Kjemiske bestanddeler av bladene til Cistanche

Abstrakt: Cistancheblader har lenge vært brukt som tradisjonell medisin forbehandleriskemisk hjerneslag, angina, oghypertensjonog som en sunn drikke ogkosmetikk foranti-aldring. Denne studien hadde som mål å isolere så mange forbindelser som mulig fra et etanolekstraktav persimmonbladene for å identifisere de biologisk aktive forbindelsene. Den antioksidative effektenav etylacetatlaget fra etanolekstraktet av persimmonbladene ble demonstrert ved2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH)-analyse og elektronisk høyytelses væskekromatografi-2,20 -casino-bis (3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre) (HPLC-ABTS) analyse. En ny flavonoid,kaempferol-3-O- -D-2"-kumaroylgalaktosid (1), og en ny naturlig forbindelse, kaempferol-3-O- -D-2"-feruloylglucosid (3) ble isolert fra etylacetatlaget, sammen med 25 tidligerekjente forbindelser, inkludertfjorten flavonoider, en ionon, to kumariner, syv triterpenoider,og ett acetofenon. Tolkningen av spektrometriske og spektroskopiske data bestemte strukturene deres. Alle isolerte forbindelser ble raskt evaluert ved hjelp av en onlineHPLC-ABTSanalyseog av disse forbindelser4–8, 11, 13, 15, og16 tydelig vistantioksidative effekter. Demengden av disse forbindelsene var {{0}},3–0,65 prosent av ekstraktet.

Nøkkelord:Diospyros kaki; persimmon blader; flavonoid; antioksidant

Klikk her for å få Cistanche rik på flavonoider for kosmetisk antialdring

1. Introduksjon

Diospyros kakiThunb. (persimmon) tilhører familien til Ebenaceae og er utbredtdistribuert i Korea, Kina og Japan. Frukten spises frisk eller tørr, mens bladene harlenge vært brukt som en tradisjonell medisin for å behandle iskemisk slag, angina, hypertensjon,aterosklerose og infeksjonssykdommer [1]. Videre har bladene blitt utnyttetsom sunne drikker og kosmetikk på grunn av deres anti-aldringsegenskaper og evne tilbidra til å forhindre akkumulering av kolesterol og melanin [1]. Nyere forskning har antydetat ekstraktene av persimmonblader har et bredt spekter av biologiske egenskaper,inkludert radikal fjerning, nevrobeskyttelse, trombosehemming, anti-aterosklerose,og anti-allergi [2–6]. En tidligere fytokjemisk undersøkelse antydet at uliketyper avflavonoiderog terpenoider er hovedbestanddelene [7], og flere tanniner,naftokinoner, kumariner, iononer og fettsyrer ble også rapportert [8–12]. Reaktive oksygenarter (ROS) er reaktive molekyler produsert i biologiske systemer,og balansen mellom generering og eliminering av ROS er godt kontrollert i normalcellefysiologi [13]. Imidlertid forårsaker overdreven generering av ROS oksidativ skade,og i sin tur aldring og aldersrelaterte sykdommer inkludert kreft, diabetes og Parkinsonssykdom [14]. Derfor oppdager antioksidanter som flavonoider og fenoliske forbindelserkan være en lovende strategi for behandling av disse sykdommene.

Som en del av vårt kontinuerlige prosjekt for å finne biologisk aktive forbindelser [15], denantioksidativ effekt av etanol (EtOH) ekstrakt og løsningsmiddelpartisjoner fra persimmonenblader ble evaluert ved hjelp av 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)-analyse og høy ytelse på nettetvæskekromatografi-2,20 -casino-bis (3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre)(HPLC-ABTS) analyse. En fytokjemisk studie på persimmonbladene førte til isolasjonenav en ny flavonoid (1), en ny naturlig forbindelse (3), og25 tidligerekjente forbindelser. Anvendelsen av spektroskopiske og spektrometriske metoder preget strukturene. Alle isolerte forbindelser ble raskt screenet for deresantioksidative effekter ved bruk av online HPLC-ABTS. Videre den kvantitative analysen avalle isolerte forbindelser ble utført i denne studien.

