Cistanche Deserticola-polysakkarider demper diabetisk nefropati hos mus ved å påvirke tarmfloraen og hemme den bompenger-lignende reseptoren 4/atomfaktor-κB signalvei

ABSTRAKT: Målet med denne studien var å undersøke den forbedrede effekten ogPotensiell mekanisme for Cistanche Deserticola Polysaccharides (CDPs)påDiabetisk nefropati (DN)hos mus. DN -musemodellen ble etablert ved høy fett diett (HFD) fôring kombinert med en intraperitoneal injeksjon av streptozotocin (STZ). Trettiseks C57BL/6N hannmus ble tilfeldig delt inn i seks grupper (n=6 hver). Alle grupper ble oralt administrert med destillert vann (kontroll og modell), dapagliflozin eller CDP i 4 uker. Endringer i fysiologiske indekser, nyrefunksjon,inflammatoriske faktorerog tarmmikrobiota ble vurdert. Resultatene viste at CDPs forbedret den generelle tilstanden betydelig og dempetRenal histopatologiske endringer, ogreduserte nivåene av blodsukker, urinproteinoginflammatoriske faktorerI DN mus. I tillegg påvirket CDP -er balansen mellom tarmmikrobiota, økte forekomsten av gunstige bakterier og reduserte potensielle patogene bakterier, som igjen forbedret tarmbarrierefunksjonen. CDP-er hemmet også aktiveringen av den bompenger-lignende reseptoren 4/kjernefaktor-KB (TLR4/NF-KB) signalvei og reduserte frigjøring av lipopolysaccharide (LPS). Avslutningsvis viser CDP -er en forbedring av DN hos mus ved å påvirke tarmmikrobiota og hemme inflammatoriske signalveier. Dette funnet gir ny innsikt i behandlingen av DN.

 

Nøkkelord: Cistanche Deserticola Polysaccharides;Diabetisk nefropati; tarmbarriere; tarmflora; Bompengelignende reseptor 4; Nuclear Factor-κB

 

Cistanche Deserticola-ekstrakt med råvarer av høy kvalitet

Klikk for å få flere detaljer

 

 

 

Diabetes nefropati (DN)er den ledende årsaken til nyresykdom i sluttstadiet og truer alvorlig livet og helsen til pasienter [1]. Studier har bekreftet at tarmflora -ubalanse spiller en viktig patogen rolle i prosessen med diabetes som utvikler seg til DN [2-3]. Teorien "Gut-Kidney Axis" mener at endringer i tarmmikro-miljøet kan påvirke progresjonen av kronisk nyresykdom ved å direkte regulere metabolittene til tarmfloraen [2-3]. Tarmfloraen spiller en viktig rolle i å regulere nyrefunksjonen i DN musemodeller [4-5]. Dybdeforskning på "Gut-Kidney Axis" vil bidra til å tydeliggjøre patogenesen til DN og oppdage nye mål for forebygging og behandling.
Cistanche Deserticola er en tradisjonell medisinsk og spiselig plante, også kjent som Cistanche Deserticola, Dijing, Jinsun, etc., ofte kjent som Dayun, og har omdømmet til "Desert Ginseng" [6]. I følge Pharmacopoeia fra Folkerepublikken Kina, er Cistanche Deserticola den tørkede kjøttfulle stilken med skjellete blader av Cistanche Deserticola YC Ma eller C. Tubulosa (Schenk) Wight, en plante av slekten Cistanche i familien Orobanchaceae.
Blant dem har Cistanche Deserticola en lang historie med å bli brukt som både medisin og mat. Cistanche Deserticola er søt, salt og varm i naturen og kommer inn i nyren og tykktarmen meridianer. Det har effekten av å tonifisere nyre yang, dra nytte av essens og blod, og fukte tarmen og lindre forstoppelse [7-8]. Polysakkarider er en av de viktigste aktive ingrediensene i Cistanche Deserticola. Innholdet av polysakkarider i Cistanche Deserticola vannekstrakt er relativt høyt. Det er hovedsakelig sammensatt av monosakkarider som glukose, galaktose, rhamnose, arabinose og fruktose. Det har mange farmakologiske effekter som å regulere immunaktivitet, anti-aldring, forbedre læring og hukommelse, beskytte nerver, motstå leverskade, antivirus og antitumor [9-12]. Tidligere studier fra forskningsgruppen har vist at Cistanche Deserticola vannekstrakt har en potensiell terapeutisk effekt på DN [13]. Basert på dette tok dette eksperimentet tarmflora og inflammatorisk respons som utgangspunkt for å studere effekten av cistanche ørkenicola -polysakkarider (CDPs) på å forbedre DN hos mus og gjenopprette nyrefunksjon, for å gi et vitenskapelig grunnlag for rollen som CDPs i å behandle DN.

