Cistanche Deserticola-polysakkarid demper osteoklastogenese og benresorpsjon via hemmende RANKL-signalering og produksjon av reaktive oksygenarter

Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dezhi Song et al

Osteoporose er en metabolsk sykdom preget av osteopeni og mikrostrukturell forringelse av ben. Osteoklaster er de primære effektorcellene som bryter ned benmatrise og deres unormale funksjon fører til utvikling av osteoporose. Akkumulering av reaktive oksygenarter (ROS) under cellulær metabolisme fremmer osteoklastproliferasjon og differensiering, og spiller derfor en viktig rolle i osteoporose.Cistanchedeserticolapolysakkarid(CDP) har antitumor, anti-inflammatorisk og antioksidant aktivitet. Imidlertid er virkningen av CDP på ​​osteoklaster uklar. I denne studien ble tartratresistent sur fosfatasefarging, immunfluorescens, revers transkripsjonspolymerasekjedereaksjon og western blot-analyse brukt for å demonstrere at CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)hemmet osteoklastogenese og hydroksyapatittresorpsjon. I tillegg CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)hemmet også ekspresjonen av osteoklastmarkørgener inkludert Ctsk, Mmp9 og Acp5, og hadde ingen effekt på reseptoraktivator for nukleær faktor κB (RANK) uttrykk. Mekanistiske analyser avslørte at CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)øker ekspresjonen av antioksidantenzymer for å dempe RANKL-mediert ROS-produksjon i osteoklaster og hemmer nukleærfaktoren til aktiverte T-celler og mitogenaktivert proteinkinaseaktivering. Disse resultatene antyder at CDP kan representere et kandidatlegemiddel for behandling av osteoporose forårsaket av overdreven osteoklastaktivitet.

SØKEORDbenresorpsjon,Cistanchedeserticolapolysakkarid, MAPK, osteoklast, reaktive oksygenarter

cistanche kroppsbygging

1|INTRODUKSJON

Balansen mellom beindannelse, mediert av osteoblaster, og benresorpsjon, mediert av osteoklaster, spiller en viktig rolle for å opprettholde benmetabolsk homeostase (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Når benresorpsjonen overstiger bendannelsen, oppstår osteoporose, som er preget av redusert benmasse og benmikrostrukturelle skader (Ikeda, 2008). Osteoporose er en vanlig sykdom hos eldre individer og postmenopausale kvinner, og patogenesen er ikke fullt ut belyst (Cooper & Melton, 1992). Østrogenmangel er en primær årsak til osteoporose (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013). I tillegg kan reaktive oksygenarter (ROS) induseres av reseptoraktivator av kjernefaktor κB-ligand (RANKL) og er assosiert med osteoklastdannelse (Yip et al., 2005), og kan dermed bidra til utvikling av osteoporose (Manolagas, 2010). Noen studier har funnet at Nrf2-antioksidantmangel øker ROS-nivåer og fremmer RANKL-indusert osteoklastdifferensiering (Hyeon, Lee, Yang, & Jeong, 2013). Derfor bør reduksjon av ROS-produksjon under osteoklastdifferensiering vurderes som en terapeutisk strategi for behandling av osteoporose.

Osteoklaster er avledet fra monocytt- eller makrofaghematopoietisk avstamning og er de eneste multinukleære cellene som utfører benresorpsjon (Teitelbaum, 2000). Derfor er forskning som involverer osteoklastdannelse av stor betydning for å utvikle effektive behandlinger for benmetabolismesykdommer (Lorenzo, 2017). Makrofagkolonistimulerende faktor (M‐CSF) og RANKL, produsert av osteoblaster og aktiverte T-celler, er viktige cytokiner som regulerer osteoklastogenese (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL induserer ekspresjonen av nukleær faktor til aktiverte T-celler (NFATc1), som er en kritisk transkripsjonsfaktor som er aktiv under osteoklastdannelse (Ishida et al., 2002). Aktivert NFATc1 fremmer uttrykket av osteoklastmarkørgener som tartratresistent sur fosfatase (TRAcP) og cathepsin K (CTSK) som regulerer osteoklastogenese og osteoklastfunksjon (Balkan et al., 2009; Crotti et al., 2008).

