Cistanche Tubulosa beskytter dopaminerge nevroner gjennom regulering av apoptose og glialcelle-avledet nevrotrofisk faktor: in vivo og in vitro-Ⅰ

INTRODUKSJON

Parkinsons sykdom (PD) er en vanlig nevrodegenerativ sykdom som forekommer hos eldre mennesker med patologiske manifestasjoner av tap av dopaminerge nevroner i substantia nigra (SN) på grunn av degenerasjon. Alvorlighetsgraden av sykdommen er korrelert med tapamin (DA) neuronal celletap i SN, noe som er i samsvar med synet om at den nevrodegenerative prosessen utvikler seg over mange år før noen symptomer vises (Sawle og Myers, 1993). Sykdommens progressive natur antyder interessante muligheter for terapeutisk intervensjon ved å blokkere den underliggende nevrodegenerative prosessen. Søket etter terapiindusert potente og spesifikke virkninger av nevrotrofiske faktorer på DA-neuronoverlevelse er derfor av betydelig interesse.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR BESKYTTELSE AV DOPAMINERGISKE NEURONER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Nevrotrofiske faktorer er essensielle proteiner, inkludert nervevekstfaktor (NGF), hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF) og gliacelleavledet nevrotrofisk faktor (GDNF), som fremmer nervevekst, nevrologisk utvikling, aksonal veiledning og nevronal funksjon. Blant alle de nevrotrofiske faktorene som beskytter og fremmer reparasjon av dopaminerge nevroner, har GDNF de sterkeste effektene (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). GDNF har vist seg å ha potente nevrotrofiske effekter på DA-neuroner in vitro (Lin et al., 1993) og å utøve nevrobeskyttende effekter in vivo. GDNF har vist seg å redde nigrale DA-nevroner fra lesjonsindusert celledød etter kirurgisk eller toksinindusert aksotomi hos rotter (Beck et al., 1995; Kearns og Gash, 1995; Sauer et al., 1995) og delvis også etter systemisk administrasjon avN-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP)i mus (Tomac et al., 1995). Den økte forekomsten av nevronal apoptose og reduserte beskyttende effekter av nevrotrofiske faktorer, potensielt utløst av ulike patologiske faktorer, ligger til grunn for degenerasjonen av dopaminerge nevroner (Holden et al., 2006).

C. tubulosa er en urtemedisin som stammer fra flere planter av slekten Cistanche. Det er et viktig terapeutisk alternativ for nyremangelsyndrom som er nært knyttet til androgenhormoner i tradisjonell kinesisk medisin (TCM). Til dags dato har mye klinisk og grunnleggende forskning på C. tubulosa vist aktivitetene til nevrodegenerative sykdommer. Identifikasjon av TCM nyretonifiserende resepter i PD-behandling kan dermed gi en alternativ klinisk behandling for PD.Echinacoside (ECH)er en viktig bioaktiv komponent som finnes i den medisinske urten C. tubulosa. Studier har vist den terapeutiske effekten av glykosider av Cistanche og ECH,verbascoside(VER), og icariin (ICA) på Alzheimers sykdom (AD), PD og andre vaskulære demenspasienter (Urano og Tohda, 2010; Wang et al., 2013; Wu et al., 2014). Wu et al. (2014) antydet at C. tubulosa-ekstrakter som inneholdt nok ECH og akteosid forbedret den kognitive dysfunksjonen forårsaket av A -42 via blokkering av amyloidavsetning og reversering av kolinerg og hippocampus dopaminerg neuronal funksjon. Tao et al. (2015) fant detfenyletanoidglykosiderfra C. tubulosa (Ph Gs-Ct) forhindret cerebralt ødem i stor høyde ved å redusere protein- og mRNA-ekspresjonen av AQP4 i hjernevevet til rottemodeller.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA EKSTRAKT SNACKS FORBEDRER MINNE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Tidligere studier har vist at kinesiske urteforbindelser, inkludert de tre ingrediensene i C. tubulosa, epimedium og rhizoma polygonati, lindret skade på dopaminerge nevroner og økte nivåer av dopamin ved å regulere uttrykket av nevrotrofiske faktorer (Wu et al., 2013). Dermed er det ennå ikke kjent om de C. tubulosa-induserte nevrobeskyttende effektene er langvarige og i hvilken grad redning av nigrale DA-neuroner ved administrering av GDNF kan gi betydelig bevaring av motorisk atferd som er relevant for symptomatologien til PD-dyr. Denne studien brukte en TCM-nyretonifiserende oppskrift, C. tubulosa nanopowder, som har mottatt et nasjonalt patent (patentnummer: 2011103028541) i Kina og som tidligere har vist en viss terapeutisk effekt ved PD. Denne studien ble derfor designet for å undersøke de nevrobeskyttende og regenerative effektene av C. tubulosa-behandling og for å undersøke apoptosen på MES23.5-cellene og atferdsmessige definitive rotter, og reguleringen av GDNF, målt ved et batteri av måltester .