1 materialer og metoder

1.1 dyr, materialer og reagenser

36 6- uk gamle C57BL/6J hannmus ble kjøpt fra Animal Experiment Center of Xinjiang Medical University, Animal Production License No.: SCXK (Xin) 2023-0006; Ethics Resolution No.: Iacuc -20210331-04.
Desert CDPS (Polysaccharide Massfraksjon ＞ 80%, batchnummer: 2306019) Shaanxi Xintianyu Company; Dapagliflozin (DAPA; Batch Number: 2108119) AstraZeneca Pharmaceuticals Co., Ltd.; Urin totalt protein (urin totalt protein, UTP; batchnummer: c 035-2-1), urea nitrogen (blod urea nitrogen, bun; batchnummer: c 013-2-1), kreatinin (kreatinin, kref. C 012-2-1) Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute; lipopolysaccharide (LPS; batchnummer: yx -121619 m), interleukin -6 (il -6; batchnummer: yx-e20012), il -1 (batch-nummer: yx-e2033), transform YX-E20217), tumor nekrose faktor- (TNF-; batchnummer: YX-E20220) Kit Shanghai Youxuan Biological Co., Ltd.; Enhanced Chemiluminescene (ECL) Kit Beijing Pulilai Gene Technology Co., Ltd.; Streptozotocin (STZ; batchnummer: 20230503), fettfattig kosthold (60% fettforhold Høyt fettdiett Renset type, materialnummer: Boaigang12492m) Beijing Boaigang Biotechnology Co., Ltd.
Grunnfôret (som inneholder 22% maismel, 12% kli, 18% oljerest, 8% fiskemel, 12% soyabønne måltid, 0. 17% salt, 0. 25% vitaminer, 0. 25% sporstoff, {0. 33. Xinjiang Medical University.

 

1.2 Instrumenter og utstyr

AE240 Analytical Balance, Mettler-Toledo Instrument Co., Ltd., Sveits; DHG -9053 En elektrisk oppvarmingstørkingsovn, Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.; DK-S22 Konstant temperaturvannbad, Shanghai Jinghong Experimental Instrument Co., Ltd.; 3-18 ks høyhastighets lavtemperatur sentrifuge, Sigmaaldrich, USA; BS -380 Helt automatisk biokjemisk analysator, Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd.; EM KMR3 Slicer, HI1220 Slicer, Leitz Optilux Digital Microscope, Leica, Tyskland; Fluorchem E Chemiluminescens Imaging System, Proteinsimple, USA.

