Kjemisk profil og metabolittstudie av rå og bearbeidet Cistanche Deserticola hos rotter av UPLC-Q-TOF-MSE

Kontakt Eposttina.xiang@wecistanche.comfor mer informasjon

Abstrakt

Bakgrunn: Kinesisk materia medica-behandling er en fremtredende og unik farmasøytisk teknikk i tradisjonell kinesisk medisin (TCM) som brukes for å redusere bivirkninger og øke eller til og med endre den terapeutiske effekten av de rå urtene. Endringer i de essensielle komponentene indusert av en optimalisert prosesseringsprosedyre er primært ansvarlige for den økte effekten av medisinplantene. Den nyre-yang-forfriskende effekten av risvindampetCistanche deserticola(C.deserticola) var sterkere enn rå C.deserticola (CD).

Metoder: En sammenligningsanalyse ble utført ved bruk av UPLC-Q-TOF-MS' med UNIFl informatikkplattform for å bestemme påvirkningen av prosessering. In vitro studier ble utført for karakterisering av bestanddeler samtmetabolitterin vivo. De kjemiske komponentene ble bestemt i CD og dets bearbeidede produkter. De multivariate statistiske analysene ble utført for å evaluere variasjoner mellom dem mens OPLS-DA ble brukt for parvis sammenligning.

Resultater: Resultatene av denne studien avdekket betydelige variasjoner i fenyletanoidglykosider (PhGs) ogiridoideretter behandling. Totalt 97 forbindelser ble påvist i ekstraktene av CD og dets bearbeidede produkt. PhG-er som har 4-O-kaffeoylgruppen i 8-O- -D-glukopyranosyl-delen, som akteosid, cistanosid C, campneosid Il, osmanthusid avtok etter å ha blitt behandlet, mens PhG-er med 6' -O-kaffeoylgruppe i 8-O- -D-glukopyranosyl-delen, slik som isoacetosid, isosistanosid C, isocampneosid l, isomartynosid økte, spesielt i CD-NP-gruppen. Intensiteten til echinacosid og cistanosid B hvis struktur har 6'-O- -D-glukopyranosyldel økte også. I en in vivo-studie ble 10 prototypekomponenter og 44 metabolitter påvist i rotteplasma, avføring og urin. De oppnådde resultatene avslørte at prosessering fører til den betydelige variasjonen i de kjemiske komponentene i CD og påvirket disponeringen av forbindelsene in vivo, og fase Ⅱ metabolske prosesser er nøkkelkaskadene for hver forbindelse, og de fleste av metabolittene er assosiert med echinacoside eller akteosid.

Konklusjoner: Dette er den første globale sammenligningsundersøkelsen av rå og bearbeidet CD. Disse funnene bidrar til vår forståelse av virkningen av CD-behandling og gir viktige data for fremtidige effektivitetsundersøkelser.

Nøkkelord: Cistanche deserticola, prosessering, UPLC-Q-TOF-MS5, Kjemiske profiler, Metabolitter in vivo

Introduksjon

Behandling av kinesisk materia medica (CMM) har vist betydelig anvendelighet i klinisk praksis for tradisjonell kinesisk medisin (TCM), og det har blitt ansett som en levedyktig behandling i flere århundrer. Dette er en unik farmasøytisk teknologi som er utledet fra teorien om TCM. Etter prosessering er det identifisert betydelige forskjeller i utseende, kjemiske bestanddeler, egenskaper og medisinsk betydning for alle typer TCM, noe som fører til antakelsen om at behandlingen kan forbedre effekten eller redusere TCMs toksiske effekter.

I hundrevis av år,Cistanche deserticola(Rou Cong Rong på kinesisk, CD) brukes ofte i TCM klinisk praksis for å supplere nyrenes funksjoner. Det hjelper også med å fukte tarmen som fører til avslappende tarm [1].Cistancheble først spilt inn i ShenNongBencaoJing. Det er ofte funnet i tørre og halvtørre habitater over Eurasia og Nord-Afrika, inkludert Iran, Kina, India og Mongolia [2]. Behandlingen av CD har blitt utført ved damping med risvin under normalt trykk, som er en tilberedningsmetode dokumentert i den kinesiske farmakopeen (Jiucongrong på kinesisk, heretter kalt "CD-NP"). Og CD-damping med risvin under høyt trykk er en mer effektiv tilberedningsmetode (heretter kalt "CD-HP") [3, 4]. Flere studier har blitt avslørt at de farmakologiske effektene av CD er forskjellige fra de bearbeidede produktene [5]. CD kan tonifisere nyre-yang og slappe av tarmen, mens etter å ha blitt dampet av risvin, vil effekten av å fylle opp nyre-yang bli styrket. I vår tidligere studie har det blitt funnet at CD-NP kan forbedre tonifkasjon av nyrene og støtte yang, og lindre effekten av fukting av tarm og avføring [6–8]. I klinisk praksis er bearbeidede produkter den mest brukte formen.

Opp til dags dato har flere studier analysert de kjemiske komponentene i CD, etterfulgt av isolering og identifisering av mer enn 100 forbindelser [9–11], slik som fenyletanolglykosider (PhGs),iridoider, lignaner og oligosakkarider som dens viktigste kjemiske bestanddeler. Det har også blitt rapportert at det er mange farmakologiske aktiviteter av PhG, inkludert immunmodulerende, nevrobeskyttende, hepatobeskyttende, antiinflammatoriske, antioksidative, etc. [12–14]. Iridoider har anti-inflammatoriske aktiviteter [15, 16]. Det har også blitt avslørt av tidligere studier at noen kjemiske komponenter viste variasjoner under behandlingen [17–20]. Basert på disse rapportene kan det antas at etterbehandling, variasjonene i kjemisk sammensetning fører til ulike farmakologiske effekter, som må utforskes nærmere.