Cistanchedeserticolapolysakkarid(CDP) er isolert fra de kjøttfulle stilkene tilCistancheog har immunregulering, antitumor, antialdring og andre farmakologiske effekter (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)hadde en hemmende effekt på lipopolysakkarid-indusert nitrogenoksid (NO) produksjon i mus mikrogliaceller (BV-2 celler; Nan et al., 2013). I tillegg kommer et fenyletanoid-rikt ekstrakt (ECD) avCistancheforbedret svømmekapasiteten til mus ved å redusere muskelskade, forsinke melkesyreakkumulering og forbedre energilagring (Cai et al., 2010). Imidlertid forblir effekten av CDP på ​​osteoklastfunksjon og aktivitet ukjent.

I denne studien viste vi at CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)hemmer RANKL-indusert osteoklastdifferensiering og benresorpsjon. Den underliggende mekanismen var at CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)forbedrer uttrykket av antioksidantenzymer for å dempe ROS-produksjonen, og undertrykker deretter RANKL-aktivert NFAT og mitogenaktivert proteinkinase (MAPK)-signaleringskaskader. Disse resultatene tyder på at CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)kan brukes til å behandle osteoporose forårsaket av overdreven osteoklastisk benresorpsjon.

maca ginseng cistanche

2|MATERIALER OG METODER

2.1|Materialer

CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)(renhet > 98 prosent) ble kjøpt fra Solarbio (Beijing, Kina) og fremstilt i en stamkonsentrasjon på 1 mM i fosfatbufret saltvann (PBS). Antistoffer er spesifikke for c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, fosforylert (p)-ERK, p-p38, p-JNK og -aktin ble hentet fra julenissen Cruz Biotechnology (San Jose, CA). Antistoffer mot V-ATPase d2 ble produsert som tidligere beskrevet (H. Feng et al., 2009). 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-5- (3-karboksymetoksyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium (MTS) og luciferase-analysesystemet ble hentet fra Promega (Sydney, Australia) . Rekombinant M-CSF ble kjøpt fra R&D Systems (Minneapolis, MN). Rekombinant GST-rRANKL-protein ble uttrykt og renset som tidligere beskrevet (Xu et al., 2000).

2.2|Cellekultur

RAW264.7-celler (musmakrofagceller) ble hentet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket i modifisert minimalt essensielt medium (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Australia) supplert med 10 prosent føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin og 100 ug/ml streptomycin (komplett medium). Benmargsavledede monocytter (BMM) ble isolert fra 6 uker gamle C57BL/6J-mus, som ble avlivet i henhold til prosedyrer godkjent av Animal Ethics Committee ved University of Western Australia (RA/3/100/1244). Lange bein ble dissekert fri for bløtvev og benmargen ble spylt fra lårbenet og tibia, som deretter ble dyrket i et komplett medium i nærvær av M-CSF (50 ng/ml).

2.3|Osteoklastogeneseanalyse

BMM-er ble sådd ut i 96-brønns kulturplater med en tetthet på 6 × 103 celler per brønn og behandlet med et komplett medium inneholdende M-CSF (50 ng/ml) og GST-rRANKL (100 ng/ml), i nærvær av eller fravær av varierende konsentrasjoner av CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>tre kjerner) ble identifisert som osteoklaster.

2.4|Cytotoksisitetsanalyser

BMM-er ble sådd inn i 96-brønners plater med 6 × 103 celler per brønn og fikk stå over natten for å feste seg. Neste dag ble cellene inkubert med varierende konsentrasjoner av CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid). Etter ytterligere 48 timer ble MTS-løsningen (20 ul/brønn) tilsatt og inkubert med celler i 2 timer. Absorbansen ved 490 nm ble bestemt med en mikroplateleser (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2,5|Immunfluorescerende farging

BMM-er ble sådd med en tetthet på 6 × 103 celler per brønn i nærvær av M-CSF (50 ng/ml) over natten. Celler ble deretter stimulert med M-CSF og GST-rRANKL (100 ng/ml) inntil modne osteoklaster ble dannet. Osteoklastene ble deretter behandlet med varierende konsentrasjoner av CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)i 48 timer før fiksering med 4 prosent paraformaldehyd, permeabilisering med 0,1 prosent Triton X-100–PBS, og blokkering med 3 prosent bovint serumalbumin i PBS. Preparerte celler ble inkubert med rhodamin-konjugert falloidin i 45 minutter i mørket for å farge for F-aktin. Celler ble deretter vasket med PBS, kjerner motfarget med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), og montert med dekkglass for konfokal mikroskopi.

