Effekter av cistanche på apoptose dopaminerge nevroner indusert av nevrotoksin 1-metyl-4 -fenylpyridinium (MPP)
Mar 10, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Tian Jiyu, Chen Jianzong
(Tradisjonell kinesisk medisin og kinesisk Materia Medica Research Center ved Xijing Hospital, FMMU, Xi'an 710032)
Abstrakt
Objektiv: For å undersøke effekten avCistanche på primærkulturens dopaminerge nevroner apoptosecelle indusert av 1-metyl-4-fenylpyridinium (MPP pluss). Metode: For å forberede kaninens serum bestående avCistanchebenytter metoden for serumfarmakologi. Analyser deretter effekten av Cistanche på apoptosecellen til DA-nevroner fraMPP plussinduserte modeller ved bruk av morfologisk, flowcytometri, TUNEL-farging.Resultat: Behandling på 200μmol/LMPP plussi 24 timer eller lenger indusert apoptose i DA-nevroner. EtterMPP plussbehandlet, er apoptoseforholdet for gruppen som inneholder en ekvivalent dose av serumet til Cistanche 6,3 prosent, gruppen avMPP plussbehandlet alene er 30,2 prosent. Antall apoptoseceller i B- og C-gruppen er betydelig mindre enn E-gruppen (P<0.05).>Konklusjon: Serumet inneholdtCistanchebeskyttet apoptose DA nevroner indusert avMPP pluss.
Nøkkelord: Cistanche;1-metyl-4-fenylpyridinium(MPP pluss); dopaminerge nevroner; apoptose
For tiden er hovedterapien forParkinsons sykdomer erstatningsterapi av sammensatte levodopa (L-dopa) preparater, som ikke kan kontrollere utviklingen av sykdommen. Etter hvert som sykdommen utvikler seg, økes dosen, og generelt sett, innen 3 til 5 år, avtar den kurative effekten, motoriske symptomer svinger og medikamentinduserte dyskinesier vises. Nyere studier har funnet at L-dopa har effekten av å indusere apoptose på nevroner dyrket in vitro[1, 2], og så har det blitt foreslått at den nevrotoksiske effekten av endogent dopamin fører til tap av dopaminerge nevroner iParkinsons sykdom. En av grunnene [3]. I langsiktig klinisk praksis har vi brukt kinesisk medisin forgir næring til leveren og nyrenekombinert med levodopapreparater for å behandle PD og oppnådde gode resultater [4-6]. Dette eksperimentet utforsket den beskyttende effekten av tradisjonell kinesisk medisin på dopaminerge nevronapoptose og dens mekanisme fra molekylære og cellulære nivåer.
1. Materialer og metoder
1.1 Materialer
DMEM medium,1-metyl-4-fenylpyridinium, MPP pluss, føtalt bovint serum kjøpt fra Gibco Company.Cytarabin, poly-l-lysin, PLLble kjøpt fra Sigma Company. 24-brønnkulturplate, 25 cm2
Kulturkolber av plastble kjøpt fra NUNC Company.Den kinesiske medisinenvi ble brukt ble kjøpt fra Xi'an Decoction Piece Factory. Dyr vi ble brukt er levert av skolens dyresenter.https://www.xjcistanche.com/products
1.2 Forberedelse og eksperimentell gruppering av medisinert serum
Cistanche tilberedes som et frysetørket pulver for konservering og fortynnes med destillert vann når det brukes. Dyreserumet ble tilberedt fra New Zealands hvite kanin med stor øreserum, som alle var friske hanner som veide 2.5-3.0 kg. Den ekvivalente dosen av dyr konverteres i henhold til kroppsoverflaten og deles tilfeldig inn i blankt kontrollgruppeserum; 1/2 ekvivalent dosegruppeserum (gavagedose av Cistanche-råmedisinsk materiale 0,8g/kg); ekvivalent dosegruppeserum(Genagedosen er Cistanche cistanche originalt medisinsk materiale 1,6 g/kg); 2 ganger tilsvarende dose påserum(sondedosen er Cistanche originalt legemiddel 3,2 g/kg). Gavage to ganger daglig i totalt 3 dager, 1 time etter siste sonde, karotis blodatting, over natten ved 4 grader, sentrifugering ved 2500 r/min i 25 minutter, forsiktig separering av serum, inaktivering ved 56 grad i 30 minutter, og sug gjennom 0,22μm filtermembran Filtrer ut bakterier og lagre ved -20 grad . Under de samme betingelser ble et blankt kaninkontrollserum fremstilt ved sondemating med et likt volum av normalt saltvann. Eksperimentet ble delt inn i 5 grupper. Gruppe A var en blank kaninserumkultur kontrollgruppe; Gruppe B var enserumkultur pluss MPPbehandlingsgruppe som inneholder 2 ganger ekvivalent dose; Gruppe C var enserumkultur pluss MPPbehandlingsgruppe som inneholder en ekvivalent dose; Gruppe D var en serumkulturkontrollgruppe inneholdende 1/2 ekvivalent dose av serumkultur pluss MPP-behandlingsgruppe; E-gruppen er blank kaninserumkultur pluss MPP-behandlingsgruppe.
