Artsidentifikasjon og kjemisk sammensetningsanalyse av ville sistancheplanter fra Kenya

Abstrakt:Denne studien brukte plantemorfologi, histologi og DNA-strekkodingsteknikker for å identifisere de ville Cistanche-artene i Kenya. Innholdet av de viktigste aktive komponentene, inkludert fenyletanoidglykosider, sukkeralkoholer og betain, i den ville Cistanche fra Kenya ble bestemt ved HPLC-metoden. I mellomtiden ble fingeravtrykksanalysen utført. Resultatene viste at den ville Cistanche-planten samlet fra Kenya ble identifisert som Cistanche senegalensis (Reut.) Beck. Innholdet av aktive ingredienser som f.eksechinacoside,cistanoside A, akteosid, isoakteosid, og 2'-acetylacteosid i C. senegalensis fra Kenya var lavere enn de i den tamme C. tubulosa, men høyere enn de i den tamme C. deserticola. Innholdet av betain var likt det i den tamme C. deserticola, men det inneholder ikke glukose. Egenskapene til fingeravtrykket er mer lik de til tam C. tubulosa. Denne studien gir grunnlag for ressursbeskyttelse, dybdeforskning og utvikling av Cistanche-ressursen i Kenya.

Nøkkelord: Cistanches Herba; Cistanche senegalensis (Reut.) Beck; Kenya; artsidentifikasjon; DNA strekkoding; innholdsbestemmelse

 

 

 

Cistanche deserticolaYC Ma

 

Cistanche, en verdsatt urt i tradisjonell kinesisk medisin, refererer til de tørkede, skjellete, saftige stilkene til ørkenplanter som f.eks.Cistanche deserticolaYC MaogCistanche tubulosa(Schenk) Wight, begge medlemmer av Orobanchaceae-familien. Kjent for sin evne til å tonifisere nyre-yang, gi næring til essens og blod, og fukte tarmene for å lindre forstoppelse, har Cistanche blitt feiret i kinesiske urtetekster i århundrer. Dens tidligste medisinske rekord vises i den eldgamle klassikerenShennongs klassiker av Materia Medica, hvor Cistanche er klassifisert som en "overlegen karakter" urt. I løpet av historien har en rekke tradisjonelle medisinske tekster dokumentert de kraftige fordelene med Cistanche, og gitt den det anerkjente kallenavnet "ørkenens ginseng."

De forskjellige farmakologiske effektene til Cistanche tilskrives dens rekke bioaktive forbindelser. Blant dem er fenyletanoidglykosider de primære aktive ingrediensene som er ansvarlige for Cistanches nyre-tonifiserende og marg-nærende effekter. Disse forbindelsene - som echinacosid og acteosid - viser nevrobeskyttende, anti-demens, anti-aldring og leverbeskyttende aktiviteter. Spesielt er echinacosid og acteosid de to referanseforbindelsene som brukes for kvalitetskontroll av Cistanche som spesifisert i 2020-utgaven av den kinesiske farmakopéen. I tillegg skyldes den lakserende effekten av Cistanche hovedsakelig dens oligosakkaridalkoholkomponenter, inkludert betain, mannitol, fruktose, glukose og sukrose. Disse fem komponentene er anerkjent som indikatorer på Cistanches evne til å fukte tarmene og fremme avføring.

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight

I Kina inkluderer hovedarter av CistancheCistanche deserticolaYC Ma,Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight,Cistanche salsa(CA Mey.) G., ogCistanche sinensisG. Beck. Disse artene er hjemmehørende i regioner som Indre Mongolia, Ningxia, Gansu og Xinjiang. Utover det nordvestlige Kina er Cistanche-arter også fordelt over tørre og ørkenregioner i Eurasia og det nordlige og østlige Afrika, inkludert land som Iran, Afghanistan, Kenya, Pakistan og Mongolia.