cistanche opplevelse

2.6|Hydroksyapatittresorpsjonsanalyse

For å måle osteoklastaktivitet ble BMM-er (1 × 105 celler per brønn) dyrket på seks-brønns kollagenbelagte plater (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) stimulert med GST-rRANKL (100 ng/ml) og M-CSF (50 ng/ ml) til modne osteoklaster ble generert (Zhou et al., 2016). Celler ble deretter forsiktig løsnet fra platen ved bruk av celledissosiasjonsløsning (Sigma-Aldrich) og like antall modne osteoklaster ble sådd på individuelle brønner i hydroksyapatittbelagte 96-brønners plater (Corning Osteoassay, Corning, NY). Modne osteoklaster ble inkubert i et medium som inneholdt GST-rRANKL og M-CSF med eller uten CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)ved de angitte konsentrasjonene. Etter 48 timer ble halvparten av brønnene immunhistokjemisk farget for TRAcP-aktivitet, som beskrevet ovenfor, for å vurdere antall multinukleerte celler per brønn. De gjenværende brønnene ble bleket i 10 minutter for å fjerne celler og tillate måling av de resorberte områdene. Resorberte områder ble fotografert under standard lysmikroskopi og Image J-programvaren (National Institutes of Health, Bethesda, MD) ble brukt til å kvantifisere prosentandelen av hydroksyapatittoverflaten som ble resorbert av osteoklastene.

2.7|Luciferase reporter analyser

For å undersøke NFATc1-transkripsjonell aktivering ble RAW264.7-celler stabilt transfektert med en NFATc1-responsiv luciferase-reporterkonstruksjon (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Transfekterte celler ble dyrket i 48-brønns plater med en tetthet på 1,5 × 105 celler per brønn og forbehandlet med forskjellige konsentrasjoner av CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)i 1 time. Etter forbehandling ble cellene stimulert med GST-rRANKL (100 ng/ml) i 24 timer, og luciferaseaktiviteten ble målt ved å bruke luciferase reporter-analysesystemet i henhold til produsentens protokoll (Promega).

2.8|Kvantitativ revers transkripsjonspolymerasekjedereaksjon (RT-PCR) analyse

Totalt RNA ble isolert fra celler ved bruk av Trizol-reagens i henhold til produsentens protokoll (Thermo Fisher Scientific). Komplementært DNA ble syntetisert ved å bruke Moloney murine leukemivirus revers transkriptase med 1 ug RNA-template og oligo-dT-primere. Polymerasekjedereaksjonsamplifisering av spesifikke sekvenser ble utført ved å bruke følgende program: 94 grader i 5 minutter, etterfulgt av 30 sykluser på 94 grader i 40 s, 60 grader i 40 s og 72 grader i 40 s, og et siste utvidelsestrinn med 5 min ved 72 grader. Den detaljerte informasjonen om spesifikke primere er vist i tabell 1. Relative messenger-RNA-nivåer ble beregnet ved normalisering til ekspresjonen av husholdningsgenet Hmbs.

2.9|Western blot-analyse

BMM-er ble dyrket i komplett medium med M-CSF i seks-brønns plater og stimulert med GST-rRANKL (100 ng/ml) for de angitte tidene. Celler ble lysert i radioimmunutfellingslysebuffer og proteiner ble løst ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese og overført til poly(vinylidenfluorid)-membraner (GE Healthcare, Silverwater, Australia). Membranene ble blokkert i 5 prosent skummet melk i 1 time og deretter undersøkt med ulike spesifikke primære antistoffer med forsiktig risting over natten ved 4 grader. Membraner ble vasket og deretter inkubert med pepperrotperoksidase-konjugerte sekundære antistoffer. Antistoffreaktivitet ble deretter påvist med forbedret kjemiluminescensreagens (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) og visualisert med en Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|Intracellulær ROS-deteksjon

Intracellulære ROS-nivåer ble påvist ved bruk av et 2′,7′‐diklorfluoresceindiacetat cellulært ROS-deteksjonsanalysesett (Abcam, Melbourne, Australia). BMM-er (5 × 103 celler per brønn) ble dyrket i 96-brønners plater og behandlet med RANKL (100 ng/ml), M-CSF (50 ng/ml) og CDP i 72 timer. Intracellulære ROS-nivåer ble målt ved bruk av 2′,7′-diklorfluoresceindiacetat, som oksiderer til fluorescerende DCF i nærvær av ROS. Celler ble vasket i Hanks buffer og inkubert i mørket i 30 minutter med 10 µM DCFH-DA. Bilder ble tatt med konfokalmikroskopi.

