UPLC-Q-Orbitrap HRMer kombinert med molekylær dokking for å undersøke materielt grunnlag av bitter smak og smak-effekt-forhold i Cistanchia Desertica ⅱ
Dec 18, 2024
2 metoder og resultater
2.1 Identifisering av Cistanche Deserticola -stoffer
2.1.1 UPLC-Q-Orbitrap HRMS Deteksjonsbetingelser Kromatografiske forhold:
Phenomenex Kinetex C18 -kolonne (2,1 mm × 1 0 0 mm, 2,6 μm); Mobil fase A (vandig fase, som inneholder 0,1% eddiksyre), B (isopropanol-acetonitril 1: 1), gradienteluering (0-1 min, 1% b; 1-8, 1% {{15} 99% -1% B; strømningshastighet 0,2 ml · min -1; kolonnetemperatur 30 grader; Injeksjonsvolum 2 μl.
Massespektrometriforhold: Orbitrap Exploris 120 massespektrometer ble brukt til å samle inn primære og sekundære massespektrometri -data under kontroll av programvare (Thermo Scientific Xcalibur -programvare, versjon: 4.4). Sprøytespenningen var 3,8 kV (positiv) eller -3. 4 kV (negativ), ionekildetemperaturen var 320 grader, skjoldgassstrømningshastigheten var 50 ARB, hjelpegassstrømningshastigheten var 15 ARB, og ionoverføringsrørstemperaturen var 320 grader. Skanningsmodus var full skanning/dataavhengig sekundær skanning (full MS/DD-MS2), den primære oppløsningen var 60 000, den sekundære oppløsningen var 15 000, ion-skanningsområdet var m/z100 ~ 1 500, og kollisjonsenergien gradienten var 20, 30, 40.
Cistanche-materialer av høy kvalitet med høyereEchinacoside, verbascoside, tubuloside A, isoverbaceous glykosid
2.1.2 Utarbeidelse av referanseløsning
Veie passende beløp påEchinacoside, verbascoside, tubuloside A, isoverbaceous glykosid, Gentianoside og geniposidreferansestoffer, tilsett 50% metanol for å lage en blandet referanseløsning med en massekonsentrasjon på 500 ng · ml -1, rist godt og få.
2.1.3 Utarbeidelse av testløsning
Vei 1. 0 g prøvepulver (M1) samlet om våren og 1. 0 g prøvepulver (M5) samlet i høsten, tilsett ekstraktløsning (metanol-vann 4: 1), sug helt, deretter ultrasonikat ved 250 W og 35 kHz for 1 H ved rommetemperatur, deretter ultrasonikat ved 250 W og 35 kHz for 1 H ved rommetemperatur, deretter ultrasonikat ved 250 W og 35 kHz for 1 H ved rommet temperaturen, så ultrasonikat ved 250 W og 35 kHz for 1 H ved rommet for 1 h. r · min -1 i 10 minutter, og filtrer for å få alkoholekstrakt av cistanche ørkenicola.
2.1.4 Identifisering av stoffer
Ved å sammenligne den primære og sekundære massespektrometri informasjonsdata for hver Cistanche Deserticola -prøve, og kombinere med relevant litteratur og referansematerialer, ble det identifisert at forskjellige prøver av Cistanche Deserticola inneholder 69 kjemiske komponenter i felles, se tabell 2, og det totale ionestrømningsdiagrammet av cistanche ørkenkola er vist i figur 2.