1.3 Metoder

1.3.1 Dyreeksperiment

36 C57BL/6J hannmus ble matet i SPF -laboratoriet til Xinjiang Medical University og matet fritt. Eksperimentet ble utført etter 7 dager med adaptiv fôring. Seks mus ble tilfeldig valgt som den normale (kontroll) gruppen og gitt et grunnleggende kosthold. Resten av eksperimentgruppene fikk et fettfattig kosthold og holdt i separate bur. Kroppsvekten ble testet en gang i uken. Musene var fri til å spise og drikke vann. Etter 6 ukers fôring med høyt fett, ble de eksperimentelle gruppemusene injisert med STZ 4 0 mg/kg intraperitonealt i 5 påfølgende dager i tillegg til gratis fettfattig kosthold hver dag. Den fastende blodsukkeret etter modellering var 11,1 mmol/L, som ble ansett som en vellykket modell av diabetes. Tretti mus med vellykket modellering ble tilfeldig delt inn i fem grupper, med seks mus i hver gruppe, nemlig modellen (destillert vann + fettfattig kosthold, modell) gruppe, DAPA (DAPA 4 mg/kg + 100 mg kosthold, DAPA), CDPs lavdose (50 mg/kg + high-fat, CDPS-L) gruppe CDPS-M) gruppe, og CDPS høydose (200 mg/kg + høy fett-kosthold, CDPS-H) gruppe. Kontrollgruppen (destillert vann + normalt kosthold) fikk en like stor mengde destillert vann. Hver mus ble gitt til 0,1 ml/10 g, en gang om dagen på samme tid, i totalt 4 uker. Kroppsvekten og blodsukkerendringene til musene ble registrert ukentlig.

1.3.2 Indeksbestemmelse

Etter 4 ukers sondeadministrasjon ble urinprøver (24 timer) og fersk avføring samlet gjennom metabolske bur på slutten av den fjerde uken og lagret ved henholdsvis -20 grad og -80} grad. Musene ble faste, men ikke vannet i 12 timer. Dagen etter ble musens fastende kroppsvekt målt. Musene ble bedøvd ved intraperitoneal injeksjon av 3 ml/kg 10% klorhydratoppløsning. Blod ble samlet fra banene og sentrifugert i en sentrifuge (4 grader, 3 500 r/min) i 15 minutter. Supernatanten ble aspirert, pakket og lagret i en -80 graders kjøleskap for senere bruk. Serumet ble målt for BUN, CRE, UA, IL -6, il -1, tgf-, tnf- og LPS i henhold til settet. Urinen ble målt i 24 timer UTP i henhold til settet.

 

1.3.3 Morfologisk og patologisk observasjon av nyre og tarm

1.3.3.1 Bestemmelse av nyrekoeffisienten

Etter blodinnsamling ble mus bedøvd i hjel ved overdose, og nyrene og kolonene ble fullstendig fjernet og skyllet umiddelbart med forhåndkjølt saltvann, tappet på filterpapir og veid. Nyrekoeffisienten ble beregnet i henhold til følgende formel: nyrekoeffisient/%= × 100 M1M, hvor M1 er den våte vekten til nyre/g; m er kroppsvekten til mus/g.

 

1.3.3.2 Patologisk observasjon av nyre

Mus nyrer ble fikset i 4% paraformaldehydfiksativ, dehydrert av etanoloppløsningsgradient, transparentisert med xylen, innebygd i parafin, skivet (tykkelse 2 μm), deretter farget av xylen, og hydrert av etanoloppløsning, og deretter farget med hematox og hydrert av etanoloppløsning og hydrert av etanoloppløsning, og hydrert av ethanin (hydrert av ethol-løsning, og hydrert av etanoloppløsning, og hydrert av etanoloppløsning, og hydrert av etanoloppløsning, og hydrert av etanoloppløsning, og hydrert av etanoloppløsning, og hydrert av etanoloppløsning, og hydrert av etanoloppløsning. (PAS), forseglet og bilder ble samlet og observert under et mikroskop.

 

1.3.3.3 Patologisk observasjon

Musens tarm ble fikset med 4% paraformaldehydfiksativ, dehydrert med etanoloppløsningsgradient, transparentisert med xylen, innebygd i parafin, skiver (tykkelse 2 μm), deretter avduket under aylen, og hydrert med etanolgradien, farget med H og E-alc alc alc alc alc alc alc-blått (hydrert med ethan (tykke 2 μm), ble det falt med xylen og hydrert med ethan-blå (tykkelse. Mikroskop for observasjon.