I den nåværende studien ble en sensitiv og effektiv metode, dvs. ultrahøy ytelse væskekromatografi kombinert med TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE) utført for sammenlignende analyse, og in vitro studier ble utført for å kvalitativt analysere ekstraktene av CD, CD-NP og CD-HP for å belyse deres kjemiske profiler. Generelt ble de eksogene kjemikaliene med høy eksponering i målorganer ansett som effektive komponenter. Derfor ble CD og dets bearbeidede produkter oralt administrert til rotter, etterfulgt av deres karakterisering. Den eksisterende studien avslører en sammenlignende studie (både in vitro og in vivo) av rå og bearbeidet CD for første gang. De oppnådde resultatene vil utvide vår forståelse angående effekten av CD-behandling, noe som kan være nyttig for videre studier.

Materialer og metoder

Materialer

Standardforbindelser av ajugol(180120) og 2'-acetylacetosid(M0601AS) ble levert av Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, Kina). Cistanoside F(MUST-17022620), echinacoside (D1105AS), cistano-side A(M0906AS) og isoacteosid(M0106AS) ble levert av Must-selskapet (Sichuan Kina); acteoside (O0618AS), salidroside(J0526AS), catalpol (S0728AS), geniposid(A0407AS) og geniposidinsyre (MB6001-S) ble kjøpt opp fra Dalian Meilun Bio.Co.,Ltd (Dalian, Kina).8-epideoksylogansyre (B31123) var hentet fra Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, Kina. Metanol og acetonitril var av MS-grad og ble oppnådd fra Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland. Metansyre (CH, O,) av HPLC-grad ble levert av Merck KGaA (Darmstadt, Tyskland). Vannet som ble brukt i den eksisterende studien ble behandlet via Milli-Q-systemet (18,2 MQ, Millipore, Ma, USA). Risvin ble levert av Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Kina).

Cistanch deserticola ble samlet inn fra Neimenggu wangyedi cistanche Co.Ltd. Prøvene ble identifisert av prof. Yanjun Zhai (farmasøyskolen, Liaoning University of TCM). Prøvene ble sendt til Liaoning University of Traditional Chinese Medicine.

Dyr

Sprague–Dawley hannrotter (SPF-grad) med 180–220 g total kroppsvekt ble levert av Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Laboratory Animal Resource Center of Liaoning Province, lisensnummer: SCXK-2015–0001). Disse rottene ble holdt i et avlsrom med godt vedlikeholdt temperatur og luftfuktighet, dvs. 20–26 grader, 50–70 prosent i en uke. Rottene ble matet med vanlig laboratoriemat og vann før eksperimentering. Dyrene fastet over natten, men vannet ad libitum ble gitt før forsøket. Rottene ble henrettet med 10 prosent klorhydratbedøvelse. Den institusjonelle dyreetiske komiteen ved Liaoning Provincial Hospital of Chinese Medicine godkjente alle eksperimentelle protokoller (2019.3.25, 2019015).

Klargjøring av CD-, CD-NP- og CD-HP-ekstrakt

CD-NP, CD-HP ble behandlet fra samme batch av Cistanch deserticola. For å forberede CD-NP ble tørre CD-stykker (5 mm tykke, 100 g) fuktet med risvin (30 ml) og ble dampet ved 100 grader i 16 timer, etterfulgt av tørking ved 55 grader via tørkeovn. Mens CD-HP ble tilberedt via infiltrasjon av tørre CD-stykker (5 mm tykke, 100 g) med risvin (30 ml), etterfulgt av damping ved 1,25 atmosfærisk trykk i 4 timer. og deretter tørket i tørkeovn på 55 grader .

I en 100 ml målekolbe ble ett gram av pulveret siktet via sikt #4, etterfulgt av tilsetning av 50 prosent metanol (50 ml) og deretter godt dekket og blandet. Denne blandingen ble veid, fulgt av halve timer. maserasjon. Etter maserasjon ble blandingen ultralydbehandlet (effekt 250 W, frekvens 35 kHz) i 40 minutter, etterfulgt av avkjøling og veiing igjen. Vekttapet ble etterfylt med 50% metanol, riktig blandet, og fikk stå, etterfulgt av filtrering av supernatanten og deretter bruk av det oppnådde filtratet som testløsning.

MSE-analyse av aktive komponenter

Fremstilling av standardstoffer: tubulosid-A (3.02 mg), echinacosid (3.00 mg), 2'-acetylacteosid (2,34 mg), acteosid (2,45 mg), isoacteosid (0,61) mg), cistanosid-F (2,14 mg), salidrosid (3,39 mg), geniposid (2,84 mg), ajugol (1,58 mg), catalpol (2,39 mg), geniposidinsyre (2,56 mg) og 8-epideoksyloganic syre (2,34 mg) ble tilsatt i en 10 ml volumetrisk beholder, tilsatt metanol konstant volum i skala, konfigurert til en tilsvarende konsentrasjonsreferanseløsning. Hver av de 100 μL ble konfigurert til en blandet referanseløsning.

MS-analysetilstand: Masseverdien ble korrigert før eksperimentet, og negativ ione-modus ble brukt. Masseområdet var 50–1200 Da, og prøven ble injisert gjennom en strømningsinjeksjonspumpe. Kjeglehastigheten var 100 l/time, oppløsningsmiddelstrømningshastigheten ble satt til 800 l/time. Kapillær- og kjeglespenningene ble fastsatt til 2500 og 40 V, tilsvarende. Temperaturen til ionekilden og løsemiddelgassen var henholdsvis 100 grader og 400 grader, og signalopptaksfrekvensen var 0,5 S−1.

UPLC-Q-TOF-MS-analyse av CD-ekstrakt (15–16 min), 65 prosent til 55 prosent A (16–18 min). Strømningshastigheten var 0,3 mL min−1, mens temperaturen i autosamplerrommet og kolonnen var 30 grader og 8 grader hver for seg. Injeksjonsvolumet var 1,0 μL.