Cistanche fordel
1.3 Dyrking av dopaminerge nevroner i mellomhjernen
Tre SD-rotter etter 14 dagers svangerskap ble selektert og drept ved direkte injeksjon av luftemboli i hjertet; de embryonale rottene ble tatt ut under aseptiske forhold og plassert i en petriskål fylt med is-D-Hanks-løsning. Det føtale rottehjernevevet ble dissekert og separert under et stereomikroskop. Referansemetoden [7] ble noe forbedret. Hjernehinnene og vaskulært vev ble skrellet av, og vevene i A8-, A9- og A10-områdene i den ventrale midthjernen ble separert. Tilsett 1 ml 0,125 prosent pankreatin og plasser det i en 37 graders inkubator i ca. 20 minutter, tilsett en passende mengde kulturmedium som inneholder 10 prosent føtalt bovint serum for å avslutte fordøyelsen, og bruk aspirasjon
Pipetter røret inn i en jevn cellesuspensjon, sentrifuger ved 15 00r/min i 5 minutter ved romtemperatur, fjern forsiktig supernatanten, pipetter 15 ganger med en tynnhalset pipette og la den stå i 5 minutter. I 24-brønnkulturplaten med lysin, tilsett kulturmedium til hver brønn for å justere celletettheten til 2×105 celler/mL, tilsett kulturmedium til 0,5mL per brønn, og tilsett cytarabin etter 3 dagers dyrking ( sluttkonsentrasjonen er 10μmol/L), hemmer veksten av ikke-nevroner.
1.4 Tyrosinhydroksylase (TH) immuncytokjemisk farging
Ved bruk av SABC-metoden inneholder antistofffortynningsvæsken bovint serumalbumin 1g/100mL (Boster Company, Wuhan), 0,3 prosent Triton-100 (Sigma, USA), NaN3 80mg/ 100 ml, fortynnet med PBS til 100 ml, juster pH til 7,6. Kulturen ble avsluttet på den 7. dagen, vasket med D-PBS i 5 minutter 3 ganger, nylaget 4 prosent paraformaldehyd ble fikset ved romtemperatur i 30 minutter og vasket med D-PBS i 5 minutter 3 ganger; med 1:1:8 hydrogenperoksid, metanol og PBS-løsning Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur, skyll med D-PBS i 5 minutter, tilsett 5 prosent blokkerende geiteserum i 30 minutter ved romtemperatur, skyll med D-PBS i 5 minutter minutter, og tilsett geit-anti-mus TH-antistoff fortynnet med antistoff-fortynning (1:1000 fortynning, Calbiochem) ), over natten ved 4 grader, skyll med D-PBS i 3 minutter 3 ganger, tilsett biotinylert muse-anti-rotte-IgG fortynnet med antistoff fortynningsmiddel (fortynnet 1:200, Sigma USA), virke ved romtemperatur i 4 timer, skyll med D-PBS i 3 minutter 3 ganger, tilsett HRP-komplekset fortynnet med antistofffortynningsmiddel i 2 timer ved romtemperatur, og skyll med D-PBS i 3 min 3 ganger. Skyll DAB-fortynningsvæsken i 3 minutter, tilsett den bruksklare DAB-kromogene reagensen (Wuhan Boster Company) i cellene, og observer fargen under et invertert mikroskop.https://www.xjcistanche.com/
1.5 Legemiddelhåndtering
De morfologiske observasjonene av de dyrkede nevronene ble utført under et fasekontrastmikroskop hver dag og endringene ble registrert med fotografier. Etter dyrking i 12 timer ble cellene observert under et invertert mikroskop og medikamentene ble tilsatt like før sammenløp. Seruminnholdet i hver gruppe var 10 prosent. Etter dyrking i 3 dager ble MPP pluss tilsatt til sluttkonsentrasjonen på 200 μmol/L. Etter inkubering i en 37 graders, 5 prosent CO2-inkubator i 24 timer, utfør ulike inspeksjoner.
Cistanche
1.6 Flowcytometrideteksjon
Medikamentell behandling var den samme som før. Etter at hver gruppe ble behandlet, ble de adherente PC12-cellene fordøyd med 0.125 prosent trypsin, og cellene ble tatt ca. 1×106 PBS. Cellene ble vasket to ganger, og 490 μL bindingsbuffer ble tilsatt, og cellene ble grundig blandet, og 5 μL annexin V ble tilsatt. FITC og 10 μL oppløst PI i cellesuspensjonen, bland forsiktig, sett reagensrøret på 4 grader, inkuber i 10 minutter i mørket og test på COULTER EPICS flowcytometer (Beckman Coulter, USA).