 

 

1.3.4 Analyse av tarmflorasammensetning

Koloninnholdet til mus i kontrollgruppen, modellgruppen og CDPS-H-gruppen ble påvist ved 16S rRNA-genhøyt gjennomstrømningssekvensering. DNA -ekstraksjon og bibliotekskonstruksjon og sekvensering av mikroorganismer i koloninnholdet ble fullført av Lianchuan Biotechnology Co., Ltd., og de oppnådde data ble analysert på Lianchuan Cloud -plattformen.

 

1.3.5 Deteksjon av nyre- og tykktarmsrelatert proteinuttrykk

Musens nyre- og tykktarmsvevsproteiner ble ekstrahert, og proteinet ble kvantifisert av bicinchoninic acid -proteinkvantifiseringsmetoden. Etter protein denaturering ble proteinet lagret i en -20 graders kjøleskap. 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese, polyvinyliden-difluoridmembranoverføring, membranen ble plassert i en Tris-buffert saltoppløsning med Tween -20 (TBST) inkubasjonstank og blokkert ved romtemperatur. Oppdagelse
De primære antistoffene mot bompenger-lignende reseptorer (TLR) 4, nukleær transkripsjonsfaktor (NF) -BB p65, p-NF-κBP65 og -aktin i nyrevev (antistoff fortynnet 1: 2 000 (V/V) med tbst-løsning) og okkulin og zon}}} (ZO -1) i tykktarmsvev (antistoff fortynnet 1: 1 000 (v/v) med TBST -løsning) ble inkubert ved 4 grader over natten. TBST -fortynning, sekundært antistoff (antistoff
Fortynnet med TBST -løsning 1∶ 2 000 (v/v)), inkubert ved romtemperatur i 1 time, vasket med TBST 3 ganger, og deretter påvist ved tilsetning av ECL -luminescerende reagens, og gelavbildning ble brukt til å oppdage proteinuttrykk. -Actin ble brukt som en intern referanse, og den proteingrå verdien ble analysert ved ImageJ -programvare. Proteinuttrykket til hver gruppe ble uttrykt som den relative verdien av den grå verdien av kontrollgruppen.

 

1.4 Datastatistikk

Alle dataresultater ble uttrykt som ± s, og SPSS 21. 0 ble brukt til statistisk analyse. For kontinuerlige data, hvis de fulgte en normalfordeling, ble enveis variansanalyse brukt til sammenligning mellom grupper. Hvis forskjellen mellom gruppene var statistisk signifikant, ble kalkunmetoden videre brukt for parvis sammenligning; Hvis dataene fulgte en normalfordeling, ble Kruskal-Wallis H-testen brukt til sammenligning mellom grupper. Når det var en statistisk forskjell mellom gruppene, ble Durbins minst signifikante forskjellsmetode videre brukt for flere sammenligninger. P <0. 05 indikerte at forskjellen var statistisk signifikant.

 

 

2 resultater og analyse

2.1 Effekt av CDPs på blodsukker, kroppsvekt og nyrekoeffisient av C57BL/6J

Som det fremgår av tabell 1 til 3, sammenlignet med kontrollgruppen, ble den fastende blodsukkeret til mus i modellgruppen betydelig økt (P<0.01), and the kidney coefficient was significantly increased (P<0.01); compared with the Model group, CDPs- The body weight of mice in group H increased significantly after 4 weeks of administration (P＜0.05), and blood sugar began to decrease after 3 weeks of administration (P＜0.05). The kidney coefficient of mice in each intervention group decreased, and the CDPs-H group was the lowest (P<0.01); the body weight of mice in the Control group was larger than that of each group, indicating that CDPs can slow down the swelling of the kidneys of DN mice, thereby Reduce the kidney coefficient.

