondensatsamlingen til Imd for å negativt styre overaktiveringen av Imd-signaler i fruktfluetarmen. I tillegg forhindrer teaflaviner DSS-indusert kolitt hos mus, noe som tyder på at teaflaviner spiller en rolle i å modulere tarmens integritet. Totalt sett avslører studien vår en molekylær mekanisme som teaflaviner regulerer tarmhomeostase, sannsynligvis gjennom å kontrollere Imd-koalescens.
INTRODUKSJON
Aldring, preget av en nedgang i fysiologiske funksjoner i individuelle organsystemer og en økende risiko for sykdom og død, innebærer akkumulering av skade på molekyler, celler og vev (Alavez et al., 2011; Bartke et al., 2019; Engeet al., 2017). Identifikasjon av funksjonelle materialer eller kjemikalier som forhindrer biologisk forringelse for å forsinke aldringsprosessen og forlenge levetiden er utvilsomt sentralt (Bar-ardo et al., 2017; Kapahi et al., 2017). Tidligere studier har rapportert at svart te, den mest konsumerte teen i verden, har betydelige aktiviteter som forsinker aldring (Cameron et al.,2008; Fei et al.,2017; Kumar og Rizvi, 2017; Naumovski et al.,2019 ; Peng et al., 2009; Xiao et al., 2020). Kosttilskudd med ekstrakter av svart te forlenger effektivt levetiden til forsøksdyr som ormer (Feet al., 2017), fruktfluer (Peng et al., 2009; Site al., 2011), mus (Site al., 2011). ; Xiao et al., 2020), og rotter (Kumar og Rizvi, 2017).
Det er velkjent at ekstrakter av svart te hovedsakelig inneholder to typer fytokjemikalier, nemlig katekiner og teaflaviner (TF) (Cameron et al.,2008; Kondo et al.,2019; Li et al.,2013), hvorav sistnevnte produseres fra katekiner av endogen polyfenoloksidase og peroksidase under oksidasjonsprosessen i produksjon av svart te (Li et al.,2013). En serie studier har identifisert katekinenes antialdringsrolle ved å forbedre oksidativt stress og aldersassosiert betennelse og redusere vevsskade (Cameron et al., 2008; Niu et al., 2013; Peng et al., 2009; Si et al. .2011; Waaner et al.,2015). Imidlertid har funksjonelle studier på bidragene til TF-er til aldring ligget mye bak de på katekiner, fordi det er vanskelig å trekke ut tilstrekkelige mengder TF-er fra svarte teblader for medisinske studier (Takemoto og Takemoto, 2018). Nylig er det utviklet flere biosyntetiske metoder for masseproduksjon av TF-er (Takemoto og Takemoto, 2018), noe som gjør det mulig å utforske de eksakte biologiske effektene av TF-er og de underliggende reguleringsmekanismene.
Nylig har økende sett med data fremhevet tarmens sentrale roller i aldring og levetidsmodulering (Guo et al., 2014; Jji et al., 2019; Maynard og Weinkove, 2018; Rothenberg og Zhang, 2019; Salazar et al. ,2018). Tarmepitelet, som fungerer som en selektiv barriere, tillater absorpsjon av næringsstoffer, ioner og vann og begrenser vertskontakt med skadelige enheter, inkludert mikroorganismer, diettantigener og miljøgifter (Capo et al., 2019; Nicholson et al. , 2012; Ryu et al., 2010). Som et vev med høy omsetning hos individer, gir tarmkanalen det beste levemiljøet for symbiotiske mikroorganismer, inkludert naturlige anaerobe forhold, rikelig med næringsstoffer og en passende temperatur og pH
Figur 1. Theaflaviner forlenger Drosophilas levetid og forbedrer klatreevnen
(A og B) Hunnlige fruktfluer ble dyrket med standardmat som ble supplert med 1 mg/ml eller 2,5 mg/ml teaflaviner (TF-er) eller uten TF-er som basal. Fluer ble overført til ferske hetteglass som inneholdt nye medier annenhver dag, og døde fluer har scoret gjennom hele den voksne levetiden. Overlevelseskurver (A) og gjennomsnittlig levetid (B) for hunnfluer ble analysert og vist.
(Cand D) Kvinnen w18 ble matet med standard Drosophila-mat (referert til Basal) eller med mat supplert med henholdsvis 1 mg/ml eller 2,5 mg/ETF. Seks uavhengige grupper av fluer i de angitte alderen (henholdsvis 10 dager, 30 dager, 40 dager og 50 dager) ble utsatt for kafé (C) og Fluorescein fôring (D) analyser. verdi, og danner nisjer okkupert av spesifikke bakteriearter i kroppen (Bonfini et al., 2016; Buchon et al., 2013; Nicholson et al., 2012). I mellomtiden påvirker disse symbiotiske mikroorganismene og deres metabolitter også direkte eller indirekte næringsprosessen; fordøyelse og absorpsjon; energibalanse; immunfunksjon; gastrointestinal utvikling og modning; og mange andre viktige fysiologiske aktiviteter (Bonfini et al., 2016; Broderick, 2016; Maynard og VVeinkove, 2018; Nicholson et al., 2012). Det gjensidig fordelaktige forholdet mellom de to symbiontene kan opprettholde stabiliteten og den dynamiske balansen i det intestinale mikroøkosystemet (Bonfini et al., 2016; Brodeerick, 2016; Broderick et al., 2014; Guo et., 2014; May-nard og Weinkove, 2018; Nicholson et al., 2012).