Tabell 2 Bestanddeler av Cistanche Deserticola-ekstrakter identifisert basert på UPLC-Q-Orbitrap HRM
| Ingen. | Forbindelse | Molekylær formel | Målt verdi (m/z) | Feil (× 10⁻⁶) | Ionemodus | Fragmentioner | Type |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0.02 | Isomenthone | C₁₀H₁₈O | 223.06 | -8.7 | [M + H]⁺ | 223.06, 207.02, 137.02 | Monoterpenoider |
| 0.57 | Uracil | C₄H₄N₂O₂ | 157.04 | 1.8 | [M + H]⁺ | 157.03, 59.02, 49.01 | Annen |
| 0.67 | Glukosamin | C₆h₁₃no₅ | 195.05 | 1.1 | [M + H]⁺ | 75.01, 195.05, 59.01 | Karbohydrater |
| 0.68 | Galaktosamin | C₆h₁₃no₅ | 181.07 | 1.1 | [M + H]⁺ | 181.07, 71.01, 89.02 | Karbohydrater |
| 0.81 | Kaprylsyre | C₈H₁₆O₂ | 144.11 | 1.0 | [M + H]⁺ | 104.11, 103.08, 87.03 | Annen |
| 0.83 | L - asparaginsyre | C₄h₇no₄ | 132.03 | 0.7 | [M + H]⁺ | 132.03, 115.00, 71.01 | Aminosyrer |
| 0.97 | Etylacetat | C₄H₈O₂ | 198.19 | 1.4 | [M + H]⁺ | 197.02, 54.02, 153.02 | Annen |
| 0.98 | Endsyre | C₄H₆O₅ | 155.00 | 0.0 | [M + H]⁺ | 111.00, 49.00, 68.99 | Organiske syrer |
| 0.99 | D - Galaktose | C₆H₁₂O₆ | 180.16 | 1.1 | [M + H]⁺ | 179.06, 89.02, 59.01 | Karbohydrater |
| 1.00 | L - glutaminsyre | C₅h₉no₄ | 188.09 | -0.4 | [M + H]⁺ | 118.09, 119.09, 72.08 | Aminosyrer |
| 1.01 | L - isoleucin | C₆h₁₃no₂ | 132.10 | -0.9 | [M + H]⁺ | 132.10, 86.03, 115.07 | Aminosyrer |
| 1.05 | Glycin | C₂h₅no₂ | 182.08 | -0.9 | [M + H]⁺ | 182.08, 95.04, 29.03 | Aminosyrer |
| 1.48 | Uridin | C₉H₁₂N₂O₆ | 243.06 | 0.3 | [M + H]⁺ | 243.06, 103.01, 102.10 | Nukleosider |
| 1.93 | Metyl d - jodid | C₂H₅I | 131.03 | 0.0 | [M + H]⁺ | 131.03, 59.00, 41.01 | Annen |
| 2.29 | Naringin | C₂₇H₃₂O₁₄ | 345.12 | 3.2 | [M + H]⁺ | 345.12, 327.11, 147.05 | Flavonoider |
| 3.29 | Protocatechuic acid | C₇H₆O₄ | 153.02 | 1.1 | [M + H]⁺ | 153.02, 109.02, 41.00 | Fenolsyrer |
| 3.46 | Triacontanol | C₃₀H₆₂O | 445.10 | 2.7 | [M + H]⁺ | 445.10, 271.08, 101.00 | Alkanoler |
| 3.47 | Kaempferol - 3 - o - glukosid | C₂₁H₂₀O₁₁ | 373.11 | 2.3 | [M + H]⁺ | 123.01, 149.06, 167.07 | Flavonoider |
| 3.48 | Quercetin | C₁₅H₁₀O₇ | 109.03 | 0.6 | [M + H]⁺ | 109.03, 79.05, 77.03 | Flavonoider |
| 3.66 | Klorogensyre | C₁₆H₁₈O₉ | 375.09 | -0.7 | [M + H]⁺ | 375.11, 359.07, 309.03 | Fenolsyrer |
| 3.70 | Kanelsyre | C₉H₈O₂ | 347.13 | 4.1 | [M + H]⁺ | 347.13, 181.09, 113.07 | Fenolsyrer |
| 3.74 | 8 - epigallocatechin - 3 - Gallate | C₂₂H₁₈O₁₁ | 315.37 | 13.6 | [M + H]⁺ | 315.37, 136.05, 103.04 | Flavonoider |
| 3.76 | Limonen | C₁₀H₁₆ | 163.04 | 0.2 | [M + H]⁺ | 163.04, 93.07, 62.03 | Monoterpenoider |
| 3.77 | Hesperidin | C₂₈H₃₄O₁₅ | 299.11 | -1.9 | [M + H]⁺ | 299.11, 181.08, 101.04 | Flavonoider |
| 3.91 | Vanillin | C₈H₈O₃ | 307.81 | 3.8 | [M + H]⁺ | 307.83, 173.03, 149.02 | Fenolsyrer |
| 4.11 | Isoquercitrin | C₂₁H₂₀O₁₂ | 419.13 | 4.1 | [M + H]⁺ | 419.13, 149.02, 101.00 | Flavonoider |
| 4.21 | Isopropylmetylfenidat | C₁₄h₂₁no₂ | 221.08 | -0.8 | [M + H]⁺ | 221.08, 205.09, 104.00 | Annen |
| 4.22 | Sylingsyre | C₉H₁₀O₅ | 785.25 | 1.4 | [M + H]⁺ | 785.25, 663.21, 661.19 | Fenolsyrer |
| 4.30 | Eugenol | C₁₀H₁₂O₂ | 179.04 | 0.2 | [M + H]⁺ | 179.04, 153.03, 113.03 | Fenolsyrer |
| 4.40 | Koffein | C₈H₁₀N₄O₂ | 769.26 | 1.4 | [M + H]⁺ | 769.26, 629.24, 622.14 | Alkaloider |
| 4.43 | Chrysin | C₁₅H₁₀O₄ | 442.05 | 1.1 | [M + H]⁺ | 442.05, 173.03, 113.03 | Flavonoider |
2.2 Molekylær dokking screening av bitre stoffer i Cistanche Deserticola
2.2.1 Konstruksjon av liganddatabase
I henhold til de kjemiske komponentene i Cistanche Deserticola identifisert i 2.1.4, ble SDF -strukturene deres lastet ned fra Pubchem -databasen for å etablere et ligand lite molekylforbindelsesbibliotek. Alle ligands små molekyler ble strukturelt optimalisert ved bruk av molekylærmekanikkprogrammet minimerer.
