Chrysogenamid A fra en endofytisk sopp assosiert med Cistanche Deserticola og dens nevroprotektive effekt på SH-SY5Y-celler
Mar 03, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Introduksjon
Cistanche deserticola(YC Ma) er en parasittisk plante hjemmehørende nordvest i Kina. Stammen til denne planten er en viktig tradisjonell kinesisk medisin og brukes til behandling av nyremangel og neurasteni ("The Chinese Medicine Dictionary", 1977). Fenyltanoidglykosider fraCistanchedeserticolahar blitt rapportert å ha aktiviteter for å forebygge og behandle kranienervesykdommer og rense frie radikaler [1, 2]. Basert på det faktum at endofytiske sopp kan produsere nye medisinske komponenter og de samme/liknende som de fra vertsplantene, viser søk etter nye aktive forbindelser fra endofytiske sopp av viktige medisinplanter verdien for utvikling av nye medisinske ressurser. I løpet av vårt søk etter nye nevrobeskyttende forbindelser fra endofytiske sopp fraCistanchedeserticolasamlet fra Indre Mongolia i det nordvestlige Kina, ble tre aktive stammer screenet ved bruk av SH-SY5Y-celler. Blant dem viste kulturbuljongen av sopp nr. 005, autentisert som Penicillium chrysogenum, en betydelig nevrocyttbeskyttelseseffekt mot oksidativt stress-indusert celledød i SH-SY5Y-celler. Studier på de aktive bestanddelene i denne stammen førte til isolering av krysogenamid A (1) (fig. 1) gjennom en bioassay-veiledet isolasjonsprosedyre. I tillegg ble fire kjente forbindelser isolert og identifisert som circumdat i G (2) [3], 2-[(2-hydroksypropionyl) amino] benzamid (3) [4], 2- ,3-dihydrosorbicillin (4) [5] og (9Z,12Z)-2,3-dihydroksypropyloktadeka-9,12-dienoat (5) [6] , ved å sammenligne deres spektroskopiske data med litteraturdata. Her rapporterer vi om isolasjonen, identifiseringen og nevrobeskyttende effekten av chrysogenamid A.
Materialer og metoder
Soppmateriale En prøve av Penicillium chrysogenum nr. 005 ble isolert fra roten til C. deserticola samlet fra Indre Mongolia nordvest i Kina. På potet dekstroseagar var det makroskopiske utseende av spredte, glatte, fløyelsmyke, blågrønne kolonier noen ganger overgrodd med lyse hyfer; overflaten av koloniene viste ofte mange lysegule dråper; revers gul. Et GenBank-søk med 18S ribosomalt DNA-gensekvens nr. 005 (1676 nukleotider; Gen-Bank-aksessnummer EU203859) ble utført. Resultatene indikerer en art av Penicillium chrysogenum som den nærmeste matchen. På grunnlag av dets makroskopiske utseende og 18S rDNA-gensekvens, er No.005 en stamme av Penicillium chrysogenum.
Fermentering og ekstraksjon
Soppen ble dyrket under statiske forhold ved 24 grader i 3{{10}} dager i 35 1000-ml koniske flasker som inneholdt et flytende medium (30{{2{{22} }}} ml/kolbe) sammensatt av glukose (10 g/liter), maltose (20 g/liter), mannitol (20 g/liter), mononatriumglutamat (10 g/liter), KH2PO4 (0,5 g/liter), MgSO4·7H2O (0,3 g/liter), maisstøvlut (1,0 g/liter) og gjærekstrakt (3,0 g/liter) og sjøvann etter justering av pH til 7,0. Den fermenterte hele buljongen (10,5 liter) ble ekstrahert tre ganger med EtOAc for å gi en EtOAc-løsning, som ble konsentrert under redusert trykk for å gi et råekstrakt (9,5 g).