cistanche kan anti-aldring
En serie studier har vist at den medfødte immunresponsen er avgjørende for å opprettholde tarmmikrobiota homeostase og er bevart fra virvelløse dyr til virveldyr (Guillouet al., 2016; Guo et al., 2014; Ryu et al., 2006, 2010; Vijay- Kumar et al., 2010). I Drosophila er to viktige signalveier, nemlig Toll- og immunsvikt (Imd)-veier, involvert i de medfødte immunresponsene (Lu et al., 2020; Myllymakiet al., 2014; Valanne et al., 2011). Spesielt deler Drosophila Toll-banen likheter med pattedyrinterleukin-1-reseptoren (IL-1R) og MyD88-avhengige Toll-like receptor (TLR)-veier, mens Imd-banen er lik. til tumor necrosis factor receptor (TNFR) pathway og TRIF-avhengig TLR pathway i pattedyr (Imler, 2014; Myllymaki et al., 2014; Valanne et al., 2011). Disse to veiene kontrollerer ekspresjonen av antimikrobielle peptider (AMP) gjennom aktivering av NF-KB-transkripsjonsfaktorer (Imler, 2014; Myllymaki et al., 2014; Valanne et al., 2011).bioflavonoiderImd-signalveien aktiveres normalt av gramnegativ bakteriell infeksjon og resulterer i ekspresjon av et annet sett med AMP-er, slik som Attacin, Cecropin og Diptericin (Kleino og Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014). Ekspresjon av disse AMP-ene krever peptidoglykangjenkjenningsproteinet (PGRP)-LC-reseptoren i Imd-banen og den signalavhengige spaltningen og kjernefysiske translokasjonen av Relish, en NF-kB-familietranskripsjonsfaktor (Kleino og Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014). En fersk studie viste at amyloiddannelse er nødvendig for aktivering av Drosophila Imd-banen ved gjenkjennelse av bakterielle peptidoglykaner (Kleino et al., 2017). Hvorvidt dette Imd-kondensatet er involvert i andre biologiske prosesser, som vedlikehold av tarmhomeostase og aldringsregulering, er imidlertid stort sett ukjent.
I denne studien brukte vi fruktfluer og mus som dyremodeller for å undersøke rollene til TF-er i å kontrollere tarmens integritet og aldring. Vi viste at TF-er forsinker aldersbegynnende overproliferasjon av intestinale stamceller, beskytter mot dysbiose av tarmmikrobiomet og forhindrer aktivering av Imd-signalveien, og forlenger dermed levetiden i Drosophila. Ytterligere mekanistiske studier indikerte at TF-er negativt bidrar til Imd-signalering kan være gjennom blokkering av kondensering av Imd i stedet for ubiquitinering. Dessuten fant vi at TF-er er svært effektive for å forhindre DSS-indusert kolitt hos mus. Samlet avslører funnene våre en potensiell rolle for TF-er i modulering av Imd-atferd, som kan være nøkkelfaktoren i deres positive bidrag til tarmhomeostase og levetidsforlengelse.
RESULTATER
Kosttilskudd av theaflaviner forlenger Drosophilas levetid
For å undersøke om theaflaviner (TF-er) påvirker aldring og levetid hos Drosophila, oppdrettet vi kvinnelige w'118-fluer med standard oppdrettsmat som ble supplert med 1 mg/ml eller 2,5 mg/ml TF-er og utførte livstidsanalyser som tidligere beskrevet (Ji et al. ., 2019). Fluer matet en diett supplert med et likt volum av TFs løsemiddel (H2O) ble ansett som kontroller. Som vist i figur 1A, forlenget kosttilskudd av en relativt lav konsentrasjon av TF-er (1 mg/ml) fruktfluens levetid litt, og en høy konsentrasjon av TF-er (2,5 mg/ml) hadde en signifikant positiv effekt på levetidsforlengelsen. Spesielt resulterte langsiktig opptak av høye konsentrasjoner av TF-er (2,5 mg/ml) i omtrent 8 dager med økning i gjennomsnittlig levetid for hunnfluer (figur 1B), noe som tyder på en gunstig rolle for TFsin i å regulere levetiden i Drosophila. Lignende resultater ble oppnådd da vi testet de potensielle effektene av ytterligere TF-er på levetiden til mannlige w'*'''8 fluer (figurene S1A og S1B).
Figur 2. Theaflaviner forhindrer aldersbegynnende tarmdysfunksjon og mikrobiota dysbiose i Drosophila
(A og B) Tap av intestinal integritet ble analysert av Smurftesten i en alder av 10 dager, 30 dager, 40 dager og 50 dager av kvinnelige w18 voksne. Eksempler på ikke-smurf og smurf ble vist i (A). Prosentandeler av Smurf i forskjellige indikerte grupper ble analysert og vist i (B).
(C) Bakterieoverflod lagret ved qPCR av 16S rRNA-genet i kvinnelige w18-filer fra forskjellige indikerte grupper ble analysert og vist.
(DF) Sekvensering av det kommensale bakterielle 16S rRNA-genet ble utført. Andelene av bakteriell taxa (D), et varmekart over de viktigste mikrobielle taxaene (F), og den relative forekomsten av Gammaproteobacteria (F) ble analysert og presentert.
Figur 2. Fortsettelse
(G og H) Tarmene ble dissekert fra de angitte hunnfluene matet med 2,5 mg/ml TF-er eller uten TF-er som kontroll ved 10 dager og 40 dagers alder. Bilder av midtgut-lysbilder ble tatt med fluorescensmikroskopi for GFP-signaler (G). Statistisk analyse som viser prosentandelen av GFP-positive celler er vist i (H).
(I) Tarm fra de angitte hunnfluene ble samlet og utsatt for immunfargingsanalyser ved bruk av antistoffer mot fosforylert Histon 3(pH3) Statistiske resultater som kvantifiserer pH3-positive celler per tarm ble analysert og vist. I B, C, H og, analyseres data ved hjelp av den tosidede studentens test og vises som gjennomsnitt ± SEM.NS, ikke signifikant,*p<><0.001. see="" also="" figure="">
ETFer har vært kjent for å ha en bitter smak, og bitter mat unngås vanligvis av både forbrukere, inkludert fruktfluer og pattedyr (Yamazaki et al., 2014; Yang et al., 2018). Vi søkte deretter å belyse om TF-er kan påvirke Drosophila matinntak, fordi tidligere studier har bevist at kostholdsbegrensninger fører til forlenget levetid både hos virveldyr og virvelløse dyr (Hudry et al., 2019; Kapahi et al., 2017; Moger-Reischer et al. ., 2020). For å gjøre dette utførte vi først kaféanalysen, en mye brukt tilnærming for direkte og nøyaktig å måle fôringshastigheten ved å bruke en kapillærmater som inneholder et flytende medium, som tidligere beskrevet (Ja et al., 2007). Som vist i figur 1C og S1C, endret kosttilskudd av TF-er (henholdsvis 1 mg/ml og 2,5 mg/ml) knapt matforbruket til testede fluer. For ytterligere å bekrefte dette, brukte vi deretter Fluorescein som en matsporer (Rera et al., 2012; Wang et al., 2005) og utførte en naturlig fôringsanalyse (Danilov et al., 2015). Som vist i figurene 1D og S1D, klarte vi ikke å observere noen sammenhenger mellom TF-tilskudd og nivåer av matinntak. Samlet antydet resultatene våre at de fordelaktige rollene til TF-er for å forlenge levetiden kanskje ikke skyldes kostholdsbegrensninger hos Drosophila.