 

Tabell 1 Effekter av CDPs på blodsukker av mus (n=6)

Gruppe	Tid/uke
	0	1	2	3	4
Kontroll	7.98±0.55	7.32±0.40	7.58±0.50	7.38±0.87	7.28±0.34
Modell	10.62±2.79#	20.32±2.69#	24.47±4.18#	24.92±3.98#	20.33±2.96#
CDPS-L	16.03±2.97	21.83±4.81	20.13±6.97	23.30±3.77	21.25±1.65
CDPS-M	13.17±3.59	22.6±5.88	19.35±4.45	22.6±4.87	18.38±1.20
CDPS-H	11.07±1.74	21.53±3.71	21.57±6.19	17.43±2.05**	15.87±0.90**
Dapa	10.28±4.75	21.12±4.96	17.72±2.00**	17.35±2.00**	14.55±1.06**

Enhet: MMOL/L.

 

Tabell 2 Effekter av CDPs på nyreindeks over mus (n=6)

 

Gruppe	Kontroll	Modell	CDPS-L	CDPS-M	CDPS-H	Dapa
Nyre/kroppsvekt %	0.98±0.04	1.69±0.17##	1.42±0.12	1.37±0.10*	1.28±0.10**	1.18±0.10**

 

Tabell 3 Effekter av CDPs på kroppsmasse av mus (n=6)

 

Gruppe	Tid/uke
	0	1	2	3	4
Kontroll	28.57±0.82	28.75±0.97	28.70±0.79	29.10±1.24	29.32±1.35
Modell	24.53±1.25##	24.92±1.20##	24.35±1.39##	24.82±1.22##	24.73±1.56##
CDPS-L	25.75±0.69	24.77±0.91	24.83±0.99	25.10±0.83	25.42±0.97
CDPS-M	25.10±0.56	25.00±0.54	24.68±0.48	25.13±0.62	25.25±0.58
CDPS-H	25.38±0.28	25.43±0.49	25.52±0.62	25.73±0.50	26.08±0.34*
Dapa	25.13±1.02	25.52±0.98	25.97±1.00*	26.25±0.63*	26.63±0.78*

 

 

2.2 Effekt av CDPs på nyrefunksjonen til C57BL/6J mus

Som vist i tabell 4, sammenlignet med kontrollgruppen, ble konsentrasjonen av BUN, CRE og UA i serum og 24 timer<0.01); compared with the Model group, CDPs-M and CDPs-H can significantly reduce the concentrations of BUN, Cre, and UA in serum and the 24-hour UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01). CDPs-L can significantly reduce the concentrations of BUN and UA in mouse serum. and 24 h UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01).

 

Tabell 4 Effekter av CDPs på BUN, CRE, UA og 24 H UTP i DN -mus (n=6)

Gruppe	BUN -konsentrasjon (mmol/l)	CRE -konsentrasjon (μmol/L)	24H UTP -innholdskonsentrasjon (mg/ml)	UA -konsentrasjon (μmmol/l)
Kontroll	47.51±7.32	12.80±1.36	1.32±0.12	103.9±18.59
Modell	157.97±30.57##	44.85±4.36##	2.38±0.37##	500.43±81.06##
CDPS-L	112.70±16.76*	40.72±3.62	1.37±0.12**	264.07±14.85**
CDPS-M	82.31±14.68**	35.37±6.21*	1.06±0.17**	247.62±11.22**
CDPS-H	64.58±8.64**	30.00±2.87**	0.65±0.17**	222.71±37.52**
Dapa	76.98±10.47**	28.82±3.72**	0.37±0.10**	129.87±17.69**

 

 

2.3 Effekt av CDPs på inflammatoriske faktorer og LPS -massekonsentrasjon i serum av C57BL/6J mus

 

Som vist i tabell 5, sammenlignet med kontrollgruppen, ble serumnivåene av TNF-, IL -1, IL -6, TGF- og LPS i musene i modellgruppen betydelig økt (P<0.01); compared with the Model group, Each dose of CDPs can reduce the levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, TGF-β and LPS in serum, CDPs-M
Effekten av CDPS-H-gruppen var betydelig (P ＜ 0. 0 5 eller P ＜ 0. 01), og effekten av CDPS-H-gruppen var betydelig (P ＜ 0,01).