Rensing
Råekstraktet (9,5 g) ble separert i 15 fraksjoner på en silikagelkolonne ved bruk av en trinnvis gradienteluering av petroleumseter/Me2CO. Fraksjon 2, eluert med 8:2 petroleumseter/Me2CO, ble omkrystallisert fra MeOH, og ga 3 som fargeløse nåler (8,{{10}} mg). Fraksjon 3 (19,{{30}} mg), eluert med 7:3 petroleumseter/Me2CO, ble ytterligere separert med omvendt-fase kolonne (RP18, 40 6{{38 }} mm, Merck; MeOH - H2O 3:2→4:1→MeOH) for å gi fr. 3 7 (8.0 mg), som ble renset ved omfattende PHPLC (60 prosent MeOH inneholdende {{70}},1 prosent TFA, 4.{{77} } ml/minutt) for å gi 4 (2,{{80}} mg). Fraksjon 4 (26,0 mg), eluert med 6:4 petroleumseter/Me2CO, ble ytterligere separert med omvendt-fase kolonne (RP18, 40 60 mm, Merck; MeOH - H2O 3:2 → 4:1 → MeOH) for å gi fr. 4-3 (5,4 mg) og fr. 4-9 (7,6 mg). Deretter vil fr. 4-3 ble separert ved omfattende PHPLC [YMC-pakke ODS (A), 10 250 mm, 5 mm, 4,0 ml/minutt] (60 prosent MeOH, 4,0 ml/minutt) for å gi 2 (1,0 mg), og den fr. 4-9 ble separert ved omfattende PHPLC (80 prosent MeOH, 4,0 ml/minutt) for å gi 1 (4,0 mg) og 5 (2,6 mg). 1: oppnådd som blekgult fast stoff; [a]D25 24,5 grader (c 0,155, MeOH); UV (MeOH) 1 maks. 208, 251 nm; CD (MeOH) (se fig. 4); IR (KBr) n maks 3433, 3200, 3076, 2928, 2862, 1677, 1440, 1370, 1324, 1188, 1029 cm1; 1H- og 13C-NMR (se tabell 1); HRESI-MS m/z 448,2951 [MH] (beregnet for C28H38N3O2, 448,2964)
DPPH Radical Scavenging Effect
En MeOH-løsning (160 ml) med varierende prøvekonsentrasjoner (1,0 mg/ml 0,0001 mg/ml) ble tilsatt til 40 ml DPPH (1,1- difenyl{{8) }} pikrylhydrazyl; Sigma) MeOH-løsning (1,5 10 4 M). Etter forsiktig blanding og etterlatelse i 30 minutter ved romtemperatur, ble den optiske tettheten målt ved 520 nm ved bruk av et spektrofotometer. Antioksidantaktiviteten til hver prøve ble uttrykt i form av IC50 (mg/ml eller mM nødvendig for å hemme DPPH-radikaldannelse med 50 prosent) og beregnet fra log-dose-hemmingskurven.
nevrobeskyttende av cistanche deserticola
Cellekultur og medikamentell behandling
Humane neuroblastom SH-SY5Y-celler ble dyrket i et DMEM-medium og holdt ved 37 grader i en fuktet atmosfære med 5,0 prosent CO2. Disse cellesuspensjonene (180 ml) med en tetthet på 5*104 celler ml-1 ble sådd ut i 96--brønns mikrotiterplater og inkubert i 24 timer ved ovenstående tilstand. Chrysogenamid A-løsning (2,0 ml i DMSO) i forskjellige konsentrasjoner ble tilsatt til hver brønn unntatt kontroll- og modellgruppene og inkubert videre i 1 time under de samme forholdene. H2O2 (Sigma Chemical Co., MO, USA) ble tilsatt for å indusere apoptose i SH-SY5Y-celler ved en sluttkonsentrasjon på 200 mM i 24 timer. Cellelevedyktighet ble bestemt ved å bruke en MTT-analyse. MTT oppløst i fosfatbufret saltvann ble tilsatt ved slutten av inkubasjonen til en sluttkonsentrasjon på 5,0 mg/ml (PBS), og deretter inkubert ved 37 grader i 4 timer. Ved å kaste supernatanten ble det resulterende formazanproduktet oppløst.