Ytterligere TF-er er unødvendige for å påvirke Drosophila energihomeostase
Det har blitt antydet at svart te polyfenoler har en positiv effekt på å forhindre fedme ved å hemme lipid- og sakkaridfordøyelse, absorpsjon og inntak, og dermed redusere kaloriinntaket (Cameron et al., 2008). Vi søkte deretter å belyse om TFs-regulert LDrosophila levetidsforlengelse skyldes endringer i næringsopptak og energilagring. For å gjøre dette undersøkte vi først nivåer av triacylglyceride (TAG), en av de mest påviste lipidmetabolittene (Tennessen et al., 2014), i hunnfluer gjennom hele livet som tidligere beskrevet (Fan et al., 2017).kjøpe cistancheSom vist i figur 1E, påvirket behandling av TF-er knapt den totale TAG-forekomsten på forskjellige alderspunkter. Da vi videre oppdaget glykogeninnhold og kvantifiserte sirkulerende karbohydrater (glukose og trehalose) ved hjelp av Hexokinase-settet (Li et al., 2018; Ten-nessen et al., 2014), viste resultatene at det ikke var noen åpenbare endringer mellom prøver med eller uten TF-behandling (figur 1F-1H). Merk at konsistente resultater ble oppnådd da vi undersøkte metabolske fenotyper ved å bruke hann w118 som dyremodeller (figurene S1E-S1H). Samlet antydet disse dataene at kosttilskudd av TF-er er unødvendig for regulering av karbohydrat- og energihomeostase gjennom hele levetiden til Drosophila.
Vi undersøkte videre kinetikken til den naturlige senescensen til Drosophila under kosttilskuddsintervensjon ved å utføre raske iterative negative geotaksis (RING)-tester som tidligere beskrevet (Dilliane et al., 2017; Staats et al., 2018). Som vist i figurene 1l, 1J, S1l og S1J, ble klatreindeksene for alderen (40 dager) w1118 (både kvinner og menn) i TF-tilskuddsgrupper markant forbedret (en nesten 12 prosent økning hos kvinner og nesten 18 prosent økning hos menn ) sammenlignet med kontrollgrupper, noe som tyder på at TF-er potensielt forbedrer Drosophila-klatring og lokomotoriske aktiviteter.
Theaflaviner forhindrer aldersbegynnende tarmlekkasje og mikrobiota dysbiose
Tidligere studier har vist at lokomotoriske aktiviteter og levetid for fruktfluer er sterkt relatert til vertens helsetilstand, slik som kjønn, kosthold, alder og genotype (Caruso et al., 2013; Heintz og Mair, 2014). Nylig har flere linjer bevist at bevaring av intestinal Imd-signaleringshomeostase forbedrer tarmens integritet ved å forhindre overspredning av ISC- og forløperceller og ved å forsinke aldersbegynnende intestinal epitelial dysfunksjon, som igjen bidrar positivt til organismehelse (Clark et al. , 2015; Guo et al., 2014). Hos Drosophila er en forkortet levetid nært assosiert med dysfunksjon av tarmepitelbarrieren, og utviklingen av integriteten til denne barrieren under aldring resulterer i levetidsforlengelse (Clark et al., 2015; Guoet al., 2014; Jet al., 2019). Derfor forsøkte vi å finne ut om TF-er endrer integriteten til tarmen ved å utføre Smurf-analysen, en metode som har blitt beskrevet tidligere (Clark et al., 2015; Rera et al., 2011). Som vist i figur 2A ble de testede fruktfluene der blå fargestoffer var begrenset til fordøyelseskanalen referert til som ikke-smurf (venstre panel i figur 2A). Hvis blå fargestoffer ble observert
Figur 3. Fortsettelse
(EG) Tarm ble isolert fra kvinnelige w1118-filer matet med 2,5 mg/ml TF-er eller uten TF-er som basal ved henholdsvis 10 dager, 30 dager, 40 dager og 50 dager gamle. Totalt RNA ble ekstrahert og utsatt for aRT-PCR-analyser. mRNA-ekspresjonsnivåene av diptericin (F), attacin (F) og cecropin A1(G) ble analysert og vist. I EG blir data analysert av den tosidede studentens t-test og vist som gjennomsnitt ± SEM.NS, ikke signifikant, *p<><><0.001. see="" also="" figure="">
lekkasje ut fra tarmene inn i magen, ble vertene regnet som Smurf (høyre panel i figur 2A). I samsvar med tidligere funn (Clark et al.,2015), økte proporsjonene av Smurf gradvis under aldring (Figur 2B). Interessant nok ble andelen Smurf-voksne sterkt redusert i gruppene som ble matet med TF-er sammenlignet med de aldersmatchede kontrollene hos begge kvinner (fra 8,2 prosent til 3,7 prosent, fra 19,4 prosent til 15,6 prosent, og fra 35,4 prosent til 27,1 prosent for gruppene i en alder av henholdsvis 30 dager, 40 dager og 50 dager, Figur2B) og mannlige voksne (fra 2,7 prosent til 0,9 prosent, fra 6,9 prosent til 0,9 prosent, og fra 8,3 prosent til 2,7 prosent i en alder av 30 år) henholdsvis dager, 40 dager og 50 dager, figur S2A), som indikerer at TF-er kan forhindre tarmbarrieredysfunksjon hos gamle fruktfluer. Det er verdt å merke seg at vi observerte større reduksjoner i Smurf-prosenten hos menn (redusert med nesten 65,8 prosent, 86,9 prosent og 67,4 prosent i en alder av henholdsvis 30 dager, 40 dager og 50 dager) enn de i alderen -matchede hunner (redusert med nesten 54,1 prosent, 19,5 prosent og 23,3 prosent i en alder av henholdsvis 30 dager, 40 dager og 50 dager), noe som antyder at TF-er kan spille en bedre rolle i å redusere tarmlekkasje hos hannfluer.
