Cistanche forbedrer nyreinfeksjon på grunn av systemisk lupus erythematosus

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

For del 1, vennligst klikk her.

DISKUSJON

Et brudd på toleransen mot kjernefysiske antigener er kjennetegnet påSystemisk Lupuserythematosus, og i tillegg til B-celler, antas autoreaktive T-celler å spille en sentral rolle i patogenesen. Som påvisning av (auto)antigenspesifikkCD4⁺ T-celler utgjør fortsatt en stor utfordring i autoimmunitetsforskning, til dags dato er lite faktisk kjent om kjernefysisk antigen-reaktiv CD4⁺T celler iSystemiskLupuserythematosus.

Nylig, nye metoder for deteksjon og opplisting av antigen-spesifikk CD4⁺T-celler er utviklet. T-cellebibliotekets tilnærming utnytter tidligere polyklonal utvidelse av T-celler for å muliggjøre påvisning av sjeldne antigenspesifikke T-cellekloner. Denne strategien gir høy følsomhet og tillater arbeid med begrensede mengder celler. Ved hjelp av denne teknikken kunne vi demonstrere reaktive T-celler mot 5 kanoniske nukleære antigener hos pasienter med aktivSystemiskLupuserythematosus. Ulempene med den bibliotekbaserte deteksjonen er, i tillegg til å være arbeidskrevende, at utvekst eller tap av visse kloner under utvidelsen, fasen ikke kan utelukkes og de begrensede alternativene for fenotypisk analyse av cellene.

Standard medcytometri er begrenset av antall påvisbare hendelser, som vanligvis begrenser analysen av prøver til befolkningen med frekvenser over 0,01%. Vår observasjon ved hjelp av T-cellebiblioteket viste at frekvensen av sirkulerende autoreaktiv CD4⁺T-celler for et bestemt autoantigen hos pasienter med sykdomsbluss var w20 celler i en million celler, som representerer en frekvens på 0,002%; derfor er påvisning av autoantigenspesifikk CD4⁺T-celler som bruker standard, ikke-pulert medcytometri er nesten umulig. Bacher et al. introduserte forhåndsberikelse av CD4⁺T-celler som er reaktive mot spesielle antigener før oppkjøp på medcytometri, kjent som ARTE-metoden. Ved å ta i bruk denne tilnærmingen for påvisning av kjernefysisk antigenspesifikk CD4⁺T-celler, vi var i stand til å bekrefte våre funn og demonstrere utvidelsen av kjernefysisk antigen-reaktiv CD4⁺T celler i aktivSystemiskLupuserythematosus. Spesielt var frekvensen av T-celler reaktiv med transthyretin og C. Albicans likegyldig mellom sunne kontroller og pasienter medSystemiskLupuserythematosusmed varierende sykdomsaktivitet. Derfor er den observerte utvidelsen avautoreaktivereTCellersannsynligvis ikke er et resultat av generell hyperreaktivitet inaktivSystemiskLupuserythematosusmen av utvidelsen av antigenspesifikke T-celler.

Densystemisk lupus erythematosusinfiserernyre, så cistanche brukes til å beskytteNyrer.

Tidligere rapporter har allerede vist eksistensen avautoreaktivereT celleriSystemiskLupuserythematosus, primært ved hjelp av spredning, cytokinproduksjon eller oppregulering av aktiveringsmarkører, om enn uten å kunne kvantifisere en klar populasjon av disse cellene. Det beste beviset på hyppigheten av nukleære antigenspesifikke T-celler eksisterer for reaktivitet mot U1 liten ribonukleoprotein, et karakteristisk autoantigenmål ved blandet bindevevssykdom og finnes bare hos en brøkdel av pasienter medSystemiskLupuserythematosus. U1 liten kjernefysisk ribonucleoprotein– reaktiv CD4⁺T-celler ble bestemt ved hjelp av begrensende fortynning og enzym-koblet Immuno Spot Assay (ELISPOT) og ble rapportert å forekomme med en frekvens på (40 til 250) 106 T celler og (20 til 60) 106 PBMCs, henholdsvis, som er av samme størrelsesorden som frekvensen av autoreaktive celler i vår studie. I vårt arbeid undersøkte vi reaktivitet mot flere karakteristiskeSystemiskLupuserythematosus-assosierte kjernefysiske antigener. Interessant, selv om alle pasienter med aktiv LN viste økte frekvenser av anti-nukleært antigen-reaktiv CD4⁺T-celler, pasientene var forskjellige i målporteføljen, og reaktiviteten var rettet mot et bredere sett med antigener sammenlignet med pasienter med inaktiveSystemiskLupuserythematosus. Det biologiske tegn på dette er foreløpig ukjent. Annen CD4⁺T celle reaktiveringer kan assosiere med visse kliniske manifestasjoner av ulike reaktiveringer som kan være overflødige for sykdommen patogenese.