Resultater og diskusjon
1 ble oppnådd som et blekgult fast stoff. Molekylformelen ble bestemt som C28H37N3O2 ved HRESI-MS (observert [MH] ved m/z 448.2951, kalt [MH] C28H38N3O2, 448.2964). IR-spekteret antydet tilstedeværelsen av NH (3433 og 3200 cm 1 ) og karbonylgruppe(r) (1677 cm-1). 1H-NMR (tabell 1)-spekteret registrert i DMSO-d6 avslørte tre metylgrupper (dH 0.62, 0.87, 0.98) og to utskiftbare protonsignaler (d H 10.36 og 8.29). Dessuten indikerte tre ortos-koblede aromatiske signaler (d H 6,90 dd, J 7,3, 7,3 Hz, 6,94 d, J 7,3 Hz og 7,18 J 7,3 Hz) en 1,2,3-trisubstituert benzenring. Metylenprotonene (d H 3,23) koblet med et olefinisk proton (d H 5,27), sammen med to vinylmetyler (d H 1,67 og 1,70), indikerte tilstedeværelsen av en 3-metyl-2-butenylgruppe i 1. En-bindingsforbindelsene til disse protonene og ytterligere 14 metin- og/eller metylenprotoner ble etablert ved et HMQC-eksperiment. 13C-NMR og DEPT (tabell 1) spektra, som avslørte 28 signaler, bekreftet også tilstedeværelsen av disse to fragmentene [trisubstituert benzenring (dC 123,6 CH, 120,8 CH, 127,7 CH, 122,1 QC og 140,4 QC) og a {79}}metyl-2-butenyl (dC 28 CH2, 121,9 CH, 132,3 QC, 25,5 CH3 og 17,7 CH3)]; i tillegg to karbonyler (dC 183.1 og 172.3), fire sp3 kvaternære karboner (dC 46.5, 58.7, 60.4 og 62.3), to sp3 metiner (dC 46.1 og 58.7) og seks sp3 metylener (7, 320..8, 320. 35,2, 39,9 og 64,9) ble også observert. Siden 6 av 12 umetninger ble gjort rede for, ble 1 antatt å inneholde seks ringer. Ytterligere evaluering av disse spektraldataene, sammen med 1 H-1 H COSY- og HMBC-resultater, viste at 1 er nært beslektet med marcfortine-gruppen av soppmetabolitter [7]. Tolkning av HMBC-korrelasjoner (fig. 2) indikerte tilstedeværelsen av delstruktur A (HMBC-korrelasjoner 1-NH til C-8 og C-9; H-6 til C{{ 136}}; H-5 til C-7 og C-9; H-26 til C-28 og C-8 og H{{143 }} til C-29 og C-30) og B (HMBC-korrelasjoner H-10 til C-3, C-22, C-21, C-11, C-12; H-20 til C-13, C-18, C-22, C-11 og { {157}}NH til C-13, C-10), og C, en seksleddet G-ring [8] med et metylert karbon ved C-17 (HMBC-korrelasjoner H{{ 163}} til C-17, C-16). Tilkoblingen av understruktur A til B til C-3 ble støttet av nøkkel-HMBC-korrelasjonene fra H-4 og 1-NH til C-3; H-10 til C-2 og C-9. Forbindelsen mellom struktur B og C med et nitrogenatom ble utledet av nøkkel-HMBC-korrelasjonene fra H-12 til C-17 og C-13 og sammenligne deres tilsvarende kjemiske skift av C{{176 }} og C-17 (dC 64,9 og 58,7). Ovennevnte analyse indikerte at 1 hadde en lignende struktur som marcfortin A bortsett fra forskjellene i sidekjeden ved benzenringen og metyl ved C-17 i den seksleddede G-ringen. Så bruttostrukturen til 1 ble tildelt som vist i fig. 1
Den relative stereokjemien til 1 ble belyst på grunnlag av NOESY-data (fig. 3). Tidligere studier har avslørt at forbindelsene av 2-oksindolalkaloid-typen adopterte en konformasjon der den sentrale fem-leddede ringen er ortogonal til planet til oksindol-underenheten [9].