Den massespektrometriske evalueringen ble utført via Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, USA), som omfatter en ESI-kilde. Strømningshastigheten til nitrogengass ble fastsatt til 800 L·t-1 med en temp på 400 grader, kildetemperaturen ble fastsatt til 100 grader, og kjeglegassen ble satt til 50 L h−1. Spenningen til kjegle og kapillær ble justert til 40 og 2000 V, tilsvarende. Kollisjonsenergien til rampen ble brukt i området 20–30 V. Sentroiderte data for alle prøvene ble oppnådd fra 50 til 1200 Da, med en 5-skanningstid på 0,5 s over en analysetid på 10 minutter . LockSpray TM ble brukt for validering av massepresisjonen. Te [M–H]− ion av leucinenkefalin (200 pg·μL−1 infusjonsstrømningshastighet 10 μL min−1) ved m/z 554,2615 ble brukt som låsemasse. MassLynx V4.1-programvaren (Waters Co., Milford, USA) ble brukt for den nøyaktige massen, sammensetningen av forløperionene og beregningen av fragmentioner.

Dataanalyse i Masslynx-plattformen

Videre ble det satt opp et internt bibliotek bestående av navnet på forbindelsen, dens struktur og molekylformelen (i mol.) basert på litteratur. Alle forbindelsene ble notert i en spesiell mal, laget i Excel. I tillegg ble mol-filene (Chemdraw Ultra 8.0, Cam-bridge soft, USA) og Excel-filene til alle de individuelle sammensatte strukturene også lagret på den lokale PC-en. Det etablerte Excel-arket med viktige data ble direkte importert til det vitenskapelige biblioteket i UNIFI

UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, Storbritannia ble brukt for evaluering av strukturelle egenskaper, spesielt for de karakteristiske fragmentene og MS-fragmentering. Et minimum toppareal på 500 ble satt for 2D toppdeteksjon. Under avslørende 3D-topper ble en lavenergitoppintensitet på mer enn 300 tellinger og forhøyet energitoppintensitet på mer enn 80 tellinger valgt. Massefeilen ble funnet å være opptil ± 10 ppm for kjente forbindelser, og retensjonstidstoleransen ble satt i området ± 0,1 min. Vi valgte de negative adduktene som inneholder -H, pluss HCOOH. Behandlingen av rådata innhentet fra MS ble utført via strømlinjeformet UNIFI-programvare for raskt å finne de kjemiske komponentene som møtte standardene med den selvbygde databasen og det interne biblioteket for tradisjonell medisin.

Deretter, for å verifisere den kjemiske strukturen til hver målforbindelse, ble isomerene skilt ut ved deres karakteristiske MS-fragmenteringsmønstre som ble avslørt i de rapporterte studiene, og ved å sammenligne retensjonstidene til referansestandarder.

Metabolomikkanalyse basert på multivariat statistisk analyse

Før behandlingen av rådataene ble parametrene angitt, for eksempel masse fra 150 til 1200 Da, område for retensjonstid (0 til 20 min), terskelintensitet ( 2000 tellinger), massetoleranse dvs. 5 MDA, mens masse- og retensjonstidsvindu var henholdsvis 0,20 min og 0,05 Da. I den påfølgende listen over databasen var identifikatoren for ioner RT-m/-parene med hensyn til deres elueringstider. De samme verdiene for RT og m/z i forskjellige partier av prøver ble ansett som den samme forbindelsen.

Multivariat statistisk analyse ble utført for å evaluere effektive biomarkører som i betydelig grad bidro til variasjoner mellom ulike grupper. Under analysen ble hovedkomponentanalyse (PCA) brukt for å indikere maksimale forskjeller og mønstergjenkjenning for å få oversikt og klassifisering. OPLS-DA er et modelleringsverktøy som gir visualisering av OPLS-DA prediktiv komponentbelastning for å hjelpe modellevaluering. Variabel betydning for projeksjonen (VIP) ble brukt for å vurdere evalueringen av ulike komponenter, ogmetabolitterwith VIP values>1.0 og P-verdi<0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r²/o²values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

Dyreforsøk rotter ble tilfeldig kategorisert i fire grupper (n=6 for hver gruppe), etterfulgt av oral administrering av forskjellige ekstrakter: (1) Blank kontrollgruppe: rottene fikk normal saltvann (2 ml/100 g) ; (2) CD-gruppe: rottene ble gitt CD-ekstrakt (2 ml/100 g); (3) CD-NP-gruppe: rottene ble gitt CD-NP-ekstrakt (2 ml/100 g); (4) CD-HP-gruppe: rottene fikk CD-HP-ekstrakt (2 ml/100 g). Den videre kategoriseringen av alle grupper ble utført i tre undergrupper for plasma, urin og avføring. To timer senere ble hver rotte administrert oralt med samme og lik mengde ekstrakter.

Etter administrering ble innsamlingen av blodprøver utført etter 1.0 time, 2.0 timer og 4.{5}} timer i hepariniserte 1,5 ml polyetenrør (fra orbitale vener) , etterfulgt av sentrifugering (ved 4500 rpm) av alle prøver i 15 min.

For urin- og avføringsprøver ble rottene holdt i metabolismebur, og deretter ble innsamlingen av urin- og avføringsprøver utført i 24 timer etter administrering. Sentrifugeringen av urinprøver ble utført ved 4500 rpm i 15 minutter, mens avføringsprøver ble tørket i skyggen, malt til pulver, deretter ble 0,2 g tatt og tilsatt 0,5 ml saltvann løsning, ultralyd i 5 minutter og sentrifugert ved 12,000 rpm i 15 minutter. Alle bioprøvene ble holdt ved -80 grader frem til analyse.