2. Resultater og diskusjon

2.1. Antioksidativ effekt av persimmonbladene

Den antioksidative effekten av etanol (EtOH) ekstrakt av persimmonblader ble evaluertfor en foreløpig screening gjennom DPPH (figur1EN). 0.125 mg/ml avekstrakt fjernet omtrent 80 prosent av DPPH-radikalet, mens 0,025 mg/ml askorbinsyresyre utgjorde 94 prosent av radikalet. Den elektroniske HPLC-ABTS-analysen ble utført for rasktsikre påliteligheten til disse resultatene (figur1D). Gallussyre og Trolox ble brukt som indrestandarder. Kromatogrammet ved 734 nm (negativ topp) antydet at cani bestanddeler kan ha antioksidativ aktivitet. Gallussyre og Trolox (6-hydroksy- 2,5,7,8-tetrametylkroman-2-karboksylsyresyre) ble brukt som interne standarder for å sikrepåliteligheten til resultatene. Det ble utledet at de fleste av disse toppene var flflavonoidderivaterslik som flavonoidglykosid og flavanol, basert på utført derepliseringsanalyseved å sammenligne ultrafiolett (UV) og massespektra for forbindelsene med de publisertedata. Bioassay-veiledet fraksjonering antydet at disse antioksidative forbindelsene varrikelig i etylacetat (EtOAc) laget, mens vannet (H2O) laget viste svaktaktivitet (figur1B,C). 

Figur 1. DPPH-fjernende effekter av EtOH-ekstraktet (A), EtOAc-laget (B) og HO-laget (C) HhO-laget av persimmonbladene: (D) online ABTS-HPLC-kromatogram av EtOH-ekstraktet.

2.2. Fytokjemisk undersøkelse

For å identifisere disse antioksidative forbindelsene, ulike kromatografiske og spektroskopiskemetoder ble utført for isolering og strukturell karakterisering avforbindelser. En ny flflavonoid (1) og en ny naturlig forbindelse (3) ble hentet fraetylacetatlag av etanolekstraktet, sammen med 25 tidligere rapporterte forbindelser,nemlig kaempferol-3-O- -2"-coumaroylglucosid (2) [16], ( pluss )-katekin (4) [17], hyperosid(5) [17], isoquercitrin (6) [18], quercetin-3-O- -2"-galloylgalaktosid (7) [19], quercetin-3-O- -2"-galloylglukosid (8) [20], trifolin (9) [18], astragalin (10) [18], kaempferol-3-O- - 2"-galloylgalaktosid (11) [21], kaempferol-3-O- -arabinosid (12) [22], kaempferol-3-O- - 2"-galloylglukosid (13) [23], quercetin-3-O- -2"-coumaroylglucosid (14) [24], quercetin(15) [15], kaempferol (16) [25], (6S,9S)-roseosid (17) [26], scopoletin (18) [27], umbelliferon(19) [28], 1-(2,4-dihydroksy-6-metylfenyl)etanon (20) [29], barbinervinsyre (21) [30], diospyrinsyre B (22) [7], rotungensyre (23) [31], pomolsyre (24) [32], siaresinolsyre(25) [33], oleanolsyre (26) [25], og ursolsyre (27) [25] ved å bruke spektroskopisk ogspektrometriske og fysiske data sammenlignet med publiserte data og også med tynnelagkromatografi (TLC) analyse (figurer2 og3). Blant disse, forbindelser2, 16, 17, 19, 20, og24 ble først isolert fraD. kaki. 