NOESY-korrelasjoner mellom H{{0}} og H-10a, H-25 og mellom 19-NH og H-10a indikerte at de begge var på forsiden av cyklopentanonringen som orienterer dem mot H-4, og fikserer den relative stereokjemien ved C-3 som vist. NOESY-interaksjoner mellom H-21, H-12a, H-10b, H-23 og H-24 plasserte de tilsvarende substituentene sammen på fronten til cyklopentanonringen. Den relative stereokjemien som er foreslått for 1 er i samsvar med de relevante egenskapene til den relative stereokjemien til marcfortine A [7]. Bomullseffekten ved 200-250 nm oppstår fra en np*-overgang av diketopiperazin-amidbindingene, som er diagnostisk for bicyklo-[2.2.2]-diazaoktan-diketopiperazin-kjernen [10, 11]. CD-spekteret på 1 (fig. 4) korrelerte med relevante områder av det til -brevianamid A [11]. Så den absolutte stereokjemien til 1 skulle være 3S, 11S, 13S, 17S, 21R og ble gitt navnet krysogenamid A. Foreløpig evaluering av den beskyttende effekten av krysogenamid A på nevrocytter ble evaluert ved å bruke oksidativt stress-indusert celledød i SH-SY5Y celler ved en MTT-analyse. Den frie radikalfjernende aktiviteten til krysogenamid A ble først undersøkt ved å bruke DPPH som frie radikaldonor. I motsetning til vitamin C (IC50: 29,0 mM), viste ikke krysogenamid A noen evne (IC50 større enn eller lik 100 mM) til å rense DPPH frie radikaler i en konsentrasjon opp til 100 mM. I mellomtiden testet vi om krysogenamid A beskyttet celler mot oksidativt stress-indusert celledød i SH-SY5Y humant neuroblastom
celler. Det oksidative stresset av hydrogenperoksid resulterte i en reduksjon i cellelevedyktigheten med 43 prosent sammenlignet med kontrollgruppen. Chrysogenamid A hemmet celledød indusert av hydrogenperoksid ved å forbedre cellenes levedyktighet med 59,6 prosent ved en konsentrasjon på 1*10-4 mM. Disse dataene antydet at krysogenamid A viste en nevrocyttbeskyttelseseffekt mot oksidativt stress-indusert celledød, ikke gjennom dets antioksidantaktivitet. Indolalkaloider som har et uvanlig bicyklo [2.2.2] diazaoktanringsystem er blitt isolert fra forskjellige soppslekter som Aspergillus [12, 9, 13], Penicillium [14 16] og Malbranchea [17]. 1 var et nytt medlem av denne gruppen av forbindelser, den hadde et skjelett som forventes å være et mellomprodukt i biosyntesen av citrinadminene A og B rapportert som en ny klasse av pentacykliske spiroindolinonalkaloider i 2005 [18]. Fra et strukturelt synspunkt er det viktig å påpeke at 1 er en unik struktur med metylering i posisjon C-17 og en 2- oksindoldel som har en isoprenenhet ved C-7. Noen av disse indolalkaloidene isolert til dags dato viser en potent antiparasittisk aktivitet [19], hemming av humane tumorceller [13] og cytotoksisitet [10]. Så vidt vi vet, er det den første rapporten om nevrobeskyttelse av denne typen alkaloider.
BekreftelseDette arbeidet ble økonomisk støttet av det kinesiske nasjonale naturvitenskapsfondet (nr. 30472136).