2.2.2 Valg av bitre reseptorer
Den bitre smaksreseptoren (TAS2R) er medlem av GPCRS -familien og formidler den bitre smakoppfatningsprosessen til smaksløkceller på tungen. Det er 25 reseptorundertyper. Blant dem kan TAS2R1, TAS2R7, TAS2R8 og TAS2R14 aktiveres av en rekke bitre stoffer og tilhører de bredspektret bitre persepsjonsreseptorene [14-15]. Derfor valgte denne studien TAS2R1, TAS2R7, TAS2R8 og TAS2R14 bitter smak reseptorproteiner for dokking med de kjemiske komponentene i cistanche ørkenen, og den bitre proteinkrystallstrukturen ble oppnådd fra Alphafold -databasen.
2.2.3 Molekylær dokking
Den kjemiske komponenten i Cistanche Deserticola identifisert av UPLC-Q-Orbitrap HRMS ble brukt som en ligand, og den bitre smakreseptorundertypen TAS2R1, TAS2R7, TAS2R8 og TAS2R14 ble brukt som proteinreseptorer. Den molekylære dokkingen ble utført ved bruk av Autodock Vina -programvaren. Jo mindre docking -poengsum, jo bedre er den bindende energien. Reseptorproteinet ble forbehandlet ved bruk av Auto Dock Tools (ADT), inkludert dehydrering og hydrogenering. Liganden ble også behandlet ved bruk av ADT, inkludert hydrogenering, ladningsberegning, deteksjon og valg av roterbare bindinger. Det aktive stedet for reseptoren ble bestemt ved bruk av ADT, og dokkingsboksen ble satt for å sikre at kassestørrelsen var tilstrekkelig til å inneholde det aktive stedet. Etter at dokkingen var fullført, ble visualiseringsprogramvaren Pymol brukt til å se og analysere dokkingsresultatene. For å redusere de falske positive resultatene av molekylær dokking, brukte denne studien docking -poengsummen til bitter positiv ligandkinin som screeningskriterium og utvalgte kjemiske komponenter som binder seg godt til minst to bitre reseptorer som de bitre stoffene i Cistanche Deserticola. Som et resultat var totalt 20 kjemiske komponent Docking -score er vist i tabell 3.