I likhet med andre autoimmune sykdommer, var vi også i stand til å demonstrere eksistensen av autoreaktiv CD4⁺T celler hos friske individer, om enn ved mye lavere frekvenser sammenlignet med pasienter med aktiv systemisk lupus erythematosus. Disse cellene kunne ikke oppdages ved å sammenligne antall aktiverte celler med eller uten antigenstimulering, selv med så svært sensitive teknikker som T-cellebiblioteker eller ARTE-metoder. Men ved kloning av encellede celler kunne vi demonstrere at "bakgrunnssignalet" faktisk inneholdt autoantigenspesifikk CD4⁺T celler. Hvilke spesifikke hendelser som fører til brudd på toleransen og økende frekvenser avautoreaktivereTCellerforblir spekulativ; Likevel viser våre data at utvidelse av autoreaktive kloner spiller en rolle i patogenesen av systemisk lupus erythematosus.

Sirkulerende kjernefysisk antigen-reaktiv CD4⁺T-celler produserte hovedsakelig IFN-g og, i mindre grad, IL-17 og IL-10. Denne cytokinprofilen sammen med den svake/ingen korrelasjonen med autoantistoffproduksjonen antyder at rollen som kjernefysisk antigenreaktiv CD4⁺T-celler er kanskje ikke den eneste leverandøren av B-cellehjelp. IFN-g har vist seg å være uunnværlig i patogenesen av LN. Th1-cellene har vist seg å bli rekruttert tilInfisert nyrevev iSystemisk Lupuserythematosus, noe som gjør kjernefysiske antigenreaktive T-celler til ypperlige kandidater for å invadereNyrer, hvor de ville møte sin allestedsnærværende cognate autoantigen. Urin T-celler har tidligere blitt beskrevet for å reflektere sykdomsaktivitet og speile fenotypen av intrarenale celler i LN20,33; Vi brukte dermed urin T-celler som proxy fornyreT celler. Urin T-celler viste en begrenset TCR-variabilitet, som er i tråd med observasjoner inyrebiopsier, noe som indikerer berikelse av visse T-cellekloner iInfisertnyrevev. Blant urin T-celler var vi i stand til å oppdage nukleære antigenreaktive T-celler, og frekvensen deres ble beriket sammenlignet med sirkulasjons-T-celler. Følgelig virker det sannsynlig at kjernefysiske antigenreaktive celler direkte deltar i forplantning av lokal organskade.

Oppsummert viser vi her at kjernefysisk antigen-reaktiv CD4⁺T-celler utvides inaktiveSystemiskLupuserythematosus; de er fenotypisk hovedsakelig IFN-g-produserende Th1 T-celler og invadererInfisertmålorganer somnyre.

Cistanche kan unngå infeksjonen tilnyrepå grunn avSystemiskLupuserythematosus.

METODER

Detaljerte metoder er gitt i tilleggsmateriale.