Forbindelse 1 ble oppnådd som et gult pulver, der molekylformelen ble etablert som C3olO3 basert på høyoppløselig massespektrometri (HRMS) data. Spekteret viste absorpsjonsbånd ved 207 og 315 nm, noe som indikerer at forbindelse1 hadde en flavonol-ryggrad. 'H kjernemagnetisk resonans (NMR)-data (tabell 1, figur S1) viste et typisk mønster av kumaroylert flavonolglykosid, som viser to sett med AA'BB'-type signaler ({{10}}.{{11 }} (2H, d, J= 8.5 Hz, H-2' og H-6 ),6.87 (2H, d, J{{20}} .5 HzH-3' og H-5')) i B-ringen til kaempferol samt signalene (0 7.45 (2H, d, J=8. 5 HzH-2 og H{{3{{104}}}}"), 6,81 (2H, d, J=8,5 Hz, H-3 og H-5 prosent) i den aromatiske ringen av kumaroylgruppen. To dublettsignaler (8H 7.65 (1H, d, J=15.5 Hz, H-7") og 6.35 (1Hd, J=16.0 Hz, H-8") ble observert, noe som indikerer transolefiniske protoner fra landgruppen. I tillegg et anomert protonsignal (0H 5,57 (1H, d, J=8.0 Hz, H-1) ble observert i sukkerregionen, noe som antyder tilstedeværelsen av den B-konfigurerte sykliske sukkergruppen. 13C og forvrengningsfri forbedring ved polarisasjonsoverføring NMR-data (Iable 1 Figur S2) viste 30 resonanser som omfattet to transolefiniske karboner, ti aromatiske karboner og seks glukosylgruppekarboner, og ti ikke-protonerte karboner inkludert to karbonylkarboner. Spesielt var de kjemiske endringene ved C-2, C-3 og C-4 (8c 158.1, 134.9 og 179.2) karakteristiske signaler for flavonol3-0-glykosid. I tillegg kommer karbonylkarbonsignalet ved C-1" (8c 168,7) og to transolefiniske karbonsignaler ved C-2'" og C-3"(6 146.9 , 115,2) var typiske kjemiske skift av kumaroylgruppen. Det anomere karbonsignalet ved C-1(6C 100,4) og andre signaler for glykosyldelen fra C-2" til C-6" ' (6c74.3, 73.4, 70.5, 77.4 og 62.0) ble observert. Disse endimensjonale (1D) NMR-dataene kunne legges over dataene for kaempferol-3-0-B-2"-cumaroylglucosid (2) (16]. Den forsiktige sammenligningen av 13C NMR-dataene mellom de to forbindelsene antydet imidlertid at forbindelse 1 hadde en galaktosedel, noe som ble ytterligere demonstrert av nuclearOverhauser enhancement spectroscopy (NOESY) NMR-data (Figur S6). Mens NOES-korrelasjonen mellom H-2 og H-4 ble observert i forbindelse 2, det var ingen korrelasjon mellom disse protonene i forbindelse 1. Generelt er tolkning av 13C NMR- og NOESYNMR-data en effektiv metode for å bestemme typen glykosyldel . Plasseringen av galaktosedelen ble utledet til å være ved C-3 i henhold til nedfeltforskyvningen av C-2og C-4, som ytterligere bevist av den heteronukleære multippelbindingskorrelasjonen (HMBCbetween H{ {123}}" og C-3 (Figur S5). Posisjonen til kumaroylgruppen ble vist å være ved C-2" basert på skiftet nedover (0 5.36 (1H, dd, J=10.0, 8.0 Hz, H{ {134}}")) og HMBC-korrelasjonen mellom H-2' og C-1. Som et resultat ble strukturen til forbindelse 1 bestemt som kaempferol-3-0-B-2"-kumaroylgalaktosid. Selv om forbindelse 2 tidligere ble isolert fra forskjellige kilder, inkludert Ouercus suber (16] og Alliumporrum (34), forbindelse 1 ble isolert og strukturelt karakterisert for første gang.

Sammensatt3 ble isolert som et gult pulver, og molekylformelen ble etablertsom C31H28O14 ved å analysere HRMS-data. UV-spekteret viste UVabsorpsjon ved 210 og 327 nm på grunn av samme aglykon med forbindelser1 og2. De1H NMR-data (tabell1, Figur S10) var lik de for forbindelsen2, men sammensatt3 hadde en feruloylgruppe i stedet for kumaroylgruppen, som bevist ved tilstedeværelsen av enekstra metoksygruppe (δH 3.91 (3H, s, 3000 -OCH3)). I tillegg et anomerisk protonsignal (δH 5.64 (1H, d, J {{0}}.0 Hz, H-100 )) ble observert, noe som indikerer at glykosylbindingenvar en-konfigurasjon, og det nedfelte skiftet signal (5.03 (1H, t,J = 8.5 Hz, H-200 )) ble vist i sukkerregionen, som med forbindelse1. De13C NMR-data (tabell1, FigurS11) viste 31 resonanser bestående av totrans-olefifiniske karboner, ti kvartære karboner,ti aromatiske karboner, seks glukosylgruppekarboner og ett metoksykarbon, og ti ikke-protonertekarboner, inkludert to karbonylkarboner som tilsvarer kaempferol, feruloyl,og glukosegrupper. Spesielt karbonsignaler fra C-200 til C-600 (δC 75.8, 76.3, 71.5, 78.8 og 62,5) antydet tilstedeværelsen av en glukosedel. Plasseringene til glukosedelenog feruloylgruppen ble tildelt av langdistanse HMBC-korrelasjonene mellom H-100 ogC-3 (δC 134,8) og H-200 og C-1000 (δC 168,4) (Figur S14). Plasseringen av en ekstrametoksygruppen ble bestemt av nøkkelkorrelasjonen mellom 3000 -OCH3 og C-3000 (δC 149,4). Resultatene ovenfor antydet strukturen til forbindelsen3 som kaempferol-3-O- - 2"-feruloylglukosid. Så vidt vi vet, sammensatt3 ble bare rapportert som enprodukt av hydrolysen av 3-O- -(2-O-feruloyl)-glukosyl-7,40 -di-O- -glukosylkaempferol, isolert fraAllium tuberosum[35]. Derfor er strukturen til3 ble belyst som nynaturlig forbindelse.