Klargjøring av biologiske prøver. Tilsetningen av plasma-, urin- og avføringsprøver ble utført med 3 volumer metanol, etterfulgt av vortexing i 3 minutter. Deretter ble sentrifugeringen (ved 12,000 rpm) av blandingene utført i 10 minutter, etterfulgt av overføring av supernatant til EP-røret, og deretter tørket med nitrogen ved 37 grader. Videre ble tilsetning av 200 μL HCN–H2O (50 prosent) løsning utført. Ti ble virvelen brukt til blanding (1 min), etterfulgt av sentrifugering (ved 12, 000 rpm) i 5 min. Supernatanten (5 μL) av de behandlede prøvene ble injisert i UPLC-Q-TOF-MSE-systemet.

Væskekromatografisk og massespektrometrisk tilstand Analysen formetabolitterble også utført av Waters UPLC-instrumentet gjennom et ESI-grensesnitt. Separasjoner ble utført ved å bruke en Acquity UPLC HSS T3-kolonne (100 mm×2,1 mm, 1,8 µm), den mobile fasen var 0,1 prosent maursyre (A): acetonitril (B), gradientelueringstilstand var 0-3 min (99,8 prosent →98 prosent A).3-5 min(98 prosent →95 prosent A),5-8 min(95 prosent →90 prosent A), { {18}} min (90 prosent →85 prosent A),12-17 min (85 prosent →70 prosent A), 17-22 min (70 prosent →60 prosent A), 22-23 min (60 prosent →58 prosent A), 23-25 min (58 prosent A),25-32 min (58 prosent →45 prosent A), og 32-37 min (45 prosent →35 prosent A) ),0,4 mL min-1 var strømningshastigheten. Temperaturen for kolonnen og prøverommet ble satt til henholdsvis 40 grader og 8 grader. Massespektrometribetingelsene nevnt ovenfor ble brukt.

Strategi for systematisk analyse av metabolitter i bio‑samplesUNIFI (1.8.2) programvare ble brukt for databehandling. Binary Compare-funksjonen ble brukt for å identifisere effektive metabolitter. Evaluerte metabolitter fantes ikke i den ekvivalente kontrollprøven eller eksisterer ved lave ioneintensiteter. Den relative intensitetsterskelen ble satt til 3 eller 5, og metabolitter som oppfylte de understrekede kriteriene kunne evalueres. Vanlige og forutsigbare metabolitter ble deretter bestemt av EIC. For søk etter tofasemetabolitter ble NLF-funksjonen brukt. For eksempel, i UNIFI-programvaren, kan parametrene settes til 176.0321 for å søke etter mulige glukuronsyrekonjugater. Etterbehandling kan et nøytralt tap settes i metoden eller identifiseres. MassFragment ble brukt for å bestemme eller karakterisere påviste metabolitters strukturer, UNIFIs spektrale tolkningsfunksjon er hovedfunksjonen som brukes til å analysere sekundær fragmentering av overordnede komponenter. Denne funksjonen kan brukes for rask verifisering av fragmenteringsbanen, uansett om det er rimelig.

Resultater

Massefragmenteringsregel for fenyletanoidglykosider og iridoider

Fenyletanoidglykosider er de viktigste kjemiske bestanddelene i CD. Standardløsningene av isoacteosid,

cistanosid F, tubulosid A, echinacosid, acteosid og 2'-acetyl-acteosid ble tatt, etterfulgt av å gi et annet nivå av kollisjonsenergier (tabell 1), og deretter ble tilsvarende MS2-kart oppnådd (fig. 1).

Den massespektrometriske analysen avslørte at fenyletanoidglykosider har lignende massespektrumfragmenteringsmønstre, spaltningsveiene i negativ-ion-modus inkluderer hovedsakelig (1) Esterbindingsspaltning: tap av nøytral koffeoylgruppe (C, H, O162.03) og nøytral acetyl gruppe (C, H, O,42.00);(2) Glykosid-spaltning: tap av nøytrale rhamnose-rester (C.HIO, 146.05) og nøytral glukoserester (CgHO, 162.05). Fra høyoppløselig massespektrometri kunne kaffeoyl(162.03) og glukoserester (162.05) skilles.

Iridoidene ajugol, catalpol, geniposidsyre, geniposid og 8-epideoksylogansyrestandardløsninger ble tatt, etterfulgt av å gi forskjellige kollisjonsenergier, og tilsvarende MS-kart ble oppnådd (fig. 2).

Iridoidglykosider har lignende massespektrumfragmenteringsmønstre, spaltningsveiene i negativ-ion-modus inkluderer hovedsakelig (1)Glykosid spaltning: Tap av nøytral glukoserester (CHoO, 162,05); (2) Tap av nøytral CO, (43,99) og H 0 (18,01).

Identifikasjon av forbindelsene i CD-, CD-NP- og CD-HP-ekstrakter

UPLC-QTOF-MSE analyse

Optimalisering av kromatografiske forhold ble utført. Deretter ble forbindelsene til CistancheHerba evaluert i både negative og positive ionemoduser med høy så vel som lav CE. De oppnådde resultatene viste at kompatibiliteten til den negative modusen var høyere i forhold til den positive modusen for disse forbindelsene. Figur 3 viste MS basisk peak ion (BPI) kromatogram sporet med nummererte topper. Intensiteten til hvert påvist ion i UPLC-Q-TOF-MS' analyse ble normalisert med hensyn til hele ionetallet for generering av en datamatrise som besto av m/z-verdi, det normaliserte topparealet og retensjonstid.