Tabell 3 Molekylære dokkingspoeng for bitre presenterende stoffer av Cistanche Deserticola -ekstrakter med bitre smaksreseptorer kcal · mol -1
| Ingen. | Bittert stoff | TAS2R1 | TAS2R7 | TAS2R8 | TAS2R14 |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | Prunasin | -7.6 | -6.6 | -7.8 | -7.1 |
| 2 | Trifolirhizin | -8.8 | -7 | -8.7 | -8.5 |
| 3 | Benzosyre | -7.9 | -6.9 | -8.2 | -7.1 |
| 4 | Vitexin | -7.6 | -6.8 | -8.5 | -7.1 |
| 5 | Trifolin | -8.4 | -7.5 | -8.2 | -7.7 |
| 6 | Isoquercitrin | -9.2 | -7.5 | -8.1 | -7.8 |
| 7 | Isomenthone | -7.3 | -6.7 | -7.4 | -6.9 |
| 8 | Curcumin | -9.2 | -8.1 | -8.3 | -7.4 |
| 9 | Dehydroeddiksyre | -6.6 | -6 | -7.8 | -7.9 |
| 10 | Ginsenoside | -7.3 | -7.9 | -8.8 | -8.3 |
| 11 | Piperine | -8.8 | -7.9 | -7.9 | -7.9 |
| 12 | Epicatechin | -9.8 | -6.9 | -9.1 | -8.7 |
| 13 | Isoquercitrin (igjen) | -8.1 | -8 | -8.2 | -8 |
| 14 | Rhein | -8.7 | -7 | -8.9 | -8.5 |
| 15 | Erosalisylsyre | -8.7 | -6.5 | -8.3 | -9.3 |
| 16 | Pinocembrin | -9.1 | -7.6 | -8.1 | -8.6 |
| 17 | Eriocitrin | -7.9 | -7.6 | -8.2 | -8.4 |
| 18 | Genistin | -8.1 | -8.2 | -9.1 | -8.2 |
| 19 | Kaempferol | -8.4 | -8.1 | -9.1 | -8.4 |
| 20 | Isoquercitrin (tredje omtale) | -8.2 | -8.4 | -7.9 | -8.7 |
2.3 Elektronisk tunge evaluering av bitterheten i Cistanche Deserticola
2.3.1 Signalinnsamling
Se litteraturmetoden og optimaliser den [16]. Parametrene er: innsamlingstemperatur 25 grader, datainnsamlingstid 120 s, innsamlingsperiode 1 s, omrøringshastighet 1 r · s -1, ved bruk av ultrapure vann som rengjøringsvæske, før hver prøvemåling rengjør sensoren i 10 sekunder.
2.3.2 Eksempelbestemmelse
Vei 1. 0 g av henholdsvis cistanche ørkeniske prøvepulver, vei det nøyaktig, tilsett 80 ml vann, refluks og trekke ut i 1 time, la avkjølt, sentrifuge, filtrere, ta 40 ml filtrat, tilsett destillert vann for å lage volumet til 100 ml. Plasser den forberedte prøven i et 100 ml standard beger av instrumentet og utfør målingen. Gjenta målingen tre ganger for hver prøve.
2.3.3 Bitterhet Evalueringsresultater ved bruk av elektronisk tunge
Etter metodologisk inspeksjon var det relative standardavviket (RSD) for presisjon, repeterbarhet og {{0}} H -stabilitetseksperimenter 1,7%, 3,6%og 1,4%, alle mindre enn 5,0%, noe som indikerer at denne metoden er følges. De kvantitative bitterhetsverdiene for forskjellige Cistanche Deserticola -prøver varierte fra 8.856 til 27.32, som vist i tabell 4, med signifikante forskjeller.
3 Diskusjon
I denne studien ble 69 kjemiske komponenter identifisert i Cistanche Deserticola ved bruk av UPLC-Q-Orbitrap HRMS-teknologi, og 20 bitre stoffer som stimulerer bitre smaksreseptorer i cistanche ørkener, ble screenet ut ved å kombinere molekulære dokkingsteknologi, inkludert 6 fenyletanol glykosider, 5 flavonoids, 5 flavonoids, 5 flavonoids, 2-flavoids, inkludert 6 fenyletiske sureroid, 2 molekulære docking-teknologi, inkludert 6 fenyleticola, andre komponenter, inkludert ekkinakosid, verbascosid, tubulosid A, isoverboskosid, geniposid, osv.; 9 partier med friske cistanche ørkenicola -prøver fra samme opprinnelse i forskjellige måneder ble samlet og delt inn i forskjellige måneder og forskjellige deler. Den elektroniske tunge -metoden ble brukt for å bestemme den kvantitative verdien av bitterheten til prøvene, og HPLC ble brukt for å bestemme de 6 potensielle bitre farmakologiske komponentene (ekkinakosid, verbascosid, tubulosid) i prøvene. A, iso-verbascoside, jinshicanoside, geniposid) innhold og UV-synlig spektrofotometri ble brukt for å bestemme den totale fenyletanoide glykosider, totale polysakkarider, totale alkaloider, totale flavonoider og total fenolsyreinnhold i prøvene. På dette grunnlaget, kombinert med kjemometrisk analyse, ble Pearson korrelasjonsanalyse, grå korrelasjonsanalyse, OPLS-DA, etc. brukt for å finne de bitre komponentene i Cistanche Deserticola. Korrelasjonsanalyseresultatene viste at innholdet av totale fenyletanoidglykosider og totale flavonoider i cistanche ørkenen var positivt korrelert med den bitre responsverdien, og den totale polysakkarider av cistanche ørkenet var negativt korrelert med den bitre responsverdien. Blant dem var innholdet av fenyletanoidglykosidkomponenter ekkinakosid, verbascosid og jinshicanoside betydelig positivt korrelert med den bitre responsverdien, noe som var i samsvar med molekylære dokkingsresultater, og bekreftet nøyaktigheten til de molekylære dokkingsresultatene. De to metodene støttet hverandre og ga en referanse for den påfølgende debitering og smakskorreksjon av Cistanche Deserticola.