1.7 In situ endemerking (TUNEL) for å oppdage celleapoptose
DNA in situ endemerking av dyrkede nevroner bruker Bosters apoptosedeteksjonssett (MK1022), og trinnene er som følger: Ta de dopaminerge nevroncellene fra hver gruppe etter MPP pluss-behandling (glasset før primærkulturen er pre-dyrket med polymer Lysin-behandling), fiksert med 4{{30}}g/L paraformaldehyd i 1 time, fersk 3 prosent eddiksyre (pH2,5) ved romtemperatur i 10 minutter, nøytraliser alkalisk fosfatase, tilsett 0,1mol/L TBS (pH7,5) 1:200 nyfortynnet proteinase K-fordøyelse ved 37 grader i 20 sekunder, tilsett 1μL TdT og DIG-d-UTP til hvert objektglass og 18μL bufferløsning i 2 timer ved 37 grader; tilsett 50 μL blokkeringsløsning til hvert objektglass, ved romtemperatur i 30 minutter; Tilsett 50 μL biotinylert anti-digoksigenin-antistoff fortynnet med blokkeringsløsning; reagere i 30 minutter i en våt boks ved 37 grader; tilsett 50 μL SABC-AP fortynnet med 0,1 mol/L TBS til hvert objektglass; BCIP/NBT (0,1 mol pH9,5/L TBS fortynnet 1:20) ble tilsatt til prøven for å utvikle farge i 30 minutter; samtidig, en alternativ kontroll (TdT buffer ble brukt i stedet for TdT/biotin-dUTP blanding) for fotomikrografi og invertert fase kontrastmikroskop (200×) Observer de apoptotiske cellene. Tell positive celler under et fasekontrastmikroskop, tell 5 felt per brønn i hver gruppe, for totalt 6 brønner.
2. Eksperimentelle resultater
2.1 Morfologisk observasjon av dyrkede nevroner
Observert av OlympusIX70 fasekontrastmikroskop: 5 timer etter inokulering fester de fleste cellene seg til veggen, cellene er spredt, cellekroppen er rund, kjernen er usynlig og brytningsindeksen er sterk. Etter dyrking i 24 timer vokste cellefremspringene og ble gradvis forlenget. Ved 48 timer stakk de fleste av cellene ut med forgrenede filamentøse fremspring. Cellemorfologien var mangfoldig, som var bipolar, tripolar og multipolar, og dannet gradvis et sparsomt nettverk. Cellekroppen var forstørret, rund og elliptisk. Etter MPP pluss skade svulmet først cellene, brytningsindeksen økte, cellene var i en degenerativ tilstand, og cellene krympet til slutt og falt av. Ulike doser av sammensatt serum som inneholder kinesisk medisin har beskyttende effekter på MPP pluss skade. Etter at kulturen ble farget med TH-immunceller, ble det sett at TH-positive celler var brune med neurittutvekst. Etter tilsetning av tilsvarende dose av tradisjonell kinesisk medisin serum, andelen TH-positivenevronerkan nå 55 prosent -60 prosent .
2.2 Analyse av flowcytometritestresultater (se figur 1)
Fosfatidylserin (PS) lokalisert inne i cellemembranen i det tidlige stadiet av apoptose migrerer til utsiden av cellemembranen. Fosfatidylbindende protein V (Annexin V) er et kalsiumavhengig fosfolipidbindende protein, som har høy affinitet for PS. Derfor kan Annexin V brukes som en sonde for å oppdage PS eksponert på cellemembranoverflaten. Samtidig, kombinert med PI-ekskluderingsmetoden for dobbelfargingav apoptotiske celler kan apoptotiske celler påvises ved flowcytometri. I nedre høyre kvadrant i fig. 1 (FITC pluss /PI-), vises apoptosedetaljene for hver gruppe. Andelen celler, apoptosefrekvensen for hver gruppe var 4,1 prosent, 5,8 prosent, 6,3 prosent, 28,6 prosent, 30,2 prosent.
2.3 Analyse av TUNEL-fargeresultater
De med blålilla partikler i kjernen er positive celler, det vil si apoptotiske celler. Andelen apoptotiske celler i hver gruppe ble talt under et lysmikroskop. Antall apoptotiske celler per synsfelt i hver gruppe var: Gruppe A 2,13±0.34; Gruppe B 4,92±0,67; Gruppe C 6,20±1,47; Gruppe D 10,33±1,51; Gruppe E 12,74±2,51. Ettert-test analyse,B- og C-gruppene ble sammenlignet med E-gruppen (P<0.05). the="">resultaterer i utgangspunktet i samsvar medresultater av flowcytometri.