Forsøkspersoner og blod- og urinprøver

Blodprøver ble innhentet fra 17 friske personer, 12 pasienter med inaktiveSystemiskLupus erythematosus(SystemiskLupuserythematosusDAI-poengsum<10), and="" 20="" patients="" with="" active="">SystemiskLupuserythematosus(SystemiskLupuserythematosusDAI scorer >10). I tillegg ble det innhentet urinprøver fra 12 pasienter med aktivSystemiskLupuserythematosusog LN. Alle fagene hadde gitt sitt informerte samtykke på grunnlag av den etiske godkjenningen innhentet av institusjonelle kontrollråd og etiske myndigheter i Charité – Universitätsmedizin Berlin (EA 1/342/12, EA 1/098/07 og EA 1/036/16). PBMCer og urinceller ble tilberedt ved hjelp av en FicollHypaque tetthet gradient.

Antistoffer og følg cytometri

Avhengig av forsøkene ble flere overflatemolekyler farget på antigen-stimulerte celler i forskjellige kombinasjoner av følgende monoklonale antistoffer: anti-CD3, -CD4, -CD8, -CD14, -CD20, -CD69 og -CD154; å diskriminere levende og døde celler, LIVE / DEAD Aqua kit (Life Technologies Ltd.,PaisystemiskLupuserythematosus, Storbritannia) ble brukt.

For å flekke det intracellulære cellerommet ble cellene fiksert med 2% (v / v) paraformaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur og permeabilisert med BD FACS Permeabilizing Solution 2 (BD Biosciences, San Jose, CA); Følgende antigener ble farget intracellulært ved hjelp av en standardprotokoll: CD154, IFN-g, IL-2, IL-4, IL-10 og IL-17.

Prøver ble anskaffet på BD FACSCanto II og BD LSRFortessa (BD Biosciences) følg cytometere ved Flow Cytometry Core Facility Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin ved hjelp av BD FACSDiva programvare (BD Biosciences). Flowcytometridata ble analysert ved hjelp av FlowJo-programvare (FlowJo v10, Three Star, Ashland, VA).

Antigen og antigen basseng forberedelse

Vi brukte følgende antigener for å stimulere CD4⁺T-celler i T-cellebibliotekets analyse: 0,5 mg/ml humant SNRPD1 (SmD1) rekombinant protein (Biorbyt Ltd., Cambridge, Storbritannia), 50 ng/ml humant SNRP70 (RNP70) rekombinant protein (Abcam Plc., Cambridge, Storbritannia), 0,5 mg/ml naturlig humant histoneprotein (Abcam Plc.), 0,5 mg/ml humant SS-A/Ro rekombinant protein (vennligst levert av Euroimmun AG, Lübeck, Tyskland), 0,5 mg/ml humant SS-B/La rekombinant protein (vennligst levert av Orgentec Diagnostika GmbH, Mainz, Tyskland), 1 mg/ml SEB (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Tyskland), 1 mg/ml PepTivator Candida albicans MP65 (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Tyskland) og 0,5 mg/ml humant transthyretin rekombinantprotein (ATGen, Seongnam, Sør-Korea).

Perifere og urin T-celle biblioteker Protokollen for å generere forsterkede perifere og urin T-celle biblioteker ble vedtatt og tilpasset som tidligere beskrevet.14 Brieflfly, 200,000 perifer CD4⁺T-celler eller 500 til 2000-urin-CD4⁺T-celler ble isolert ved hjelp av anti-humanCD4⁺MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH) i henhold til produsentens instruksjoner. Renheten til CD4⁺T-cellefraksjon ble rutinemessig kontrollert ved hjelp av følg cytometri på grunnlag av CD3⁺CD4⁺uttrykk, der renheten alltid nådde >99% og 70% til 75% for perifere blod- og urinprøver, henholdsvis. Parallelt ble antigen-presenterende celler utarbeidet ved å samle CD3-celler fra PBMCer etter uttømming med antimenneskelig CD3 MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH) og kryopreservert. Etter 1 til 2 uker med kultur, fraksjoner av forsterket CD4⁺T-celler ble fordelt på 96-brønnsplater, avhengig av antall antigener som skal analyseres. Før stimulering med antigener ble cellene uthvilt i minst 4 dager. På stimuleringsdagen ble antigen-presenting celler tint og fordelt inn i T-cellekulturen i et forhold på minst 1 antigen-presenting celle til 100 CD4⁺T celler. CD4⁺T-cellebiblioteker for negativ kontroll (ustimulerte celler) og positiv kontroll (celler stimulert med SEB) ble alltid inkludert i forsøkene. CD4⁺ T-celler ble stimulert med antigenet i 4 dager, og spredning ble bestemt ved hjelp av en standard [3 H]-tymidprotokoll.