MATERIALER OG METODER

Materialer, reagenser og utstyr

C. tubulosa ble kjøpt fra Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Beijing, Kina. ECH, VER og ICA kom fra National Institutes for Food and Drug Control, Kina. Den dopaminerge nevroncellelinjen MES23.5 var en gave fra professor Biao Chen, Laboratory of Neurobiology, Capital Medical University, Beijing, Kina. Femti C57BL/6 hannmus (som veier 20–25 g hver) ble kjøpt fra Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (lisensnummer: SCXK2012-0002), Shanghai, Kina.

MPP+, MTT og glutamin ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA); DMEM/F12 medium og føtalt bovint serum ble kjøpt fra Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA); og MPTP, DA standard og homovanillinsyre (HVA) standard ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA). -actin, Bax, Bcl2, GDNF, GDNF familie reseptor alfa (GFR 1) og Ret antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, USA); 3,3'-diaminobenzidin (DAB) fargereagenssett ble kjøpt fra Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, Kina); og SDS-PAGE gelprøveforberedelsessett, ultrasensitiv forbedret kjemiluminescens (ECL) deteksjonssett og bicinchoninsyre (BCA) analyse ble kjøpt fra Beyotime Institute of Biotechnology (Beijing, Kina).

Denne studien brukte følgende instrumenter: ELX800 mikroplateleser (Bio Tek Winooski, VT, USA); CO2-inkubator (Heraeus, Hanau, Tyskland); Gel DOC 2000 gelbildeanalysesystem, elektroforesecelle og elektroforesetank (Bio-Rad, Hercules, CA, USA); DU-650 proteinanalysator (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA); 5417R høyhastighets kjølt sentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Tyskland); SXQM dobbel planetkulemølle (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, Kina); MM400 blandemølle (Retsch GmbH, Haan, Tyskland); Agilent 1200 høyytelses væskekromatografi (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); PowerPac Basic elektroforese, PowerPac Basic transmembranoverføringssystem, Universal Hood II kjemiluminescensbildeapparat, S1000 Thermal Cycler RNA omvendt transkripsjonssystem (Bio-Rad); Motic Med 6.0 vevs- og cellebildeanalysesystem (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, Kina).

Utarbeidelse avC. tubulosaNanopulver

C. tubulosa ble veid, deretter renset og dehydrert. Etter konvensjonell pulverisering ble C. tubulosa fint pulver ført gjennom en 200-nettsikt og frysetørket. En temperaturkontrollert vakuum- og høyenergikulemølle ble brukt for å tilberede C. tubulosa nanopowder. Først ble rå C. tubulosa nanopowder plassert i en vakuumkule-fresetank som var lastet med karbidslipekuler. Forholdet mellom malekulene og C. tubulosa nanopowder varierte fra 15:1 til 5:1. For å oppnå et fint pulver ble hastigheten og varigheten av høyenergikulemøllen satt til henholdsvis 300 rpm og 20 min. Det fine pulveret ble veid for bearbeiding av materialer i nanoskala og bearbeidet i blandemøllen med en frekvens på 25/s og oscillasjon på 20s for tre repetisjoner. PBS ble brukt til å oppløse og tilberede en 25 mg/mL stamløsning, etterfulgt av 30 minutter med ultralydbehandling, autoklavering og til slutt lagring ved -20◦C.

Kvalitetskontroll av de aktive komponentene tilC. tubulosaved HPLC

ECH og VER inneholdt gradienteluering med oktadecylsilan-bundet silika som fyllstoff, metanol som mobil fase A og 0.1 % maursyreløsning som mobil fase B. Deteksjonsbølgelengden var 330 nm. ICA inneholdt gradienteluering med oktadecylsilan-bundet silika som fyllstoff og acetonitril-vann (30:70) som mobil fase. Deteksjonsbølgelengden var 270 nm. Prøven, kontrollen og den negative kontrollen ble målt til 10 µL hver for testen.