Evalueringen av komponenter fra CD og dens bearbeidede produkter på UNIFl-plattformen

Totalt 97 forbindelser ble identifisert med -SEM (n=6)-modus fra CD og dets bearbeidede produkt (tabell 2), inkludert fenyletanoidglykosider (PhGs), iridoider, lignaner og oligosakkarider. Komponentene 95, 91 og 94 ble detektert i CD, CD-NP og CD-HP tilsvarende. Blant dem var 64 fenyletanoider, 13 var iridoider, og 20 andre typer forbindelser ble bestemt. Det var en likhet i den kjemiske sammensetningen av CD og dets bearbeidede produkt, men mengden av komponentene ble funnet å være forskjellig mellom CD og dets bearbeidede produkt.

Variasjoner i kjemiske komponenter i bearbeidede produkter Simca-P 13.0-programvaren ble brukt for å analysere den multivariate datamatrisen. Før PCA var alle variabler gjennomsnittssentrert og Pareto-skalert, etterfulgt av identifisering av potensielle diskriminerende variabler. I et PCA-poengdiagram viste hvert punkt en individuell prøve. Prøver som viste likhet i deres kjemiske komponenter ble spredt ved siden av hverandre, mens de som viste variasjoner i deres komponenter ble delt. Som vist i PCA (fig. 4), ble gruppen av CD-HP separert fra gruppene av CD og CD-NP.

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs.5, 6,7)The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP>1 og P<0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

Fra fig.8 fant vi intensiteten til akteosid(54), cistanosid C(74), campneosid I(43), osmanthusid (75) og 2'-aktylakteosid(80) som har 4'-O-kaffeoylgruppen i 8-O- -D-glukopyranosyldelen (se fig. 9) ble redusert etter å ha blitt behandlet med risvin, mens intensiteten til isoacetoside(60), er castanosid (71),iso-campneosid I (69), isomartynosid (86) med 6'-O-kaffeoylgruppen (se fig. 9) økt, spesielt for CD-NP-gruppen. Selv om tubulosid B (72) har en 6'-O-kaffeoylgruppe, det samme som isoacteosid, reduserte intensiteten på grunn av dens 2'-acetylgruppe. Intensiteten til echinacoside(38) og cistanosid B som har 6'-O- -D-glukopyranosyl-delgrupper økte, men intensiteten til tubulosid A (55) reduserte også på grunn av dets 2'-acetylgruppe.

Vårt forskerteam studerte også den termiske stabiliteten til akteosid og isoakteosid og fant at akteosid var ustabil i vann, metanol og gul risvinløsning, og kunne omdannes til isoakteosid delvis under oppvarmingsforhold. Men termostabiliteten til isoacteosid var bedre, spesielt i gul risvinløsning. Figur 10 viste de mulige endringene av PhG i CD under behandling:

Identifikasjon av metabolittene hos rotter Fra høyoppløselige massespektrometridata ble nøyaktig molekylvekt og grunnstoffsammensetning for metabolitter og protomolekylforbindelser analysert og sammenlignet. Ettersom de samme typene forbindelser i TCM viste likhet i metabolske modifikasjoner, kan korrelasjonene av fytokjemiske bestanddeler in vitro strekke seg til deres metabolitter in vivo. I mellomtiden, basert på konvensjonelle biotransformasjonsveier, ble det utledet en rimelig endring av molekylvekt. Til slutt ble metabolittene identifisert ved å analysere MSE-massespektrene til metabolittene og protoforbindelsenes fragmenteringsvei i massespekteret [21, 22]. Sammenlignet med den blanke prøven ble dens komponenter identifisert in vivo basert på informasjonen gitt av kromatogram-massespektrum, muligheten for en metabolsk reaksjon, egenskapene til den sammensatte strukturen og fragmenteringsregelen for massespekteret. Se tabell 3.

Identifikasjon av fenyletanolglykosider relaterte metabolitter

UNIFI-plattformen ble brukt til behandling. Figur 11 viste TIC-kromatografen av urin, avføring og plasma for CD og dets bearbeidede produkter. Sammenlignet med blankprøver ble totalt 54 metabolitter identifisert hos rotter, inkludert 10 prototypekomponenter og 44 metabolitter, der 24, 49 og 6 var i avføring, urin og plasma, tilsvarende.

Basert på nøyaktig masse, fragmenteringskaskade og forutsigbare nøytrale tap ved biotransformasjon, ble totalt 35 fenyletanoidglykosider-assosierte metabolitter foreløpig evaluert. De relaterte metabolittene til fenyletanoidglykosider har lignende massespektrumfragmenteringsmønstre, som det typiske koffeoylfragmentet m/z 461.1605, deretter hydrolysert videre av glykosid- og esterbindinger in vivo, og metabolisert til hydroksytyrosol (HT)(m/ z153.0504, C.HO.4.73 min.) og koffeinsyre(CA)(m/z179.0389, CH, 0.77 min.), se fig. 12A.

M11 indikerte [MH]~ ved m/ 153,0504 med formel ie, C.HO, og identifisert som HT. M16 presenterte [MH]- ved m/z 329,0851, som var 176 Da forhøyet enn for HT, noe som viste at det kan være en glukuronidert metabolitt av HT. [MH]-av M26 var ved m/z 343.1037,14 Da høyere enn for HT-glukuronid. Derfor ble M26 identifisert som HT-metylert glukuronid. M17 ble identifisert som HT-sulfat basert på dets [MH]-ved m/z 233.0112,80 Da over HT, som kunne metyleres ytterligere, og produserte deretter M22, som viste m/z 247.0278, noe som indikerer at det var HT- metylert sulfatert metabolitt. M7 (m/167.0335) og M5(m/z 167.0762) ble betraktet som henholdsvis oksidasjonsprodukter og metylert HT (fig. 12B).