Kenya, som ligger i Øst-Afrika og grenser over ekvator, består for det meste av høyland med en gjennomsnittlig høyde på 1500 meter, men de nordlige områdene er ørken eller halvørken. Urbefolkningen i Kenya har en lang historie med å bruke medisinplanter for helbredelse. Regionen har et vell av medisinsk flora - for eksempel ekstrakter fra barken og røttene til tannbørstetreet (Salvadora persicaL.) er kjent for sine antiinflammatoriske og antibakterielle egenskaper og brukes ofte til å behandle tannpine og infeksjoner. Barken til sandeltreet (Osyris lanceolataHochst. & Steud.) brukes til å behandle diaré, mens avkok av Maasai brennesle (Urtica massaicaMildbr.) blader brukes mot magesmerter. Denne rike tradisjonen har fostret en levende medisinplantekultur, men på grunn av økonomiske utviklingsutfordringer har bruken av disse medisinplantene ikke blitt fullstendig dokumentert eller systematisk studert.

Interessant nok blir Cistanche-arter ofte sett på som ugress i Afrika og har ikke fått mye oppmerksomhet eller forskning. Faktisk er det nesten ingen publiserte studier på African Cistanche. Som svar på en invitasjon fra Department of Regional Development for Arid and Semi-Arid Lands of the East African Community, gjennomførte vårt forskningsteam en feltstudie i Kenya for å undersøke lokale Cistanche-ressurser. Vi samlet ville Cistanche-prøver, utførte botanisk identifikasjon og analyserte deres primære bioaktive forbindelser. Målet var å forstå artsmangfoldet og utviklingspotensialet til Cistanche i Kenya, og å gi et vitenskapelig grunnlag for videre forskning og utnyttelse av disse verdifulle ørkenplantene.

Cistanche tubulosa tørket hel rot Salg i Kina

Whatsapp oss for mer informasjon

 

 

Materialer og metoder

Plantematerialer

Ville Cistanche-prøver fra Kenya ble samlet inn i august 2023 av professorene Pengfei Tu og Yong Jiang fra School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, i Kajiado, Kenya (01 grad 50'01"S; 36 grad 47'00"E). To ville Cistanche-planter ble samlet og merket K1 og K2, sammen med røttene til vertsplanten deres (se figur 1). Vertsplanten ble identifisert av Kennedy Matheka, en forskningsassistent ved East African Herbarium, National Museums of Kenya, somSericocomopsis hildebrandtiiSchinz, som tilhører Amaranthaceae-familien. Prøver avCistanche deserticolaogCistanche tubulosable samlet inn fra henholdsvis Turpan City og Yutian County i Xinjiang Uygur autonome region, og ble autentisert av professor Pengfei Tu som ferske saftige stammer avCistanche deserticolaYC Ma ogCistanche tubulosa(Schrenk) Wight. Alle kupongprøver oppbevares i vårt laboratorium.

Instrumenter

Waters Arc HPLC-system

Quintix125D-1CN elektronisk balanse (Sartorius, Beijing)

Olympus BX-50 optisk mikroskop (Olympus, Japan)

NanoZoomer-SQ panoramalysbildeskanner (Hamamatsu Photonics, Japan)

KQ500DE digital ultralydsrenser (Kunshan Ultrasonic Instruments, Kina)

MM400 DNA-ekstraksjonskvern (Retsch, Tyskland)

PCR termisk syklus (Analytik Jena, Tyskland)

DYY-8C elektroforeseapparat og tank (Liuyi Instrument Factory, Beijing)

MINI Space 1000 gel bildesystem (Tanon, Shanghai)

Inkubator med konstant temperatur (Yiheng, Shanghai)

Reagenser

Echinacoside (parti: DST191008-038), acteosid (DSTDL006101), isoacteosid (DST210601-060), D-mannitol (DSTDG006201) ble kjøpt fra Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.; tubulosid A (MUST-15040115), 2'-acetylakteosid (MUST-15071504), betain (MUST-23082505), vannfri D-glukose (MUST-23030214), fruktose (MUST-23031403) og sukrose (MUST-23082505) ble hentet fra Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd. OCEANPAK), maursyre (HPLC-kvalitet, VOKA-reagenser) var alle av kromatografisk renhet. Plante-genomisk DNA-ekstraksjonssett (DP305, Tiangen Biotech, Kina) og ultrarent vann ble brukt til molekylær analyse.