Forsterkede T-celle eksplosjoner reagerte annerledes på antigenene som vises av svært heterogen scintillation CPM; Dermed var en normalisering av spredningsterskelen bestemt som donorspesifikk z-score nødvendig. Z-poengsummen ble beregnet som 5 forskjeller på 75. Celler i mikrokulturer stimulert med SEB fungerte som en positiv kontroll. Vær oppmerksom på at mikrokulturer med en SEB-stimuleringsindeks på<5 for="" peripheral="" blood="" samples,="" or="" 4="" for="" urinary="" samples,="" were="" excluded="" because="" it="" indicated="" poor="" cell="" viability.="" enumeration="" of="" the="" precursor="" frequency="" of="" antigen-specific="">⁺T-celler ble beregnet ved hjelp av antall negative mikrokulturer i henhold til Poisson-distribusjon og uttrykt per 1 million celler, som beskrevet tidligere. Bruken av Poisson-fordelingen er basert på sannsynligheten for at minst 1CD4⁺T-cellen er til stede i en enkelt mikrokultur av T-cellebiblioteker da det radioaktive signalet ble oppdaget etter antigenspesifikk stimulering.

Perifere og uriniske ARTE-metoder vi fulgte protokollen som bruker CD154 MicroBead Kit (Miltenyi Biotec GmbH). Kort sagt ble celler stimulert i 7 timer med antigener og deretter merket med anti-menneskelige CD154-biotin antistoffer og antibiotinmikrober i henhold til produsentens instruksjoner. Merkede celler ble lastet inn i kalibrerte MS-kolonner (Miltenyi Biotec GmbH) for å berike CD154-uttrykkende celler. Merking av celler med karboksyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) ble gjort etter en standardprotokoll.

Cistanche forbedrer segnyreFunksjoner.

Generering av encellede kloner

Encellede kloner ble generert fra antigenreaktive celler, som ble beriket av CD154-uttrykk etter ARTE-protokollen. CD154-uttrykkende celler ble filtrert med et 30 mm forberedelsesfilter (Miltenyi Biotec GmbH) og resuspendert i 1 ml 20% (v / v) kald fosfatbufret saltvann, 0,5% bovint serumalbumin og 2mM etylendiamintetraacetisk syre. Celler ble sortert for CD154⁺CD69⁺fenotype og enkeltsorterte celler ble dyrket i enkeltbrønner på 96-brønnsplater i nærvær av materceller. Cellekulturer ble opprettholdt i 3 til 4 dager til flere kloner var synlige. En dag før restimulering ble antigen-presenting celler tint og fordelt inn i T-cellekulturen i forholdet mellom

minst 1 antigen-presentasjonscelle til 100 CD4⁺T celler. Celler ble stimulert med 1 mg/ml antigen, og ustimulerte kloner fungerte som en negativ kontroll.

Neste generasjons sekvenseringsbaserte TCR-repertoaranalyse

Genomisk DNA ble isolert fra perifer CD4⁺T-celler og urinceller ved hjelp av AllPrep DNA/RNA Micro Kit (Qiagen, Venlo, Nederland). Rekombinert TCR-b-locus ble forsterket etter protokollen som beskrevet tidligere. Lesinger ble behandlet ved hjelp av IMSEQ, og like clonotyper ble gruppert og videre analysert.