M1 indikerte [MH]- ved m/z 179,0389, belyst molekylformel var CH-O og identifisert som koffeinsyre(CA). M25 viste [MH]- ved m/355,0704, som var 176 Da forhøyet enn CA, viser at det kan være en glukuronidert metabolitt av CA. M27 hadde m/z 258.994, som var 80 Da høyere enn CA, så vi belyste det som CA-sulfat, og det kunne produsere M35 (m/z 273.0064). Ettersom M4 gir [MH]7 ved m/z 193.0524,14 Da høyere enn CA, ble den identifisert som CA-metylert metabolitt. M39 var CA-dehydroksyleringsmetabolitt, med m/z 163,04, og den kunne sulfateres til M32 (m/z 242,9951).

M33(m/z 181.0491, C.HO,9,06 min) var reduksjonsproduktet av CA, det vil si 3,4-dihydroksybenzenpropionsyre, som kunne metyleres til M19 (m /z 195,0623, C10H1204, 0,93 min). M33 kan dehydreres til M43, det vil si 3-HPP (m/z 165.0558, C9H10O3, 11.29 min), og M31 (m/z 341.0942, C15H17O9, 8.90 min) og M29 (m.01206, C.0125,S. 8,52 min) var de glukuroniderte og sulfaterte produktene (fig. 12C).

For de fenyletanoidglykosider-assosierte metabolittene var de viktigste metabolske kaskadene fase II metabolske reaksjoner, dvs. glukuronidering, metylering og sulfatering. De foreslåtte metabolske kaskadene av fenyletanoider er avbildet i fig. 13.

Identifikasjon av iridoidrelaterte metabolitter

Ved å analysere den elementære sammensetningen av metabolittene, MSE-fragmentering og tilhørende litteratur, ble totalt 19 iridoid-assosierte metabolitter foreløpig evaluert. Iridoidglykosider ble hydrolysert av glykosidbindinger for å danne deres tilsvarende aglykoner. M/z 185,117 var for M8, 162 Da mindre enn ajugol, som ble gitt ved tap av glukoserester.

M40 (m/z 199,0641, Rt 10,91 min) var det deglykosylerte produktet av catalpol. M45 m/z 169,0487, Rt 12,15 min) var mindre enn 30 Da den for catalpol-deglykosylert metabolitt, og ble identifisert som fjerning av et molekyl av CH, O-metabolitt. M34 (m/z 151,0352, Rt 9,08 min), var ytterligere tap av H, O-metabolitt.

M44 (m/z 211,0665, Rt 11,31 min) var en deglykosylert metabolitt av geniposid, og M37 (m/z 197,0833, Rt 15,03 min) var deglykosylering av 8-epideoksylogansyre. Metabolske reaksjoner for iridoider kan avsløres som fase I-metabolisme av deglykosylering (fig. 12D).

Sammenligning av metabolsk profilering i plasma, urin og avføring mellom CD og dets bearbeidede produkter

2 prototyper i plasma, 7 i urin og 3 i feces ble sammenlignet. Det var 7 prototyper absorbert i CD, 7 prototyper absorbert i CD-NP, og 8 prototyper i CD-HP. M21 ble bare påvist i avføringsgruppen til CD-NP, og M38 og M51 ble kun påvist i uringrupper av CD-HP. Sammenlignet med metabolitter var identiske metabolitter i plasma, urin og feces henholdsvis 4, 42 og 21. Det var 34 metabolitter absorbert i CD-gruppen, 39 i CD-NP og 40 i CD-HP-gruppen. M5, M7, M40 og M52 ble bare påvist i CD-NP-grupper, mens M24, M4l og M48 nettopp ble påvist i CD-HP-grupper.

Variasjoner ble observert i absorpsjonen så vel som metabolismen av aktive forbindelser i forskjellige bearbeidede produkter av CD. Fra Fig.14 fant vi at intensiteten av HT-sulfat-konjugering (M17) var høyest i urinen, etterfulgt av 3-HPP-sulfat-konjugering (M29), metylert HT-sulfat-konjugering (M22), dehydroksylert CA-sulfat konjugasjon (M32) og 3,4-dihydroksybenzenpropionsyresulfatkonjugering (M19). Innholdet av metabolske produkter i den bearbeidede gruppen var høyere enn i CD-gruppen, spesielt for M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2. Deres forløper 6'-O-kaffeoylgruppe i 8-O- -D-glukopyranosyl-delen, forbindelser som hydroksytyrosol har anti-tumor, anti-inflammatoriske, antibakterielle, antivirale og antifungale egenskaper [ 23]. Koffeinsyre har anti-inflammatorisk, anti-kreft og antiviral aktivitet [24]. Det stemte overens med den kliniske bruken av CD og dens bearbeidede produkter.

Diskusjon

CD er en TCM, og dens viktigste bioaktive komponenter, inkludert PhGs, iridoider, polysakkarider har blitt dokumentert av ulike forskningsstudier. I TCM klinisk praksis har de bearbeidede produktene av CD blitt mye brukt i forhold til rå. Den kjemiske sammensetningen vil endres under behandlingen, noe som kan føre til endringer i den medisinske effekten (fig. 14).

PhG er en type fenolforbindelse karakterisert ved en -glukopyranosidstruktur som bærer en hydroksy-fenyletyldel som aglykonet. Disse forbindelsene omfatter ofte koffeinsyre og rhamnose festet til glukoseresten gjennom henholdsvis ester- eller glykosidbindinger. I den aktuelle studien, de kvalitative analysene av CD, CD-NP. og CD-HP ble utført, og totalt 97 forbindelser, inkludert fenyletanoidglykosider (PhGs), iridoider, etc. ble identifisert. De oppnådde resultatene viste variasjoner i kjemisk sammensetning før og etter prosessering. Intensiteten til PhG-er som har 4'-O-kaffeoylgruppen i 8-O- -D-glukopyranosyl-delen, som akteosid, cistanosid C, campneosid II, osmanthus-siden avtok etter å ha blitt behandlet, mens PhGs med

slik som isoacetosid, isosistanosid, isocampneosid I, økte isomartynosid, spesielt i CD-NP-gruppen. Intensiteten til echinakosid og cistanosid B hvis struktur har 6'-O- -D-glukopyranosyldel økte også. PhG med en 2'-acetylgruppe ble ofte redusert på grunn av hydrolysereaksjon under prosessen, som tubulosid B, 2-acetylacteosid.