Forberedelse, farging og observasjon av sukkulente stammeseksjoner

Ved å følge metoden i referanse [10] ble ferske Cistanche-sukkulente stilker kuttet til passende størrelser og konservert i FAA-fiksativ (70 % etanol: iseddik: formaldehyd=90:5:5). Etter vasking med rennende vann for å fjerne gjenværende fikseringsmiddel, ble vev myknet med flussyre, farget med Safranin, dehydrert, innebygd i parafin og snittet. Etter montering ble objektglass bakt, parafin smeltet og seksjoner farget med 95 % etanol Fast Green-løsning, deretter forseglet med nøytral harpiks. Vevsmorfologien ble observert under et mikroskop, og velformede seksjoner ble skannet ved hjelp av en panoramaskanner for å oppnå høyoppløselige bilder.

DNA-ekstraksjon, PCR-amplifisering og sekvensering

Totalt DNA fra Cistanche-prøver og vertsplanterøtter ble ekstrahert ved bruk av et plantegenomisk DNA-ekstraksjonssett (Tiangen), etter produsentens protokoll. DNA-konsentrasjoner og OD260/OD280-forhold ble målt med et mikrovolum UV-spektrofotometer for å vurdere kvaliteten før du fortsetter.

PCR-amplifisering målrettet den interne transkriberte spacer 2 (ITS2)-regionen av ribosomalt DNA og kloroplast psbA-trnH-genet for molekylær identifikasjon [11]. Primersekvenser var som følger:

ITS2 fremover: 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'

ITS2 revers: 5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'

psbA-trnH fremover: 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'

psbA-trnH omvendt: 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'

PCR-reaksjoner (25 μL) inkluderte 12,5 μL 2× Taq Master Mix, 1 μL hver av forover- og reversprimere (2,5 μmol·L⁻¹), 2 μL DNA-mal og 8,5 μL ddH₂O. ITS2-forsterkning: 94 grader 5 min; deretter 35–40 sykluser på 94 grader 30 s, 56 grader 30 s, 72 grader 45 s; siste forlengelse ved 72 grader 10 min. psbA-trnH amplifikasjon: 95 grader 4 min; 35 sykluser på 94 grader 30 s, 55 grader 1 min, 72 grader 1 min; siste forlengelse ved 72 grader 10 min. PCR-produkter ble analysert ved gelelektroforese, og målbånd ble utsatt for Sanger toveis sekvensering. Sekvenskromatogrammer ble analysert ved bruk av CodonCode Aligner (v3.7.1, CodonCode Co., USA) for å oppnå mål-DNA-sekvenser, som ble identifisert ved hjelp av det kinesiske Materia Medica DNA-strekkodesystemet og BLAST-analyse i GenBank-databasen. Fylogenetiske trær ble konstruert med MEGA X-programvare for artsidentifikasjon.

Kvantitativ bestemmelse av fem fenyletanoidglykosider

Innholdet av fem fenyletanoidglykosider ble bestemt etter tidligere etablerte metoder [13]. Tilberedning av referanseløsninger: vei nøyaktig echinacosid, tubulosid A, acteosid, isoacteosid og 2'-acetylacteosid, og løs opp i 50 % metanol for å lage en blandet standardløsning med forhåndsbestemt konsentrasjon. Kromatografiske forhold: Phenomenex Luna C18-kolonne (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobil fase A: acetonitril-metanol (6:1, v:v); mobil fase B: 0,1 % maursyrebuffer; gradienteluering: 0–5 min, 10 %–18 % A; 5–15 min, 18 %–24 % A; 15–20 min, 24 %–26 % A; 20–28 min, 26 %–30 % A; 28–35 min, 30 %–35 % A. Strømningshastighet: 1,0 mL·min⁻¹; kolonnetemperatur: 30 grader ; deteksjonsbølgelengde: 330 nm. Metode: injiser 10 μL hver av standard- og prøveløsninger i HPLC for analyse.

Kvantitativ bestemmelse av betain, mannitol, fruktose, glukose og sukrose

Disse komponentene ble kvantifisert i henhold til tidligere metoder [14]. Referanseløsninger: vei nøyaktig betain, mannitol, fruktose, glukose og sukrose, løs opp i vann for å lage en blandet standardløsning. Prøveløsninger: Fortynn Cistanche prøveløsning (tilberedt som ovenfor) med 50 % metanol til 1/5 opprinnelig konsentrasjon, bland godt og filtrer gjennom en 0,22 μm mikroporøs membran. Kromatografiske forhold: Shodex ASHAIPAK NH2P-50 4E kolonne (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobil fase: acetonitril-vann (77:23); strømningshastighet: 0,7 ml·min-1; kolonnetemperatur: 25 grader; deteksjon med evaporativ lysspredningsdetektor (ELSD): driftrørtemperatur 100 grader, bæregassstrøm 3 L·min⁻¹. Kvantifisering ble utført ved å injisere 5 μL og 10 μL standardløsninger og 5 μL prøveløsning, og beregne innholdet ved å bruke den eksterne standard topunkts logaritmiske ligningen.