3. Diskusjon
Parkinsons sykdomtilhører kategorien "tremorsyndrom" i kinesisk medisin. Tradisjonell kinesisk medisin mener at utbruddet av PD stort sett er en serie av manifestasjoner av gradvis uttømming av leveren og nyrene hos eldre og tap av næring av hjernemargmeridianen. Hovedbehandlingen er ågi næring til leveren og nyrene, roe ned leveren og eliminer vind. Tradisjonell kinesisk medisin kan spille formålet med "redusere toksisitet og øke effektiviteten"i behandlingen avParkinsons, men virkningsmekanismen er ikke veldig klar for øyeblikket. Et stort antall eksperimentelle bevis i moderne medisin indikerer at oksidativt stress er en av faktorene som forårsaker døden av PD-nerveceller [3]. Studier har funnet at de totale glykosidene av cistanche effektivt kan fjerne ulike reaktive oksygenfrie radikaler og beskytte DNA mot oksidasjon forårsaket av OH[8]. Cistanche-ekstrakt tubulosid B kan dempe cytotoksisiteten indusert avMPP pluss,svekker akkumuleringen av reaktive oksygenarter i cellen, og har en antagonistisk effekt på apoptose og oksidativt stress indusert avMPP pluss[9]. Tradisjonell kinesisk medisin kan aktivere og styrke sin egen beskyttende signalvei, motstå ytre skader og gjenopprette balansen. Dette er et av målene for moderniseringen av tradisjonell kinesisk medisin. Etter dopaminerstatningsterapi verdsetter folk nå generelt nevrobeskyttende terapi, som kalles den andre revolusjonen i behandlingen avParkinsons sykdom. I dette eksperimentet ble de isolerte mellomhjernens dopaminerge nerveceller dyrket med serumholdig kinesisk medisin, og det ble funnet at Cistanche har en viss nevrobeskyttende effekt. I dette eksperimentet ble to deteksjonsmetoder for flowcytometri og TUNEL-farging brukt for samtidig å finne at ekvivalent dosegruppeserum og 2 ganger ekvivalent dosegruppeserum fra Cistanche medisinert serumkultur kan redusere den primære dyrkede dopaminnerven i midthjernen forårsaket avMPP plussAntallet apoptotiske celler har en viss beskyttende effekt på apoptotiske celler. Tradisjonell kinesisk medisin kan beskytte dopaminerge nevroner mot skade i tidlig fase, noe som er et viktigere tiltak enn andre terapier. Slik sett er den holistiske behandlingen av kinesisk medisin kuren for grunnårsaken, og den kan betraktes som en av de nevrobeskyttende behandlingene som folk setter pris på i dag.
Referanser
1. Ziv I, Zilkha-Falb R, Offen D, et al. Levodopa induserer apoptose i dyrkede nevronceller - en mulig akselerator for nigrostriatal degenerasjon ved Parkinsons sykdom? Mov Disord, 1997, 12(1):17
2. Jenner PG, Brin MF. Levodopa-nevrotoksisitet: eksperimentelle studier versus klinisk relevans.Neurology,1998,50(6 Suppl 6): S39
3. Maruyama W, Naoi M. Celledød ved Parkinsons sykdom. J Neurol, 2002,249 (Suppl 2): II6
4. Chen Jianzong, Jiang Wen, Shi Jian, et al. Klinisk observasjon om behandling av Parkinsons sykdom med lever- og nyrefunksjon: en rapport med 60 tilfeller. Journal of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 1999, 22(3): 14
5. Chen Jianzong, Chen Xiaoli, Li Junchang, etc. Klinisk observasjon av 40 tilfeller av Parkinsons sykdom behandlet med metoden for nærende lever og nyre. Research in Chinese Medicine, 1998, 14(3): 10
6. Chen Jianzong, Jiang Wen, Wu Baron, et al. Pingchan nr. 1 oral væske i behandlingen av 40 tilfeller av Parkinsons sykdom. Journal of Anhui College of Traditional Chinese Medicine, 1999, 18(2): 9
7. Shimoda K, Sauve Y, Marini A, et al. En høy prosentandel av tyrosinhydroksylase-positive celler fra rotte E14 mesencefalisk cellekultur. Brain Res,1992,586 (2):319
8. Wang Xiaowen, Jiang Xiaoyan, Wu Liya Yiming, et al. In vitro-rensing av frie radikaler og beskyttende effekter på OH·indusert DNA-skade forårsaket av de totale glykosidene av cistanche. Chinese Pharmaceutical Journal, 2001, 36(1): 29
9. Sheng G, Pu X, Lei L, et al. Tubuloside B fra Cistanche salsa Redder PC12-nevronalcellene fra 1-Methyl-4-fenylpyridiniumion-indusert apoptose og oksidativ.Stress.Planta Med,2002,68(11):966