Tabell 5 Effekter av CDPs på inflammatoriske faktorer og LPS hos mus (n=6)

 

Gruppe	Massekonsentrasjon (Pg/ml)
	Tnf-	Il -1	Il -6	Tgf-	LPS
Kontroll	111.23±5.47	125.85±11.41	112.27±10.28	152.25±7.28	116.17±15.07
Modell	167.90±16.91##	184.53±21.03##	195.57±31.88##	209.36±16.17##	173.51±15.72##
CDPS-L	144.57±10.15*	160.46±11.84*	169.10±20.32	189.03±8.02*	151.41±9.40*
CDPS-M	133.62±13.24**	154.30±17.39*	150.47±19.28*	171.25±14.35**	135.33±23.92**
CDPS-H	119.30±7.31**	140.54±16.11**	127.12±10.94**	169.47±10.57**	124.98±16.38**
Dapa	114.79±10.48**	135.17±14.37**	120.90±9.32**	159.11±10.92**	113.34±13.14**

 

 

2.4 Effekt av CDPs på renal patologi av C57BL/6J mus

Som vist i figur 1, etter H & E -farging, ble det funnet at musens glomerulære struktur og morfologi i kontrollgruppen var normal og tydelig, kjellermembranen var glatt, den glomerulære morfologien var regelmessig, nyrenes interstitium var normal, renal tubuli var ryddig anordnet, og det var ingen inflammatorisk celle -infiltrasjon. Sammenlignet med kontrollgruppen ble musens glomerulære volum i modellgruppen forstørret, kjellermembranen ble tyknet, inflammatoriske celler ble infiltrert rundt den, og renale tubuli ble forstyrret og utvidet; Sammenlignet med modellgruppen hadde CDPS -administrasjonsgruppene forskjellige forbedringsgrader på musens nyrer. Det glomerulære volumet av musene i CDPS-M- og CDPS-H-gruppene ble betydelig redusert, kjellermembrantykkelsen ble redusert, bare en liten mengde inflammatoriske celler ble infiltrert, og nyretubuli utvunnet betydelig og var tett anordnet. Etter 4 ukers CDPS -intervensjon ble de ovennevnte patologiske forhold alle gjenopprettet i ulik grad.

Massonfarging viste at musens nyretubuli i kontrollgruppen ble arrangert normalt og glomeruli var i normal form, ingen spredning av kollagenfiber ble observert, og rørformede kjellermembraner var synlige; En stor mengde farget kollagen ble observert i renal interstitiell vev hos musene i modellgruppen, og det interstitielle fibrøse vevet ble bundet og retikulært spredt; Det glomerulære volumet av musene i CDPS-M-gruppen ble redusert, og symptomene på fibrøs vevspredning ble lindret; Nyretubuli av musene i CDPS-H-gruppen ble ordnet mer regelmessig, og en liten mengde kollagenfiberproliferasjon ble observert.

PAS -fargingsresultater viste at musens glomeruli i kontrollgruppen var normal i volum og intakt i strukturen; Musene i modellgruppen hadde nyreskader, det glomerulære volumet var større enn normalt og formen var uregelmessig, og mesangialmatrise ble avsatt; Sammenlignet med modellgruppen ble nyreskadene til musene i hver medikamentbehandlet gruppe lindret, og med økningen av dosen ble den glomerulære formen og størrelsen en tendens til å være normal, og graden av mesangial matriksavsetning ble redusert. Resultatene antyder at CDP -er kan lindre skader på nyrevev hos DN -mus.

 

Fig. 1 Effekt av CDPs på renal histopatologiske endringer i DN -mus som undersøkt av H&E, Masson og PAS -farging (× 400)