Evaluering av likhet med fingeravtrykk

Prøveløsninger ble fremstilt som beskrevet ovenfor, og HPLC-betingelser og metoder var de samme som for kvantifisering av fenyletanoidglykosid. Kromatografiske data ble importert til "Traditional Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System (2012 Edition)". Kromatogrammet til prøve K1 ble brukt som referanse, med fem fenyletanoidglykosidtopper merket for flerpunktskorreksjon, generering av overlegg og referansekromatogrammer og beregning av fingeravtrykkslikhet.

 

 

Resultater og analyse

1. Morfologisk identifikasjon av Cistanche

De ville Cistanche-prøvene samlet i Kenya viser særegne morfologiske egenskaper. Blomsterstanden er en pigg, med ett bract som er lang-eggformet-lansettformet, og to små brakteoler, som begge sider er glatte. Begeret er rørformet, med fem butte fliker på toppen. Kronen er rørformet-campanulate, måler 3–4 cm i lengde, omtrent 2,5 ganger lengden av begeret, med fem fliker på toppen og tilbakebuede marginer. Kronen er gul i fargen (figur 1A, B), og blir brun når den tørkes. Filamentene er omtrent 3 cm lange, med noen få fine hår i bunnen. Stilen er litt lengre enn støvbærerne, og stigmaet er nesten sfærisk, glatt og glatt. Det er fire støvbærere, med lange eggformede støvbærere som er tett dekket med lange ullhår; bunnen av støvbæreren er brått spiss. Denne funksjonen samsvarer med beskrivelsene avCistanche deserticolaogCistanche salsai "Kinas flora"; i kontrast, anther base avCistanche tubulosaer sløv og avrundet, noe som tydelig skiller den fra andre arter i samme slekt [7].

I tillegg vertsplanten,Sericocomopsis hildebrandtiiSchinz, er en mye forgrenet busk. Dens unge grener er tett dekket med blekgule eller hvite ullhår. Bladene er bredt spatelformet-ovovale med en smal base (figur 1D, E). Blomsterstandene er tett klynget langs stilken, som sammen med blomsterstandsaksen er dekket av gråhvite eller blekgrå eller hvite ullhår.

Den saftige stammen til den ville Cistanche er flat-sylindrisk, med en blekgul eller brunaktig overflate tett dekket med nålelignende, kjøttfulle skjell arrangert i rader. Teksturen er fast, men likevel litt fleksibel (Figur 2A). Tverrsnittet av den saftige stammen er blekgul eller brunaktig, med spredte blekbrune vaskulære bunter synlige for det blotte øye (Figur 2B). Under mikroskopet virker karbuntene eggformede eller fusiforme, sammensatt av xylem og floem, ofte til stede som enkeltstående spredte bunter eller gruppert i par eller trioer, med floem orientert i forskjellige retninger (Figur 2C, D). I følge 2025-utgaven av den kinesiske farmakopéen er tverrsnittet avCistanche deserticolaer brunaktig, med blekbrune prikklignende karbunter arrangert i en bølget ring, ofte danner en indre foldet ringformet bunt; i kontrast,Cistanche tubulosaviser spredte prikklignende vaskulære bunter, en viktig kjennetegn for å identifisere disse to typene Cistanche-skiver [1]. Den ville Cistanche fra Kenya viser også spredte prikklignende karbunter i tverrsnittet, i samsvar med egenskapene tilCistanche tubulosa.

 

 

Figur 2 Utseende og tverrsnittskarakteristikk av vill Cistanche-plante (K2) i Kenya. A: Utseendet til stilken; B: Tverrsnittet av den kjøttfulle stilken; C: Parafinsnitt av den kjøttfulle stilken (safranin-rask grønnfarging); D: Forstørret visning av karbunten i parafindelen