Gjennom nettverksfarmakologi prediksjon ble 245 bitre stoffmål oppnådd, og de viktigste målene var EGFR, PIK3CB, PTK2, PIK3CD, PIK3R1, PTPN11, IK3CA, SRC, JAK2, PDGFRB, etc.; KEGG-banen og GO-funksjonsberikelsesresultatene av de bitre stoffmålene viste at insulinresistens, rollen til PI3K-Akt signalvei i diabetiske komplikasjoner, og Agr-Rage signalvei i diabetiske komplikasjoner var nøkkelveiene til de bitre stoffmålene til Cistanche ørkenet. Totalt 267 GO -funksjoner ble oppnådd for de bitre stoffmålene. Inkludert 123 biologiske prosesser, 75 molekylære funksjoner og 69 cellekomponenter; Ved å utføre Wayne-analyse på de bitre stoffmålene og sykdomsmålene for den bitre effekten av Cistanche Deserticola, viste resultatene at 54,69%, 65,30%, 48,16%, 40,40%, 20,40%og 19,59%av de bitter bitter-bitter-bitteren av bitter bitter bitter. Anti-aldring og anti-osteoporose. Dette viser at de bitre stoffene i Cistanche Deserticola har et visst materielt grunnlag for bitre effekter.
I denne studien ble ekstraktet av Cistanche Deserticola brukt som forskningsobjekt, og de bitre stoffene i Cistanche Deserticola ble vist ut av UPLC-Q-Orbitrap RM og molekylær dokking; HPLC ble brukt for å bestemme innholdet i de viktigste bitre medisinske komponentene, og UV-synlig spektrofotometri ble brukt for å bestemme innholdet i hver hovedkategori av bitre stoffer. Den elektroniske tungen ble brukt til å evaluere graden av bitterhet, og de bitre komponentene ble bekreftet av kjemometrikk. Moderne tekniske forskningsmetoder ble fullt utnyttet for å utforske smakinformasjonen til Cistanche Deserticola og avsløre det bitre materielle grunnlaget, som vil gi en referanse for den påfølgende debitering og smaksorreksjon av Cistanche Deserticola. Gjennom studiet av nettverksfarmakologi ble virkningsmekanismen til bitre stoffer i Cistanche Deserticola og dets forhold til målet for bitter effekt foreløpig utforsket, som vil gi ideer og referanser for den fremtidige studien av "smakseffekt" -forholdet til de fem smakene til kinesisk medisin. Imidlertid er det fortsatt noen mangler: dette eksperimentet valgte bare planter med god kvalitet i den tradisjonelle høstsesongen for å måle det bitre stoffinnholdet og bitterheten i forskjellige deler. Det er en viss grad av utilstrekkelig prøvestørrelse, og resultatene av forskjellene i bitterhet i forskjellige deler mangler viss pålitelighet. Det er planlagt å bruke store prøver for verifisering og gjennomføre mer systematisk forskning i fremtiden; Det antas generelt at alkaloidkomponenter er bitre, men korrelasjonsanalysen av dette eksperimentet viste at alkaloider og bitterhet er negativt korrelert, noe som kan skyldes at alkaloidkomponenten i Cistanche ørkenen hovedsakelig er betain, og molekylær dokking viser at det bindes dårlig til bitre reseptorer. I tillegg mangler de bitre resultatene som er vist ved molekylær dokking spesifikk bitterhet kvantitativ evaluerings eksperimentelle verifiseringsdata, og screeningresultatene kan ha falske positiver, og videre forskning og utforsking av eksperimentet er nødvendig.