Sammensatt11 ble isolert som et gult pulver. De1H NMR-data (figur S19)viste et sett med AA0 BB0 -type signaler (δH 8.06 (2H, d, J {{0}}.0 Hz, H-20 , H-60 ), 6.87 (2H, d, J {{0}},0 Hz, H-30, H-50 )) i B-ringen til kaempferol og et singlettsignal klδH 7.02 (2H, s, H-3000 , H-7000 ) av en galloyldel i aromatisk region, som er et karakteristisk signalav den tildelte flavonolen. Et anomert protonsignal (δH 5.78 (1H, d, J {{0}}.0 Hz, H-100 )) indikerte at glykosylbindingen var en-konfigurasjon. Videre en downfieldforskjøvet protonsignal (5,27 (1H, t,J = 9.5 Hz, H-200 )) foreslo at galloylgruppenble festet til hydroksylgruppen til C-200 fordi dette skiftet kan tilskrivesden anisotrope påvirkningen avO-galloyldel [21]. De13C NMR-data (figur S20)viste 26 resonanser, noe som indikerer tildelt flavonolglykosid. Karbonsignalenefra C-200 til C-600 (δC 71.1, 72.7, 68.2, 76.0 og 60.1) antydet tilstedeværelsen av en galaktosedel. Derfor strukturen til sammensatte11 ble bekreftet som kaempferol-3-O- -200 - galloylgalaktosid. Selv om sammensatt11 var tidligere isolert fra forskjellige kilder,gjelder ogsåD. kaki[21,36], bare den1H NMR- og MS-data ble tidligere rapportert. Dermed,de13C NMR-data ble rapportert for første gang i denne studien

2.3. Antioksidative aktiviteter av de isolerte forbindelsene

Alle isolerte forbindelser ble evaluert for deres antioksidative effekter ved bruk av hurtig pålinje HPLC-ABTS-analyse for å bestemme hvilke forbindelser som bidro til antioksidativeteffekten av persimmonbladene. Forbindelser4–8, 11, 13, 15, og16 viste kraftig antioksidative aktiviteter (figur4). De fleste av disse forbindelsene var kaempferol og quercetinderivater, men noen derivater (1–3, 9, 10, 12, og14) viste ikke aktiviteter. Destruktur-aktivitet-forholdet ble ikke helt bestemt, men ble delvis avslørt. Ispesielt quercetin og kaempferol med galloylgrupper (7, 8, 11, og13) ble funnet åhar kraftige aktiviteter, men de med kumaroyl- eller feruloylgrupper (1–3 og16) gjorde ikkevise eventuelle aktiviteter.

Figur 4.Radikale rensende aktiviteter av de isolerte forbindelsene (4–8, 11, 13, 15, og16) ble vurdert av onlineHPLC-ABTS-analyse.

2.4. Kvantitativ analyse av isolerte forbindelser

Den kvantitative analysen av alle isolerte forbindelser i det EtOAc-løselige ekstraktetble utført for å bekrefte at de antioksidative effektene av persimmonbladene kan væreforårsaket av disse aktive forbindelsene. En spesifikk HPLC-metode med diodearray-deteksjon ogfordampningslysspredningsdetektor ble utviklet for samtidig bestemmelseav 27 forbindelser. Innholdet av alle isolerte triterpenoider var omtrent 5,9 prosent avekstraktet, og av disse, de av siaresinolsyre (25), oleanolsyre (26), og ursolisksyre (27) utgjorde en betydelig del, som rapportert i tidligere studier [7]. Deinnholdet av flavonoider var omtrent 5,4 prosent, og av disse var innholdet av aktive forbindelservar 3,2 prosent (tabell2). Spesielt innholdet i kaempferol-3-O- -200 -galloylgalaktosid(9), kaempferol-3-O- -2"-galloylglukosid (10), isoquercitrin (13), og quercetin-3-O- -2"- galloylglucosid (15) var mer enn 0,3 prosent . Analysemetoden ble verifisert ved å bruke enenkel valideringsprosedyre for å sikre relevansen av metoden, som viste tilstrekkeligspesifisitet, linearitet, nøyaktighet og presisjon.

Spør om mer:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp pluss 86 15292862950