Undersøkelse av metabolitter absorbert in vivo ble utført etter oral administrering av CD og dets bearbeidede produkter. De metabolske prosessene i fase II var nøkkelkaskadene, og de fleste metabolittene var sulfat, glukuronid og metylerte konjugater. Fenyletanolglykosider har lav oral absorpsjon og utnyttelse. De er vanskelige å bli absorbert i blodet og fungerer som forfedre for å spille sine roller etter metabolsk aktivering in vivo. Fenyletanoider produsert til fenyletanolaglykon, som hydroksytyrosol (HT) og koffeinsyre (CA) og dets derivat 3-hydroksyfenylpropionsyre (3-HPP), kan disse metabolittene lettere absorberes i plasma og ha en bedre medisinsk effekt.

CD og dens bearbeidede produkter. HT-sulfat-konjugering (M17) har høyest intensitet i urinen, etterfulgt av 3-HPP-sulfat-konjugering (M29), metylert HT-sulfat-konjugering (M22), dehydroksylert CA-sulfat-konjugering (M32), og 3,{{ 7}}dihydroksybenzenpropionsyresulfatkonjugering (M19). Innholdet av metabolske produkter i den bearbeidede gruppen var høyere enn i CD-gruppen, spesielt for M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2.

Generelt kan komponentene som har høy eksponering i målorganer være effektive. En tilstrekkelig mengde fenyletanoider og deres derivater har blitt evaluert og bestemt in vitro. Acteosid er den karakteristiske forbindelsen, hvis innhold avtok etter å ha blitt behandlet med risvin, og innholdet av isoacteosid, isosistanosid C, isocampneosid I økte tilsvarende. Nedbrytningsproduktene av PhGs, som CA- og HT-derivater, kan evalueres i bioprøvene, og risvin-behandling kan forbedre absorpsjonen av metabolitter in vivo.

Konklusjon

I denne studien ble 97 forbindelser påvist i ekstraktene av CD og dets bearbeidede produkt. Nedbrytningen av noen få glykosider skjedde under en forhøyet temperatur, og som et resultat ble noen nye isomerer og komplekser syntetisert. I in vivo-studier ble prototypekomponenter (10) og metabolitter (44) bestemt eller foreløpig evaluert i rotteplasma, avføring og urin. Fase II metabolske prosesser var nøkkelkaskadene, de fleste av metabolittene var assosiert med echinakosid eller akteosid, som HT, CA og deres derivater 3-hydroksyfenylpropionsyre 3-HPP. Disse metabolittene kan lettere absorberes i plasma og ha en bedre medisinsk effekt. De oppnådde resultatene viste at den kjemiske sammensetningen av CD var forskjellig og påvirket disponeringen av forbindelsen in vitro og in vivo.

Forkortelser

PhGs: Fenylethanoid glykosider; CD: Cistanche deserticola; CMM: Chinese Materia Medica; TCM: Tradisjonell kinesisk medisin; CD-NP: Gistanche deserticola Bearbeidet ved damping med risvin under normalt trykk; CD-HP: Cistanche deserticola Bearbeidet ved damping med risvin under høyt trykk; UPLC-Q-TOF-MS: Væskekromatografi med ultrahøy ytelse kombinert med TOF-MS; PCA: Hovedkomponentanalyse; VIP: Variabel betydning for projeksjonen;CA: Caffeicacid; HA: Hydroxytyrosol.

Anerkjennelser

Ikke aktuelt.

Forfatteres bidrag

LZ, LBN, SJ deltok i utarbeidelsen og skrev manuskriptet. RJ, LPP hjalp til med dyreforsøkene og utarbeidet og ferdigstilte alle figurer og tabeller. ZC, HY. ITZ hjalp til med utformingen og utførelsen av denne studien og gjennomgikk manuskriptet. Alle forfattere leste og godkjente det endelige manuskriptet.

Finansiering

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant No:81874345) og Natural Science Foundation of Liaoning Province (Grant No: 2020-MS-223).

Tilgjengelighet av data og materialer

Datasettene som er brukt og/eller analysert i løpet av den nåværende studien er tilgjengelig fra den tilsvarende forfatteren på rimelig forespørsel.

Erklæringer

Etikkgodkjenning og samtykke til å delta

Etisk godkjenning for bruk av forsøksdyr for denne studien var innhentet fra Medical Ethics Committee ved Liaoning University of Traditional Chinese Medicine (godkjenningsnummer: 2018YS(DW)-044-01), alle eksperimentelle prosedyrer i denne studien var under etiske standarder for den medisinske etiske komiteen ved Liaoning universitet for tradisjonell kinesisk medisin.

Samtykke til publisering

Ikke aktuelt.

Konkurrerende interesser

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter å avsløre.

Forfatterdetaljer

'Farmaceutisk avdeling, Liaoning universitet for tradisjonell kinesisk medisin, Dalian, Liaoning, Kina.' Drug Research Institute of Monos Group, Ulaanbaatar 14250, Mongolia.