2.11|statistiske analyser

Alle data er representative for minst tre eksperimenter utført i tre eksemplarer med mindre annet er angitt. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Enveis variansanalyse etterfulgt av Student–Newman–Keuls post hoc-tester ble brukt for å bestemme betydningen av forskjeller mellom resultatene, med p < 0.05="" ansett="" som="">

3|RESULTATER

3.1|CDP hemmer RANKL-indusert osteoklastogenese og osteoklastfusjon

For å finne ut om CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)kan undertrykke RANKL-indusert osteoklastdannelse, utførte vi først en osteoklastogeneseanalyse ved å bruke muse-BMMer (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). BMM ble behandlet med RANKL og M-CSF i 5 dager med økende konsentrasjoner av CDP. CDP reduserte antallet TRAcP-positive flerkjernede celler når konsentrasjonen av CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)nådd 5 µM eller høyere (figur 1a,b). For å evaluere CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)toksisitet og bekrefte at disse resultatene ikke var en refleksjon av celledød eller antall, utførte vi en MTS-analyse. BMM-er ble behandlet med RANKL og M-CSF i 48 timer med varierende doser av CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid). CDP hadde ingen effekt på BMM-proliferasjon ved en konsentrasjon på 15 µM eller mindre (figur 1c).

For å teste effekten av CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)ved osteoklastfusjon ble osteoklaster indusert med RANKL- og M-CSF-behandling, med eller uten varierende doser av CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid). Osteoklaster ble farget med rhodamin-falloidin og DAPI for å vurdere antall kjerner per osteoklast (Figur 2a). Både osteoklastantall og gjennomsnittlig antall kjerner per osteoklast sank etter CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)behandling (5–10 µM; figur 2b,c). Derfor CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)hadde hemmende effekter på RANKL-indusert osteoklastogenese og osteoklastfusjon på en doseavhengig måte.

3.2|CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)demper RANKL-indusert osteoklastisk hydroksyapatittresorpsjonsaktivitet

En hydroksyapatittresorpsjonsanalyse ble utført for å påvise effekten av CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)på osteoklastfunksjon (Figur 3a). Etter en 24-timers inkubasjon endret ikke antall osteoklaster per brønn seg mens hydroksyapatittresorpsjonsområdet ble signifikant redusert ved behandling med 5 og 10 µM CDP sammenlignet med kontrollgrupper (Figur 3b,c). Disse resultatene viser at CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)har sterk hemmende effekt på både osteoklastdannelse og osteoklastresorpsjonsaktivitet uten noen cellegift.

3.3|CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)hemmer osteoklastmarkørgenuttrykk

For ytterligere å undersøke de hemmende effektene av CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)på osteoklastogenese og osteoklastisk benresorpsjon, ble BMM behandlet med RANKL og M-CSF i 5 dager med varierende konsentrasjoner av CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid). RT-PCR ble deretter utført for å oppdage ekspresjonen av osteoklastmarkørgener. Uttrykket av Nfatc1, en avgjørende transkripsjonsfaktor under osteoklastogenese, ble hemmet av CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)på en doseavhengig måte (Figur 4a). I tillegg CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)(5 og 10 µM) nedregulerte uttrykket av benresorpsjonsrelaterte gener, inkludert Mmp9, Ctsk og Acp5 (Figur 4b–d).

3.4|CDP undertrykker NFATc1-aktivitet og nedstrøms proteinuttrykk

For å undersøke effekten av CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)på RANKL-indusert NFATc1-aktivitet ble det utført en luciferase-reporteranalyse. Behandling med CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid), ved konsentrasjoner på 5 µM og høyere, hemmet signifikant RANKL-indusert NFATc1-aktivitet (figur 5a). I tillegg viste western blot-analyse at CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)signifikant undertrykt proteinekspresjon av NFATc1 og c-Fos i BMM-er behandlet med RANKL og M-CSF i 3 og 5 dager (figur 5b). Dessuten ble uttrykket av osteoklastfunksjonsrelaterte proteiner, som V-ATPase-d2 og CTSK, nedregulert i nærvær av CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)sammenlignet med kontrollgrupper. Imidlertid hadde CDP ingen effekt på RANK-uttrykk (figur 5b).