Statistikk

Statistiske tester ble utført med GraphPad Prism programvare (Prism 8, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Bonferroni justering for flere sammenligninger ble brukt. Mann-Whitney U test og Wilcoxon signert-rank test ble brukt i forsøkene med henholdsvis uavhengige og avhengige datasett. Etter Bonferroni-justering for flere sammenligninger ble beregningen av kritiske P-verdier korrigert fordi den er basert på antall planlagte sammenligninger. P-verdier<0.01 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="">< 0.01,="" **p="">< 0.005,="" and="" ***p="">< 0.0005.="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" spearman="" rank="" correlations="" by="" showing="" the="" absolute="">SystemiskLupuserythematosusDAI-verdier i stedet for rangerte verdier for bedre å gi en forståelse av sammenhengen mellom antall celler og sykdomsaktivitet. For korrelasjonsanalyser er P-verdier<0.5 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="">< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" and="" ***p="">< 0.001.="" when="" background="" frequencies="" were="" higher="" than="" the="" frequencies="" of="" nuclear="" antigen–reactive="">⁺T-celler, ble frekvensene uten bakgrunn definert som null. En log(x þ 1)-transformasjon ble brukt på datasettet da det inkluderte nullverdier. Supplerende pasientdata og statistiske data er tilgjengelige i supplerende tabell S1 og S2.

Kjernefysisk antigen-reaktiv CD4⁺celler utvides i aktiveSystemiskLupuserythematosus, produsere effekt eller cytokiner og infisereNyrer, kan cistanche beskytteNyrer.

AVSLØRING

Alle forfatterne erklærte ingen konkurrerende interesser.

BEKREFTELSER

Vi takker Toralf Kaiser og Jenny Kirsch (Flow Cytometry and Cell Sorting Facility, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin) for hjelp med flflowcytometri og cellesortering. Støtten til disse studiene ble gitt av tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft i Sonderforschungsbereich 650 til GR og ved tilskudd fra Deutsche Gesellschaft für Nephrologie and Clinical Scientist Program of Charité-Universitätsmedizin Berlin og Berlin Institute of Health til PE.

TILLEGGSMATERIALE Tilleggsfil (PDF)

Figur S1. Autoreaktiv kjernefysisk antigenspesifikk CD4⁺T-celler ble oppdaget av T-cellebibliotekmetoden. Figur S2. CD154⁺CD69⁺CD4⁺T-celler isolert etter stimulering med kjernefysiske antigener fra friske individer er bona-fife antigenspesifikk CD4⁺T celler.

Figur S3. Frekvensene til cytokinproduserende autoreaktiv CD4⁺T-celler ble sammenlignet med titeret av antinukleære antistoffer (anti-ANA) (A), og med konsentrasjonen av anti-dobbel tråd DNA-antistoffer (anti-dsDNA) (B).

Figur S4. Kjernefysisk antigen-reaktiv CD4⁺T-celler ble påvist i urinen til aktiveSystemiskLupuserythematosuspasienter med LN.

Tabell S1. Kliniske data.

Tabell S2. Sammendrag av medianverdier.

Supplerende metoder.

Nårnyreer infisert på grunn av kjernefysisk antigen-reaktiv CD4⁺celler som utvides i aktiveSystemiskLupuserythematosusdennyreødelagt, brukes cistanche til å forbedrenyrefunksjon.

REFERANSER

1. Casciola-Rosen LA, Anhalt G, Rosen A. Autoantigens målrettet iSystemisk Lupuserythematosuser gruppert i to populasjoner av overflatestrukturer på apoptotiske keratinocytter. J Exp Med. 1994;179: 1317–1330.

2. Arbuckle MR, McClain MT, Rubertone MV, et al. Utvikling av autoantistoffer før den kliniske utbruddet avSystemiskLupuserythematosus. N Engl J Med. 2003;349:1526–1533.

3. Suarez-Fueyo A, Bradley SJ, Tsokos GC. T celler iSystemiskLupuserythematosus. Curr Opin Immunol. 2016;43:32–38.

4. Crow MK, DelGiudice-Asch G, Zehetbauer JB, et al. Autoantigen-spesifikk T-celleproliferasjon indusert av ribosomal P2-protein hos pasienter medSystemiskLupuserythematosus. J Clin Invest. 1994;94:345–352.

5. Engler JB, Undeutsch R, Kloke L, et al. Avmaskering av automatisk reaktivering av CD4⁺T celler ved uttømming av CD25 regulatoriske T-celler iSystemiskLupuserythematosus. Ann Rheum Dis. 2011;70:2176–2183.

og så videre.