Cellekultur og MTT-analyse for å måle levedyktigheten til MPP+-Behandlede celler

MES23.5-celler ble inokulert med 5 % føtalt kalveserum, 1 % glutamin, 2 % 50× Satos løsning og DMEM/F12-medium med 2 % penicillin/streptomycin. De ble inkubert ved 37◦C i en 5% CO2-inkubator med mettet fuktighet. Cellene ble isolert og passert med 0,25 % trypsin og cellesuspensjonen ble høstet i den logaritmiske vekstfasen. Isolerte celler med en tetthet på 1 × 105 ble sådd inn i polylysinbelagte 96-brønnplater, etterfulgt av tilsetning av forskjellige sluttkonsentrasjoner (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 og 800 µmol/L ) av MPP+-medier. MES23.5-celler som ble inkubert med normalt kulturmedium i 24 timer og 48 timer ble brukt som negative kontroller i in vitro-eksperimentene. Cellene fra de forskjellige behandlingsgruppene ble inkubert med MTT-reagens i 4 timer. Løsningen i brønnene ble deretter kastet og 150 µL DMSO ble tilsatt og oscillert i 10 minutter. Absorbansen til hver prøve ved en bølgelengde på 570 nm ble målt ved bruk av en automatisk mikroplateleser. Prosentandelen av cellelevedyktighet (%)=gjennomsnittlig absorbans for forsøksgruppen/gjennomsnittlig absorbans for den negative kontrollgruppen × 100 %.

Relevante konsentrasjoner av MPP+-medium ble tilsatt for 24-timesbehandlingen i MES23.5-celler ved å bruke samme tilnærming som for in vitro-kulturen. Etter behandlingen ble løsningen i brønnen kastet. Medier som inneholdt forskjellige konsentrasjoner (10, 50, 100, 200, 250, 500 og 1000 µg/mL) av C. tubulosa nanopowder ble tilsatt til MES23.5-cellene i forskjellige brønner og lot inkuberes i 24 timer og 48 timer. MES23.5-cellene som ble inkubert med normalt kulturmedium i 24 timer og 48 timer ble brukt som negative kontroller. MES23.5-cellene som ble inkubert med MPP+-medium ble brukt som bærer. Målingene ble utført i tre eksemplarer for hver prøve. Absorbansen til de tilsvarende behandlings- og kontrollgruppene ble målt for å beregne cellelevedyktighet.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA EKSTRAKT ANTI TRØTTHET PHGS75% ECH 30% ACT 12%

TH-ekspresjon målt ved immunocytokjemi

Når C. tubulosa nanopowder var i 100, 200 og 250 µg/ml, økte celleoverlevelsesraten betydelig (Figur 2G). I påfølgende eksperimenter testet vi derfor de tre konsentrasjonene: lavdose-, middeldose- og høydosegrupper. Tre replikasjoner ble testet for hver av C. tubulosa-gruppene. Steriliserte, polylysinbelagte dekkglass ble plassert i 6-brønnplater. Deretter ble 5 × 104 celler sådd i hver brønn og inkubert i 24 timer. Konvensjonelt ferskt medium ble erstattet i den normale kontrollgruppen og en sluttkonsentrasjon på 100 µmol/L MPP+ medium ble erstattet i de gjenværende behandlingsgruppene for å inkubere i 24 timer. Konvensjonelle ferske medier ble deretter erstattet i de normale kontroll- og bærergruppene, og sluttkonsentrasjoner på 100, 200 og 250 µg/mL C. tubulosa nanopowder ble inkubert med cellene i 24 timer i lav-, moderat- og høydose C. tubulosa behandlingsgrupper, henholdsvis. MES23.5-cellene i de forskjellige gruppene ble vasket tre ganger i PBS for å fjerne supernatanten og ytterligere fiksert i 4% paraformaldehyd i 15 minutter. Etter vask med PBS ble cellene inkubert med en peroksidaseblokker ved 37◦C i 30 minutter og deretter vasket igjen med PBS. En 0,2 % Triton X-100-løsning ble brukt for cellepermeabilisering i 10 minutter, etterfulgt av vasking med PBS. Normalt geiteserum ble tilsatt til hver prøve og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Det normale geiteserumet ble deretter fjernet og det primære antistoffet fortynnet 1:400 i PBS ble tilsatt til hver prøve og inkubert ved 4◦C over natten. Cellene i den negative kontrollgruppen ble inkubert med PBS ved 4◦C over natten. Etter vask med PBS ble cellene inkubert med biotinmerkede sekundære antistoffer i fuktighetskammeret ved 37◦C i 20 minutter. Hver prøve ble deretter vasket i PBS og merket med pepperrotperoksidase-streptavidin-konjugater (arbeidsløsning C) ved 37◦C i 20 minutter. Etter vask med PBS ble cellene farget med DAB-reagens i mørket i omtrent 1–10 minutter og utviklingen av en brun farge ble overvåket under lysmikroskopi. Hver prøve ble deretter vasket to ganger i destillert vann i 1–2 minutter og kjernene ble motfarget med hematoksylinløsning i 0,5–1 min. Etter grundig skylling av hver prøve i vann, ble cellene nedsenket i 1 % saltsyrealkohol for differensiering og 1 % vandig ammoniakk, etterfulgt av grundig vasking av cellene i vann. Cellene fra hver prøve ble deretter dehydrert i 70 % etanol i 2 minutter, 80 % etanol i 2 minutter, 90 % etanol i 2 minutter to ganger, 95 % etanol i 2 minutter to ganger og 100 % etanol i 2 minutter to ganger. Cellene ble deretter nedsenket i xylenløsning i 2 minutter to ganger og montert på en glassplate med nøytrale harpikser. Under lysmikroskopi gjennomgikk hver prøve bildefangst og tilfeldig utvalg av 5–10 effektive synsfelt for å bestemme ekspresjonen av utvalgte proteiner i dopaminerge nevroner indikert av intensiteten til de brune partiklene og for å semikvantifisere proteininnholdet med dets gjennomsnittlige gråverdi. .