3,5|CDP fremmer uttrykket av antioksidantenzymer for å fjerne ROS-produksjon under RANKL-indusert osteoklastogenese

For å utforske den underliggende mekanismen for CDP-avhengig osteoklastogenesehemming, ble BMM behandlet med RANKL (100 ng/ml) og M-CSF (50 ng/ml) sammen med PBS eller CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)i 72 timer. Vi undersøkte effekten av CDP på ​​intracellulær ROS-produksjon stimulert av RANKL. Intracellulære ROS-nivåer ble økt ved RANKL-behandling, som ble svekket av CDP (5 og 10 µM; figur 6a). Både antall ROS-positive celler og intensiteten av ROS-farging ble redusert ved CDP-behandling på en doseavhengig måte (Figur 6b, c). Western blot-analyse viste at CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)fremmet uttrykk for tioredoksin (TRX1) og glutationreduktase (GSR) mens de undertrykte uttrykket av induserbar nitrogenoksidsyntase (NOS2) i BMM-er som ble behandlet med RANKL og M-CSF i 3 dager (figur 6d).

For å utforske videre om CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)undertrykte osteoklastdifferensiering ved å redusere ROS-produksjonen, vi behandlet deretter BMM-er med peroksid (10 µM) for å imitere den høye ROS-statusen i celler. BMM-er ble indusert av RANKL og M-CSF i 3 dager, og resultatene av western blot-analyse og RT-PCR viste at peroksid fremmet NFATc1- og c-Fos-ekspresjon sammenlignet med kontrollgruppene. I samsvar med resultatene i figur 5 ble uttrykket av NFATc1 og c-Fos undertrykt av CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)mens peroksid reddet den hemmende effekten av CDP (Figur 6e,f). Disse dataene indikerte at CDP undertrykte uttrykket av NFATc1 og c-Fos ved å fjerne ROS-produksjon.

3.6|CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)undertrykker MAPK-veier under RANKL-indusert osteoklastogenese

Deretter undersøkte vi effekten av CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)behandling på RANKL-mediert TRAF6-ekspresjon og MAPK-veiaktivering. Etter inkubering i serumfritt medium i 2 timer, ble BMM stimulert med RANKL, med eller uten CDP, i 60 minutter. Stimulering med CDP (10 µM) hadde ingen effekt på TRAF6-ekspresjon og svekket fosforylering av JNK2 og ERK1/2 etter 10 og 20 minutter (figur 7). I tillegg ble p38-fosforylering betydelig hemmet av CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)behandling på 60 minutter sammenlignet med kontrollgrupper (figur 7). Disse dataene viser at CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)undertrykker RANKL-induserte MAPK-signalveier, i samsvar med dens hemmende effekt på osteoklastdannelse og aktivitet.

4|DISKUSJON

Cistanche, kjent som "ørkenginseng," har vakt mye oppmerksomhet nylig for sin evne til å modulere immunitet og virke beskyttende under aldring og oksidativt stress (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012). Fenylpropanoid-substituerte glykosider, de viktigste aktive komponentene i Cistanche, har vist seg å hemme NO-aktivitet i makrofager (Ahn, Chae, Chin og Kim, 2017). I tillegg er enCistancheekstrakt redusert oksidativt stress i reperfusert myokard etter iskemi og spilte en betydelig rolle i hemming av apoptotiske veier som fører til kardiobeskyttelse (Yu, Li, & Cao, 2016). Som en viktig komponent i Cistanche, CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)har en rekke farmakologiske funksjoner. Vår nåværende studie fant at CDP undertrykte RANKL-aktivert osteoklastdifferensiering og aktivering ved å dempe ROS-produksjon samt NFAT- og MAPK-aktivering.

Som en sur fosfatase finnes TRAcP i en rekke celler og er rikelig i osteoklaster og alveolære makrofager (Snipes, Lam, Dodd, Gray, & Cohen, 1986). TRAcP er et karakteristisk enzym for osteoklaster og dets uttrykk er nært knyttet til osteoklastfunksjon, sett på som en indikator på osteoklastaktivitet og benresorpsjon (Minkin, 1982). I vår studie, CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)hemmet antall TRAcP-positive celler, noe som indikerer at RANKL-indusert osteoklastogenese ble blokkert av CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid). Nedbrytning av benmatrise av osteoklaster avhenger av cathepsin K (CTSK) og MMPs (Gruber, 2015). Her nedregulerte CDP uttrykket av funksjonelle osteoklastgener som Mmp9, Ctsk og Acp5 betydelig.