Mottatt: 31. mai 2021 Godtatt: 17. september 2021 Publisert på nettet: 28. september 2021

Zhe Li1, Lkhaasuren Ryenchindorj2, Bonan Liu1, Ji Shi1* , Chao Zhang1, Yue Hua1, Pengpeng Liu1, Guoshun Shan1 og Tianzhu Jia1

Referanser

1. Kinesisk farmakopékommisjon. Pharmacopeia of the People's Republic of China, vol. I. Beijing: China Medical Science Press; 2020. s. 140.
2. Li Z, Lin H, Gu L, Gao J, Tzeng CM. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): en av de beste farmasøytiske gaver innen tradisjonell kinesisk medisin. Front Pharmacol. 2016;7:41.
3. Liu BN, Shi J, Zhang C, Li Z, Hua Y, Liu PP, Jia TZ. Effekter av forskjellige tørkebehandlingsmetoder for Fresh Cistanche deserticola på komponentinnholdet. J Chin Med Mater. 2020;10:2414–8.
4. Liu BN, Shi J, Jia TZ, Lv TT, Li Z. Optimalisering av høytrykksdampingsprosessen for Cistanches Herba. Chin Trad Patent Med. 2019;11:2576–80.
5. Fan YN, Huang YQ, Jia TZ, Wang J, La-Sika, Shi J. Effekter av Cistanches herba før og etter prosessering på antialdringsfunksjon og immunfunksjon hos D-galaktoseinduserte aldrende rotter. Chin Arch Trad Chin Med, 2017; 11:2882–2885.
6. Gao YJ, Jiang Y, Dai F, Han ZL, Liu HY, Bao Z, Zhang TM, Tu PF. Studie på avføringsmiddelbestanddeler i Cistanche deserticola YMCA. Moderne Chin Med. 2015;17(4):307–10.
7. Liu BN, Shi J, Li Z, Zhang C, Liu P, Yao W, Jia T. Studie på den nevroendokrine-immune funksjonen til Cistanche deserticola og dens risvinsdampende produkter i den glukokortikoid-induserte rottemodellen. Evid-basert komplement Alternat Med. 2020;22:5321976.
8. Guo Y, Wang L, Li Q, Zhao C, He P, Ma X. Forbedring av nyreforsterkende funksjon i musemodellen av Cistanches herba tørket raskt ved middels høy temperatur. J Med Food. 2019;22(12):1246–53.
9. Wang T, Zhang X, Xie W. Cistanche deserticola YC Ma, "Desert ginseng": en anmeldelse. Am J Chin Med. 2012;40(6):1123–41.
10. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: En oversikt over dens kjemi, farmakologi og farmakokinetiske egenskaper. J Ethnopharmacol col. 2018;219:233–47.
11. Lei H, Wang X, Zhang Y, Cheng T, Mi R, Xu X, Zu X, Zhang W. Herba Cistanche (Rou Cong Rong): en gjennomgang av dens fytokjemi og farmakologi. Chem Pharm Bull. 2020;68(8):694–712.
12. Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Nevrobeskyttende effekter av echinacoside i muse-MPTP-modellen av Parkinsons sykdom. Eur J Pharmacol. 2007;564:66–74.

13. Deng M, Zhao JY, Ju XD, Tu PF, Jiang Y, Li ZB. Beskyttende effekt av tubulosid B på TNF alfa-indusert apoptose i neuronale celler. Acta Pharmacol Sin. 2004;25(10):1276–84.
14. Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y, Tu PF. Anti-inflammatoriske iridoider fra stilkene til Cistanche deserticola dyrket i Tarim-ørkenen. Chin J Nat Med. 2016;14(1):61–5.
15. Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y, Tu PF. Fenyletanoidglykosider med anti-inflammatorisk aktivitet fra stilkene til Cistanche deserticola dyrket i Tarim-ørkenen. Fitoterapia. 2013;89:167–74.
16. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, Yoshikawa M, Hayakawa T, Muraoka O. Iridoid og asykliske monoterpenglykosider, kankanosider L, M, N, O og P fra Cistanche tubulosa. Chem Pharm Bull. 2010;58(10):1403–7.
17. Li SL, Song JZ, Qiao CF, et al. En ny strategi for raskt å utforske potensielle kjemiske markører for diskriminering mellom rå og bearbeidet Radix Rehmanniae av UHPLC-TOF-MS med multivariat statistisk analyse. J Pharm Biomed Anal. 2010;51(4):812–23.
18. Peng F, Chen J, Wang X, Xu CQ, Liu TN, Xu R. Endringer i nivåer av fenyletanoidglykosider, antioksidantaktivitet og andre kvalitetstrekk i Cistanche deserticola-skiver ved dampbehandling. Chem Pharm Bull. 2016;64:1024–30.
19. Ma ZG, Tan YX. Innholdsforandringer av seks fenyletanoidglykosider under dampende tidsspenn med vin i Desertliving Cistanche. Chin Trad Pat ent Med. 2011;33(11):1951–4.
20. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Effekt av dampingsprosessen på kvaliteten av postharvest cistanche deserticola for medisinsk bruk under soltørking. Biol Pharm Bull. 2016;39(12):2066–70.
21. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Metabolitter av diettacteosid: profiler, isolasjon, identifikasjon og hepatobeskyttende kapasitet. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.
22. Cui Q, Pan Y, Bai X, Zhang W, Chen L, Liu X. Systematisk karakterisering av metabolittene av echinacosid og acteosid fra Cistanche tubulosa i rotteplasma, galle, urin og avføring basert på UPLC-ESI-Q-TOF -MS. Biomed Chromatogr. 2016;30(9):1406–15.
23. Bertelli M, Kiani AK, Paolacci S, Manara E, Kurti D, Dhuli K, Bushati V, Miertus J, Pangallo D, Baglivo M, Beccari T, Michelini S. Hydroxytyrosol: en naturlig forbindelse med lovende farmakologiske aktiviteter. J Biotechnol. 2020;309:29–33.
24. Touaibia M, Jean-François J, Doiron J. Cafeic Acid, en allsidig farmakofore: en oversikt. Mini Rev Med Chem. 2011;11(8):695–713.

Utgivers notat

Springer Nature forblir nøytral med hensyn til jurisdiksjonskrav i publiserte kart og institusjonelle tilknytninger.