Tidligere studier har antydet at aldersbegynnende dysfunksjon i tarmbarrieren ofte er korrelert med dysbiose av tarmmikrobiota (Clark et al., 2015; Guo et al., 2014). Dermed undersøkte vi den intestinale kommensale bakteriesammensetningen etter TF-tilskudd. Vi brukte først universelle primere og utførte kvantitative PCR-eksperimenter for å kvantifisere de bakterielle 16S rRNA-gennivåene. Som vist i figur 2C, i eldre kutt, viste den totale bakteriepopulasjonen fra TFs intervensjonsgrupper en slående reduksjon (nesten 45 prosent -55 prosent) sammenlignet med kontrollene, noe som tyder på at TFs-tilskudd sannsynligvis forhindrer mikrobiotaekspansjon under aldring . Deretter utførte vi metagenomi for å undersøke i detalj endringene i det intestinale mikrobielle samfunnet forårsaket av kosttilskudd med TF-er. Som vist i figur 2D-2F, ble andelen av Gammaproteobacteria, hvis utvidelse ble funnet å være nært assosiert med tarmbarrieresvikt (Clark et al., 2015), åpenbart redusert av TF-tilskudd i gamle tarmer ( en nesten 7 prosent reduksjon), noe som antyder at TF-er bidrar positivt til homeostasen til tarmmikrobiotaen under aldring i Drosophila.
Theaflaviner forbedrer intestinal proliferativ homeostase i Drosophila
We further examined the intestinal integrity of flies that were treated with or without TFs. First, we employed the widely-used P{Esg-Gal4}/P{Uasp-GFP};{Tub-Gal80*s}strain(referred to as esgts>GFP), der tarmstamcellene (ISCs) og stamceller ble merket med GFP. Som vist i figurer 2G og 2H, var antallet GFP-positive celler i TFs intervensjonsgruppene ved en alder av 40 dager (20 tarmer ble talt) mye mindre (nesten 29,7 prosent) enn i de alderstilpassede kontrollene (nesten 47,6 prosent og 19 tarmer ble talt), noe som tyder på at TF-er kan hemme aldersbegynnende overspredning av ISC-er. Videre utførte vi immunfargingseksperimenter ved å bruke antistoffer mot Phospho-Histone 3(pH3), en spesifikk markør for mitotiske celler i tarmvev. Vi observerte færre pH-3-positive celler i tarmene fra eldre TF-supplerte voksne (gjennomsnittlig antall var 20,6) enn i de fra kontrollene (gjennomsnittlig antall var 39,5, figur 2). Samlet antyder resultatene våre at kosttilskudd med TF-er forbedrer tarmproliferativ homeostase og forhindrer aldersbegynnende mikrobiota-dysplasi, og dermed forsinker aldring i Drosophila.
Theaflavins modulerer negativt intestinale Imd-signaler
For å utforske de underliggende molekylære mekanismene som TF-er positivt bidrar til Drosophila-tarmhomeostase, utførte vi RNA-seq-analyse ved å bruke alderstilpassede tarmprøver fra kvinnelige w1118-voksne behandlet med eller uten TF-er. Fragmenter per kilobase per million (FPKM) analyser antydet at de generelle genuttrykksmønstrene var like mellom de to eksperimentelle gruppene (figur 3A). Ytterligere differensialekspresjonsanalyse identifiserte imidlertid totalt 229 differensielt uttrykte gener, hvorav 99 var oppregulert og 126 var nedregulert (Figur 3B). Interessant nok viste genontologianalyse av disse genene at immunresponsveien ble sterkt endret av kosttilskudd med TF-er (Figur 3C).
I Drosophila har medfødte immunsignalveier vist seg å spille en dominerende rolle i å regulere aldersbegynnende tarmhomeostase og lang levetid (Clark et al, 2015; Guo et al, 2014). Vi fokuserte deretter på å undersøke ekspresjonsmønstrene til de antimikrobielle peptidene (AMPs) nedstrøms for de medfødte immunsignalene. Som vist
Figur 4. Fortsettelse
(D) Rensede Imd-proteiner ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av TF-er (henholdsvis 50 uM, 100 uM og 200 uM) ved romtemperatur i 5 minutter. Prøver ble deretter utsatt for fluorescensemisjonsspekteranalyse ved bruk av de angitte bølgelengdene (eksitasjon ved 430 nm, emisjon fra 450 nm til 550 nm med en spaltebredde på 5 nm). En prøve uten TF-er ble brukt som baseline-kontroll.
（E and F）Lysates of guts from NP11>Myc-Imd-fluer ble tilberedt og inkubert med TF-er (100 μM) ved romtemperatur i 30 minutter. SDD-AGE (øvre panel i E) og SDS-PAGE (nedre panel i E) analyser ble utført for å analysere Imd-proteinaggregater. Tubulin ble brukt som lastekontroll.cistanchDensitometrianalyse ble utført for å kvantifisere Imd-kondensat i forskjellige prøver, og resultatene ble vist i (F). (G) Et representativt kromatogram av TFs-prøve.