Osteoklastdifferensiering og funksjon reguleres av flere signalveier (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). Etter binding til RANK, rekrutterer RANKL adapterprotein TRAF6 for å aktivere ekspresjonen av NFATc1, som er en viktig transkripsjonsfaktor for osteoklastdannelse, som påvirker osteoklastspesifikk genuttrykk, inkludert TRAcP og CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). I denne studien fant vi at CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)hadde ingen effekt på RANK og TRAF6 uttrykk i osteoklaster. Imidlertid CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)hemmet RANKL-indusert NFATc1-aktivering under osteoklastogenese av BMM. Dessuten ble det demonstrert at ROS, produsert av mitokondrier i prosessen med å levere elektroner, fremmet spredning og differensiering av osteoklaster og regulerte benmatrisenedbrytning (Ha et al., 2004). En fersk studie fant at RANKL induserte Bach1 kjernefysisk import og svekket Nrf2-mediert antioksidant enzymproduksjon, og derved forsterket intracellulær ROS-ekspresjon og osteoklastogenese hos mus (Kanzaki et al., 2017). I tillegg forbedret økt intracellulær ROS-generering av homocystein osteoklastdannelse og aktivitet (Koh et al., 2006). Vår studie fant at CDP reduserte ROS-akkumulering i osteoklaster ved å hemme NOS2-ekspresjon og fremme uttrykket av antioksidantenzymer, som TRX1 og glutationreduktase. Da vi behandlet BMM-er med peroksid for å forbedre intracellulær ROS-akkumulering, avslørte resultatene som økte ROS kunne forbedre NFATc1-uttrykk at ROS var oppstrøms for NFATc1. Vi fant også at peroksid reddet den hemmende effekten av CDP på ​​NFATc1-ekspresjon. Så dataene våre antyder at CDP undertrykker ROS-akkumulering for å hemme NFATc1-uttrykk, for deretter å undertrykke osteoklastdannelse og funksjon.

ERK, JNK og p38 tilhører MAPK-familien, som også er involvert i reguleringen av osteoklastdifferensiering (Seger & Krebs, 1995). RANKL aktiverer MAPK-veien ved å øke fosforyleringen av ERK, JNK og p38 (Mizukami et al., 2002). Vi demonstrerte at CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)undertrykte den RANKL-medierte fosforyleringen av nøkkelproteiner i MAPK-veien, og bidro derved til den hemmende effekten av CDP på ​​ekspresjonen av osteoklastmarkørgener. Så vidt vi vet, er dette den første studien som viser de hemmende effektene av CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)på ROS-produksjon, NFAT og MAPK-aktivering, som representerer nye virkningsmekanismer for CDP in vitro.

Oppsummert viste vi at CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)svekker osteoklastogenese og hydroksyapatittresorpsjon, og uttrykket av osteoklastmarkørgener inkludert Ctsk, Mmp9 og Acp5. CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)var i stand til å undertrykke RANKL-mediert ROS-produksjon, samt NFAT- og MAPK-aktivering (Figur 8). Samlet antyder resultatene våre at CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)kan representere et kandidatlegemiddel for behandling av osteoklastrelaterte tilstander ledsaget av ROS-overproduksjon.

FIGUR 8 Skjematisk diagram av CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)funksjon i osteoklastdifferensiering. CDP(Cistanchedeserticolapolysakkarid)undertrykker RANKL-indusert ROS-produksjon, så vel som NFATc1- og MAPK-aktivering, og hemmer dermed osteoklastogenese. CDP,Cistanchedeserticolapolysakkarid; MAPK, mitogenaktivert proteinkinase; NFATc1, nukleær faktor av aktivert T-celle; RANKL, reseptoraktivator for nukleær faktor κB ligand; ROS, reaktive oksygenarter [Fargefigur kan sees på wileyonlinelibrary.com]

TAKK

Denne studien ble støttet av Nature Science Foundation of China (81572164), National Key Technology Research and Development Program of China (2017YFC1103300), Natural Science Foundation of Guangxi Province (2016GXNSFAA380295), og University Science and Technology Research Project i Guangxi Provins (KY2015YB054). Det støttes også delvis av Guangxi Scientific Research and Technology Development Plan Project (GKG13349003, 1598013‐15), Western Australia Medical & Health Research Infrastructure Fund, Arthritis Australia Foundation, University of Western Australia (UWA) Research Collaboration Awards, og Australian Health and Medical Research Council (NHMRC, nr. 1107828 og 1027932).

INTERESSEKONFLIKTER

Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikter

Fra: 'Cistanchedeserticolapolysakkariddemper osteoklastogenese og benresorpsjon via inhibering av RANKL-signalering og produksjon av reaktive oksygenarter av Dezhi Song et al.

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674–9684