Apoptosehastighet for MES23.5-celler målt ved flytcytometri

Adherente celler ble vasket én gang med PBS. For celleisolering ble en passende mengde EDTA-fri trypsinløsning tilsatt ved romtemperatur, og løsningen ble forsiktig pipettert for å la adherente celler løsne. Et cellekulturmedium ble deretter tilsatt for å stoppe trypsiniseringen. Blandingen ble overført til et nytt sentrifugerør og deretter sentrifugert i 5 minutter ved 1500 rpm for å samle de isolerte cellene. Etter å ha kastet supernatanten, ble cellepelleten forsiktig resuspendert ved bruk av PBS, og cellene ble talt. Omtrent 1 × 105 til 5 × 105 resuspenderte celler ble sentrifugert i 5 minutter ved 1500 rpm og supernatanten ble kastet. Fem mikroliter Annexin V-FITC-bindingsløsning ble tilsatt til cellepelleten for å forsiktig resuspendere cellene. Ytterligere 5 µL Annexin V-FITC ble tilsatt og blandet grundig. Fem mikroliter propidiumjodidløsning ble brukt til cellefarging ved inkubering ved romtemperatur i 10 minutter kort før flowcytometrien.

Western Blot Analyse forin vitro

Cellene ble delt inn i en normal gruppe, MPP+ behandlingsgruppe, lavdoseC. tubulosabehandlingsgruppe, moderat dose C. tubulosa behandlingsgruppe og høydose C. tubulosa behandlingsgruppe. Ekspresjonen av Bcl2 og Bax ble målt i hver. Totalt 1 × 105 celler per brønn i 6-brønnplaten ble brukt til modellering og behandling i hver gruppe før cellehøsting. Et blandet lysat, inneholdende RIPA-buffer, proteasehemmer og fosfatasehemmer, ble tilsatt for å lysere cellene i 3 0 minutter på is. Etter sentrifugering ble supernatanten brukt for proteinanalyse. Det totale proteinet ble kvantifisert ved å bruke en BCA-analyse og separert med 10 % SDS-PAGE. De separerte proteinene ble overført til en membran og inkubert med en 5% skummetmelkblokkerende buffer ved romtemperatur i 2 timer. Membranen ble deretter inkubert i primært antistoff (Bcl-2 0,34 mg/ml, Bax 0,11 mg/ml, 1:200 fortynning) ved 4◦C over natten. Etter et vasketrinn ble membranen inkubert i et sekundært antistoff (0,5 mg/ml, 1:5000 fortynning) ved 4◦C i 1 time og deretter i ECL-fremkaller i 2 minutter for konvensjonell utvikling. Kvantitet En programvare ble brukt for semikvantitativ analyse av proteinekspresjon.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR ANTI TRETTHET BESKYTTER LEVER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Eksperimentell dyremodellering og legemiddeladministrasjon

Femti spesifikke patogenfrie 8-uker gamle hannmus ble tilfeldig delt inn i fem grupper: en normal gruppe, MPTP-behandlingsgruppe (kjøretøy), lavdose C. tubulosa-behandlingsgruppe, moderat dose C. tubulosa-behandling gruppe, og høydose C. tubulosa behandlingsgruppe. Dyrene ble holdt ved 20–22◦C med fri tilgang til mat og vann. Musene i den normale gruppen ble intraperitonealt injisert med et likt volum av normalt saltvann i syv påfølgende dager. Musene i de andre behandlingsgruppene ble intraperitonealt injisert med MPTP (30 mg/kg/d) i syv påfølgende dager for å etablere bærere.

Under PD-modellering ble musene i C. tubulosa-behandlingsgruppene med lav dose, moderat dose og høy dose intragastrisk administrert tilsvarende kliniske volumer på 4 g/kg/d, 8 g/kg/d og 16 g/ kg/dC. tubulosa nanopowderhenholdsvis i 14 dager på rad. Musene i kontroll- og bærergruppene ble administrert intragastrisk ekvivalente volumer av normalt saltvann i 14 påfølgende dager. Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av den etiske komiteen ved Fujian University of TCM og ble utført i henhold til de internasjonalt aksepterte prinsippene for bruk og stell av laboratoriedyr. Alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelser hos dyr i denne studien.