（H og I） Rensede Flag-Imd-proteiner ble inkubert med TF-er, TF1, TF2a, TF2b eller TF3 (100 μM for hver prøve) eller med et likt volum buffer (kontroll) ved romtemperatur i 30 minutter som angitt. Prøver ble deretter utsatt for SDD-AGE (øvre panel i H) og SDS-PAGE (nedre panel i H) analyser for å bestemme aggregeringsmønstrene til Imd. Densitometrianalyse for å kvantifisere Imd-kondensat i forskjellige prøver ble utført og vist i (). I C, F og I analyseres data ved hjelp av den to-halede studentens test og vises som gjennomsnitt ± SEM.***p< 0.001.="" see="" also="" figure="">
i figur 3D, AMP-gener styrt av immunsvikt (Imd)-veien, inkludert diptericin A (DptA), dip-tericin B(DptB), attacin A(AttA), cecropin A1 (CecA1), cecropin A2(CecA2), og cecropin C (Cece), ble signifikant redusert (med henholdsvis 39,4 prosent, 72,3 prosent, 10,5 prosent, 86,5 prosent, 99,8 prosent og 36,1 prosent) i TF-behandlede grupper sammenlignet med kontrollgruppene. For ytterligere å bekrefte resultatene oppnådd fra RNA-seq-analyse, utførte vi en kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (gRT-PCR) for å kvantifisere de relative ekspresjonsnivåene av Imd-relaterte AMP-gener i Drosophila-tarmprøver oppnådd ved fire forskjellige alderspunkter inkludert 10 dager, 30 dager, 40 dager og 50 dager. Som vist i figur 3E-3G, ble mRNA-ekspresjonsnivåene til visse gener, inkludert diptericin, attacin og cecropin A1, signifikant redusert (med nesten 35,9 prosent -66,6 prosent) hos TF-behandlede gamle tarmer. Samlet avslørte dataene våre at TF-er potensielt antagoniserte aktiveringen av Imd-signalveien i Drosophila-tarmceller under aldring.
Theaflaviner er unødvendige for transkripsjonell regulering av Imd-banen eller ubiquitinering av Imd
Vi forsøkte å undersøke assosiasjonen mellom TF-er og Imd og utførte overflateplasmonresonansanalysen (SPR) som tidligere beskrevet (Lan et al., 2020). Som vist i figur 4A. TF-er viste moderat bindingsaffinitet med renset Imd-protein ved en estimert Kp-konstant på 8,078 uM. Deretter har vi en tendens til å bestemme hvordan TF-er kontrollerer den intestinale Imd-signalveien. Basert på resultatene av transkriptomanalyse fra RNA-seq-data, fant vi at ekspresjonsnivåene til de viktigste regulatoriske faktorene i Imd-signalveien, slik som PGRP-LC, Imd og Relish, knapt ble endret av TFs-behandling (Figur S3A) ). Vi samlet videre tarmprøver fra fluer som ble utsatt for kosttilskudd med eller uten TF-er i forskjellige aldre og utførte qRT-PCR-eksperimenter for å spesifikt oppdage ekspresjonsmønstrene til disse genene. Som vist i figur S3B, var mRNA-nivåene til visse gener, inkludert efffete, faded, tak1, pgrp-Ica, uev1a, bendless, relish, imd, pgrp-sc2, tab2, ird5 Kenny og diap2, lik mellom kontrollgruppene og TF-intervensjonsgrupper, noe som antyder at TF-er ikke er involvert i å regulere Imd-signaler på transkripsjonsnivå.
Deretter undersøkte vi Imd-ubiquitineringsprofilene fordi tidligere studier har antydet at ubigutinering av Imd er avgjørende for nedstrøms signaloverføring i Imd-banen (Myllymaki et al., 2014; Zhou et al., 2005). Vi utførte først en in vitro E1-skiftingsanalyse og fant at behandling med TF-er ikke har noen tilsynelatende innflytelse på de enzymatiske reaksjonene til E1 og ubiquitin for å danne konjugert E1 / Ub (figur S4A). Dessuten transfekterte vi Drosophila S2-celler med plasmider som uttrykker Flag-merket Imd sammen med HA-merket Ub og behandlet deretter cellene med eller uten TF-er. Ytterligere ubiquitineringsanalyser antydet at TFs-tilskudd knapt påvirket nivåene av ubiquitinert Imd i dyrkede celler (figur S4B og S4C). For å bestemme forholdet mellom TF-er og Imd-ubiquitinering in vivo, brukte vi den transgene fluen P {NP1-Gal4}/P{Uasp-Myc-Imd};P{Tub-Gal80*} (referert til som NP1* s > Myc-Imd), der et Myc-merket Imd-protein ble sterkt uttrykt i tarmceller (figur S4D). Ubiquitineringseksperimentene våre viste at kosttilskudd med TF-er var unødvendig for å modulere ubiquitineringen av Imd i tarmvev (figurene S4D og S4E). Samlet indikerte resultatene våre at TF-er negativt styrer Drosophila Imd-signaler ved ikke å påvirke ubiquitineringsmønsteret til Imd.
Theaflaviner forhindrer Imd-kondensatmontering
En fersk studie antydet at aggregering av Imd er avgjørende for aktivering av nedstrømsgener i Imd-veien (Kleino et al., 2017). Vi søkte deretter å undersøke om TF-er regulerer prosessen med
Figur 5. Fortsettelse
(F og G) Kvinne w18 (referert til som imd pluss / pluss ), imd' heterozygote og homozygote mutanter (referert til som henholdsvis imd pluss /- og imd-/-) ble oppdrettet standard Drosophila-mat (referert til som Basal) eller kosttilskudd med 2,5 mg/ml (referert til som TF-er) og deretter ble utsatt for levetidsanalyse. Overlevelseskurve (F) og gjennomsnittlig levetid (G) ble analysert og vist.