nevrobeskyttende av cistanche deserticola: anti-Alzheimers sykdom
Cistanche deserticola har mange effekter, klikk her for å vite mer
Referanser
Li LL, Wang XW, Wang XF. Antilipidperoksidasjon og antistrålingsvirkning av glykosider iherba Cistanches. China J Chin Mater Med 22: 364–367 (1997)
Xie JH, Wu CF. Effekt av etanolisk ekstrakt avCistanche deserticolapå innholdet av monoamin-nevrotransmittere i rottehjerne. Chin Trad Herb Drugs 24: 417–419 (1993)
Dai JR, Carte BK, Sidebottom PJ, Yew ALS, Ng SB, Huang Y, Butler MS. Circumdatin G, en ny alkaloid fra soppen Aspergillus ochraceus. J Nat Prod 64: 125–126 84 Fig. 2 Key HMBC og 1 H-1 H COSY-korrelasjoner på 1. Fig. 3 NOESYs på 1. Fig. 4 CD-spektrum på 1.(2001)
Kettering M, Sterner O, Anke T. Antibiotika i kjemisk kommunikasjon av sopp. Zeitschrift fuer Naturforschung, C: Journal of Biosciences 59: 816–823 (2004)
Trifonov LS, Bieri JH, Prewo R, Dreiding AS, Hoesch L, Rast DM. Isolering og strukturbelysning av tre metabolitter fra Verticillium intertextum: sorbicillin, dihydrosorbicillin og bisvertinokinol. Tetrahedron 39: 4243–4256 (1983)
Zhang GL, Xing QY, Zhang MZ. Glykolipider fra Mirabilis Himalaya. Phytochemistry 45: 1213–1215 (1997)
Polonsky J, Merrien MA, Prange T, Pascard C, Moreau S. Isolering og struktur (røntgenanalyse) av marcfortine A, et nytt alkaloid fra Penicillium roqueforti. JCS Chem Comm 13: 601–602 (1980)
Lee BH, Kornis GI, Cialdella JI, Clothier MF, Marshall VP, Martin DG, McNally PL, Mizsak SA, Whaley HA, Wiley VH. Mikrobiologisk hydroksylering ved seks individuelle karbonatomer av marcfortine A. J Nat Prod 60: 1139–1142 (1997)
Whyte AC, Gloer JB, Wicklow DT, Dowd PF. Sclerotiamid: Et nytt medlem av paraherquamidklassen med kraftig antiinsektanaktivitet fra sklerotia til Aspergillus sclerotiorum. J Nat Prod 59: 1093–1095 (1996)
Kato H, Yoshida T, Tokue T, Nojiri Y, Hirota H, Ohta T, Williams RM, Tsukamoto S. Notoamides AD: prenylerte indolalkaloider isolert fra en marin-avledet sopp, Aspergillus sp. Angew Chem Int Ed 46: 2254–2256 (2007)
Williams RM, Kwast E, Coffman H, Glinka T. Bemerkelsesverdig, enantio-divergent biogenese av brevianamid A og B. J Am Chem Soc 111: 3064–3065 (1989)
Banks RM, Blanchflflower SE, Everett JR, Manger BR, Reading C. Nye anthelmintiske metabolitter fra en Aspergillus-art: aspergillimidene. J Antibiot 50: 840-846 (1997)
Qian-Cutrone J, Haung S, Shu YZ, Vyas D, Fairchild C, Menendez A, Krampitz K, Dalterio R, Klohr SE, Gao Q. J Am Chem Soc 124: 14556–14557 (2002)
Wilson BJ, Yang DTC, Harris TM. Produksjon, isolasjon og foreløpige toksisitetsstudier av brevianamid A fra kulturer av Penicillium Viridicatum. Appl Microbiol 26: 633–635 (1973)
Birch AJ, Russell RA. Studier i forhold til biosyntese XLIV. Strukturelle belysninger av brevianamider B, C, D og F. Tetrahedron 28: 2999–3008 (1972)
Liesch JM, Wichmann CF. Nye antinematodale og antiparasittiske midler fra Penicillium Charles. II. Strukturbestemmelse av paraherquamider B, C, D, E, F og G. J Antibiot 43: 1380–1386 (1990) 17. Martinez-Luis S, Rodriguez R, Acevedo L, Gonzalez MC, Lira-Rocha A, Mata R Malbrancheamid, en ny kalmodulinhemmer fra soppen Malbranchea aurantiaca. Tetrahedron 62: 1817–1822 (2006)
Mishima T, Tsuda M, Kasa Y, Ishiyama H, Fukushi E, Kawabata J, Watanabe M, Akao K, Kobayashi J. Absolutt stereokjemi av citrinadiner A og B fra en marin-avledet sopp. J Org Chem 70: 9430–9435 (2005)
Lopez-Greta MP, Gonzalez MC, Ciavatta L, Ayala I, Moya P, Primo J. Insekticid aktivitet av paraherquamides, paraherquamides, inkludert paraherquamide H og paraherquamide I, Two New Alkaloids Isolated from Penicillium cluniae. J Agric Food Chem 54: 2921–2925 (2006)
nevrobeskyttende for cistanche deserticola: anti-Alzheimers sykdom og Parkinsons sykdom