I og F ble Log Rank-testen brukt for statistisk analyse. I BE, og ble den tosidede Students t-testen brukt for statistisk analyse, og data er sh som gjennomsnitt ± SEM. NS, ikke signifikant, *s<0.05, **p="" <="" 0.01,=""><0.001. see="" also="" figure="">
Imd aggregatdannelse. Først renset vi Myc-merkede Imd-proteiner fra dyrkede S2-celler og inkuberte proteinene med forskjellige konsentrasjoner av TF-er (Figur 4B). Interessant nok fant vi at TF-er markant forhindret aggregering av Imd (redusert med 81,7 prosent -89,7 prosent, figur 4B og 4C), som antydet av våre semidenaturerende detergent agarosegelelektroforese (SDD-AGE)-analyser. For å bekrefte dette funnet, utførte vi ytterligere tioflavin-T-bindingsanalyser og oppnådde konsistente resultater (figur 4D). Sist tok vi opp NP1ts > Myc-Imd transgene fluer som ble utsatt for kosttilskudd med eller uten TF-er og samlet inn tarmprøver fra eldre voksne. SDD-AGE-eksperimentene antydet at aggregering av Imd ble kraftig nedregulert av TF-er i tarmceller (redusert med 16,7 prosent -22 prosent, figur 4E og 4F).
For å finne ut hvordan TF-er bidrar til å kontrollere Imd-kondensatsamlingen, utsatte vi TF-er for HPLCanal-ysis og fant ut at de hovedsakelig inneholdt fire typer monomerer (Figur 4G), nemlig teaflavin (TF1), teaflavin 3-O-gallat ( TF2a), teaflavin 3'-O-gallat (TF2b) og teaflavin 3,3'-di-O-gallat (TF3), som var i samsvar med tidligere rapporter (Li et al., 2013; Takemoto og Takemoto, 2018) . Deretter inkuberte vi hver av disse kjemikaliene med renset Imdprotein og utførte SDD-AGE-eksperimenter. Som vist i figurene 4H og 4l, resulterte behandling av alle disse TF-monomerene i en markant reduksjon (med henholdsvis 59,5 prosent, 60,9 prosent, 58,4 prosent ,58,2 prosent og 55,8 prosent for TF-er, TF1, TF2a, TF2b og TF3) i de samlede Imd-nivåene. Samlet antydet resultatene våre at TF-er negativt regulerer Drosophila Imd-signalveien sannsynligvis ved å kontrollere oppførselen til Imd-kondensat.
Theaflaviner forlenger Drosophilas levetid på en Imd-avhengig måte
To examine whether TFs prolong Drosophila lifespan depending on their regulatory role in Imd, we specifically knocked down Imd in gut tissues using the transgenic flies P{NP1-gal4)PITub-gal80*}/P{Uasp-imd-IR(KK)} (referred to as Imd RNAi). As shown in Figures 5A and 5B, dietary supplementation of TFs extended the lifespan of controls (elevation of nearly 7.2 days in the mean lifespan), whereas prevention of Imd expression in guts apparently reversed the lifespan extension caused by TFs. Consistent results were obtained when we utilized male Imd RNAi and control flies to perform lifespan assays (Figures S5A and S5B). Further qRT-PCR assays showed that the mRNA expression levels of AMP genes at ages of 10 days, 30 days, 40 days, and 50 days, including diptericin, attacin, and cecropin A1.hardly changed in the gut tissues of Imd RNAi flies(Figures 5C-5E), whereas additional TFs caused reductions of 31%-72.3% in mRNA abundances of these genes in samples from control groups. To confirm these results from Imd RNAi flies, we first performed lifespan assays using w18(control, referred to as imd+/+), imd' heterozygous (referred to as imd+/-), and homozygous(referred as imd-/-)mutant flies. We found that TFs addition extended lifespan and increased mean life longevity of imd+/-flies (elevation of nearly 6.2 days, Figures 5F and 5G). However, this lifespan extension effect by TFs was almost abolished in imd-/-flies (Figures 5F and 5G). Next, we performed lifespan assays utilizing Relish RNAi(NP1's>Relish RNAi and control(NP1ts>pluss )fluer. fordi Relish er nøkkeltranskripsjonsfaktoren som er ansvarlig for Imd-nedstrøms AMP-genuttrykk (Myllymaki et al., 2014). Som vist i Fiqures S5C og S5D. kosttilskudd av TF-er forlenget levetiden til kontrollfluer markant, og denne forlengelsen av levetiden ble betydelig forhindret hos Relish RNAi-fluer. Samlet indikerte dataene våre at kosttilskudd av TF-er positivt bidrar til Drosophilas levetid sannsynligvis avhengig av intestinale Imd-signaler.
For å se om forlengelsen av levetiden med TFstill skjer i en aksenisk bakgrunn, utførte vi levetidsanalyser ved å bruke w1118 hunner under akseniske forhold. Som vist i figurene S5E og S5F, påvirket tilsetningen av forskjellige konsentrasjoner av TF-er (1 mg/ml og 2,5 mg/ml) knapt forholdet mellom dødelighet og gjennomsnittlig levetid hos w18 voksne. Fordi akseniske oppvekstforhold i stor grad kan forhindre rikelig mikrobiota, og dermed begrense Imd-signaler i kutt (Clarke al., 2015), antydet dataene våre at TF-er forlenger Drosophila-levetiden kan være gjennom modulering av tarmmikrobiota-regulerte medfødte immunsignaler.
Figur 6. Theaflaviner lindrer DSS-indusert kolitt hos CD-1-mus
(A) TF-behandling påvirket ikke vannforbruket i ulike grupper av CD-1-mus.
(BD) Gavage-administrering av ulike konsentrasjoner av TF-er (henholdsvis 1 mg/ml, 2,5 mg/ml og 5 mg/ml) forbedret forkortelsen av tykktarmen og forstørrelsen av milten forårsaket av DSS hos CD-1-mus. Representative bilder (B) og statistiske analyser av tykktarmen (C) og milten (D) ble vist. (E) Administrering av ulike konsentrasjoner av TF-er (henholdsvis 1 mg/ml, 2,5 mg/ml og 5 mg/ml) forhindret tarmlekkasje indusert av DSS i CD{10}}-mus. (F og G) Koloner ble samlet fra angitte grupper av mus. Totalt RNA ble ekstrahert og utsatt for qRT-PCR-analyser for å påvise mRNA-ekspresjonsnivåene til TNFa(F) og IL-6 (G).
(HL) Koloner fra forskjellige grupper av mus ble samlet på langs og utsatt for HE-fargingsanalyser. Prøver ble undersøkt med mikroskopi, og representative bilder av de angitte prøvene (HL) ble oppnådd og vist. Skalastaver, 40 μm. (MQ') SEM-bilder som viser mikrotrichomene til kolon fra forskjellige indikerte prøver. Skalastenger, 50 um (MQ) og 4 um (M'-Q').
I CG blir data analysert ved hjelp av den tosidede studentens test og vist som gjennomsnitt ± SEM.NS, ikke signifikant, *p<><><0.001. see="" also="" figure="">
Theaflaviner lindrer DSS-indusert kolitt hos CD-1-mus
For ytterligere å undersøke den potensielle rollen til TF-er i opprettholdelse av intestinal homeostase hos pattedyr, ble CD-1-mus brukt til å indusere kolitt med dekstransulfatnatrium (DSS). Mus ble administrert intragastrisk forskjellige konsentrasjoner av TF-er (1 g/l, 2,5 g/l eller 5 a/l) eller vann som en kontroll i fire uker, etterfulgt av behandling med 2 prosent DSS i drikkevann i 7 dager. For å se om TF-er påvirker drikkemengden av DSS på tvers av forskjellige grupper av mus, overvåket vi musenes drikking hver dag. Som vist i Fiqure6A, er TFs-behandling unødvendig for å påvirke drikkeforbruket hos DSS-induserte kolittmus, DSS-behandlede mus presenterte kolittsyndrom med diaré og/eller hematochezia, som ble forhindret av doseavhengig TF-behandling (figur S6A-S6E).cistanche AustraliaIntervensjon med TF-er reddet dessuten reduksjonen i tykktarmslengden forårsaket av DSS og forbedret forstørrelsen av milten (figur 6B-6D).
Vi brukte deretter dextran-4000-FITC (FITC-DX) for å undersøke tarmbarrierefunksjonen til disse musene. Som vist i figur 6E, viste mus fra de DSS-behandlede gruppene en høy konsentrasjon av FITC-DX i blodprøver, noe som indikerer tarmlekkasje hos disse dyrene. Intervensjon med TF-er forhindret imidlertid betydelig transport av FITC-DX fra fordøyelsesorganer inn i sirkulasjonssystemet (redusert med 56,1 prosent -77,5 prosent, figur 6E). Spesielt endret ikke administrasjonen av TF-er tarmpermeabiliteten til mus under normale forhold (figur S6F). Fordi betennelse spiller en sentral rolle i kolittutviklingen av musemodellen, utførte vi videre qRT-PCR-eksperimenter, og viste at TF-behandling betydelig nedregulerte IL-6- og TNF-uttrykk i tarmene til DSS-behandlede mus (figur 6F og 6G).
For ytterligere å analysere de patologiske endringene i tykktarmen, utførte vi hematoxylin-eosin (HE) fargingsanalyser. Som vist i figur 6H-6L og S6G-S6J, ble den DSS-induserte alvorlige epitelskaden markant forbedret ved TF-behandling på en doseavhengig måte. Skanneelektronmikroskopi avbildning av disse tarmprøvene ga videre konsistente resultater (figur 6M-6Q' og S6K-S6N'). Til sammen indikerte funnene våre at TF-er spiller en gunstig rolle i å beskytte tarmbarrierefunksjonen hos både insekter og pattedyr.
DISKUSJON
I denne studien undersøkte vi de fysiologiske funksjonene til TF-er i modulering av intestinal homeostase og lang levetid og de underliggende molekylære mekanismene. Vi viste at kosttilskudd med TF-er positivt bidrar til forebygging av aldersbegynnende dysbiose av tarmmikrobiota og forsinkelse av tarmepitelial dysfunksjon, og dermed forlenge levetiden til Drosophila. Våre mekanistiske studier in vitro og in vivo avslørte at TF-er sannsynligvis spiller en negativ rolle i å kontrollere Imd-signalveien ved å blokkere koalescensen til Imd. Dessuten fant vi at DSS-indusert kolitt effektivt kan lindres ved TF-tilskudd i CD-1-mus. Resultatene våre støtter oppfatningen om at TF-er med fordel bidrar til intestinal homeostase hos både virvelløse dyr og vertebrater.
Kosttilskudd med theaflaviner forlenger Drosophilas levetid
Teforbruk er populært over hele verden og er nest etter vannforbruk (Rothenberg og Zhang, 2019). Tallrike studier har fokusert på de fysiologiske funksjonene ofte via både eksperimentelle og kliniske tilnærminger (Cameron et al., 2008; Niu et al., 2013; Peng et al., 2009; Rothenberg og Zhang. 2019; Spindleret al., 2013; Takemoto og Takemoto, 2018; Unno et al., 2020; Zhou et al., 2020. Det har blitt omfattende vist at te fordeler helse ved å senke lipidnivåer og via anti-fedmeeffekter, og de viktigste funksjonelle forbindelsene i te er katekiner, spesielt epigallocatechin gallate (EGCG)(Abbas og Wink,2009; Modernelli et al.,2015; Niu et al.,2013; Wagner et al.,2015; Xiong et al.,2018). Tidligere studier har også indikert at grønn te og svart te kan øke helsen og levetiden til fruktfluer (Site al., 2011; Wagner et al., 2015), ormer (Fei et al., 2017; Xiong et al., 2018) og rotter (Imran et al. .,2018; Niu etal.2013), og den viktigste reguleringsmekanismen er effektiv forebygging av oksidativt stress ved hjelp av EGCG via modulering av ROS-signaler.cistanche fordeler,Hvorvidt TF-er, som de karakteristiske "gyldne" forbindelsene i svart te, spiller en rolle i å regulere aldring og levetid er stort sett ukjent. Denne studien gir overbevisende bevis som indikerer at TFs intervensjon er unødvendig for å påvirke matinntaket, og langsiktig opptak av TFs via dietten forlenger levetiden betydelig hos både hann- og hunnfruktfluer. Disse funnene gir retningslinjer for videre studier om funksjonene til TF-er i pattedyrs levetid.
Theaflaviner forbedrer aldersbegynnende mikrobiota-dysbiose og fremmer intestinal homeostase Progressiv ubalanse av proliferativ homeostase og regenerativ kapasitet er et kjennetegn på aldring og aldersbegynnende sykdommer (Clark et al., 2015; Heintz og Mair, 2014; Maynard og Weinkove, Rera18; 2018; et al. 2012). Kronisk betennelse er assosiert med tap av homeostase og økt kreftforekomst i aldrende organismer (Bartke et al., 2019; Kapahi et al., 2017; Xiao et al., 2020). Dette er spesielt viktig i barriereepitel som tarmepitel (Guo et al., 2014; Maynard og Weinkove, 2018). Med en modell for utvikling av aldersrelatert dysplasi i aldrende tarm, viste vi at forbedring av vert-kommensal interaksjoner i aldringsbarriereepitel kunne fremme helse og levetid. Vi brukte en rekke ikke-invasive tilnærminger for å analysere tarmfunksjon og mikrobiota-dynamikk under aldring. For det første indikerte Smurf-analysen en positiv rolle til TF-er i å regulere epitelbarrieredysfunksjon under aldring. Deretter avslørte immunfargingsanalysen ved bruk av flere transgene fluer at TF-er forsinket overspredningen av ISC-er og omsetningen av differensierte celler. Til slutt antydet sekvensering av mikrobiomet at TF-er nedregulerer aldersutvidelsen av den intestinale kommensale mikrofloraen. Disse resultatene indikerte sterkt at TF-er spiller en nøkkelrolle i å forsinke aldringsprosessen til verten ved å opprettholde tarmhomeostase.
Theaflaviner lindrer overdreven immunrespons i tarmen ved å negativt regulere Imd-signalering
Det har blitt foreslått at den delikate balansen mellom tarmens immunfunksjon og mikrobiota må opprettholdes for å sikre langsiktig homeostase av barriereepitel (Guo et al., 2014; Maynard og Weinkove, 2018). Tidligere studier har også vist at kronisk overdreven betennelse i tarmen er assosiert med aldersrelatert dysfunksjon i barriereepitel og er et kjennetegn på aldring (Clark et al., 2015; Guo et al., 2014; Ji et al., 2019) . Å opprettholde en sunn kommensal populasjon ved å bevare medfødt immunhomeostase i slike epitel er derfor en lovende tilnærming for å fremme helse og lang levetid (Bonfini et al., 2016; Broderick, 2016; Clark et al., 2015). Å utforske de molekylære mekanismene ved å hvilke TF-er som forsinker aldring, utførte vi RNA-seq-analyse ved å bruke dissekerte tarmer med eller uten TF-behandling. Våre data antydet at gruppen av gener som var sterkt uttrykt i tarmen til kontrollfruktfluer sammenlignet med den til TFs-behandlede dyr, ble beriket med gener klassifisert som "immunrespons"-gener. Ytterligere bioinformatisk analyse og get-PCR-analyser avslørte at uttrykket av Imd-relaterte AMP-gener ble dramatisk hemmet av kosttilskudd av TF-er. Resultatene fra CD-1-museeksperimentene som bruker DSS for å indusere unormale immunresponser i tarmene bekreftet ytterligere forestillingen om at TF-er fungerer som beskyttere mot tarmbetennelse.
Theaflaviner undertrykker signaler ved å bestemme amyloidsammenstillingen til Imd
Hvordan regulerer TF-er Imd-signalveien negativt? Basert på resultatene av transkriptomanalyse fant vi at TF-er er unødvendige for transkripsjonsregulering av nøkkelfaktorene i Imd-signalveien. Av interesse observerte vi den tilsynelatende bindingsaffiniteten til TF-er med renset Imd-protein ved SPR-analyse, noe som antydet en sannsynlighet for at TF-er kan spille en rolle i å kontrollere Imd-proteinadferd eller dens post-translasjonelle modifikasjonsprosess. Tidligere studier har fremhevet en sentral rolle for ubiquitinering i Imd-signaltransduksjon (Kleino og Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014), og forebygging av Imd-ubiquitinering resulterer i dyptgående nedleggelse av Imd-signalering (Myllymaki et al., 2014; Thevenon et al., 2009). Imidlertid viste våre in vitro- og in vivoubiquitineringsanalyser at TF-er knapt påvirker ubiquitineringsmønsteret til Imd. En fersk studie har vist at amyloiddannelse er nødvendig for aktivering av Drosophila Imd-banen ved gjenkjennelse av bakterielle peptidoglykaner (Kleino et al., 2017). Interessant nok antydet våre SDD-AGE- og ThTbinding-analyser at koalescensen av Imd forhindres av TF-er. Forebygging av Imd-aggregering ved å slå ned eller mutasjon av Imd i tarmceller reverserte tilsynelatende de gunstige effektene av TF-er på levetidsforlengelse. For ytterligere å bekrefte funnene våre, ville det være interessant å undersøke om TF-er ikke er mer funksjonelle for å forlenge levetiden i fruktflyvere når det konserverte kryptiske RHIM-motivet (cRHIM, aminosyrer fra 118. til 121. timer) til Imd blir spesifikt slått ut ødelagt, basert på funnet at forbrytelsen i Imd er avgjørende for dens aggregering og amyloiddannelse (Kleino et al., 2017). Ikke desto mindre fremhever studien vår en sentral rolle til TF-er i å kontrollere intestinal homeostase og aldringsprosessen, kanskje gjennom å modulere Imd-koalescens. Fremtidige studier bør fokusere på å utforske hvilke rester eller regioner av Imd som er bundet av TF-er og hvordan denne bindingen resulterer i forebygging av Imd-kondensering. Dessuten indikerte funnene våre i pattedyrsystemet at TF-er effektivt kunne beskytte tykktarmen mot betennelse forårsaket av det eksogene giftige kjemikaliet DSS, noe som tyder på en bevart regulatorisk rolle til TF-er i å opprettholde tarmhomeostase. Det er verdt å undersøke om TF-er spiller en rolle i å styre proteinsammensetning i pattedyrvev.
Denne artikkelen er hentet fra zhongwenxie@ahau.edu.cn
