Tydelig avbildning og kvantifisering av nyren i 3D
Feb 27, 2022
I flere tiår har målinger avnyremikroanatomi ved hjelp av 2-dimensjonale seksjoner har gitt oss en detaljert kunnskap om nyre morfologi under fysiologiske og patologiske forhold. Imidlertid har den raske utviklingen av vevsrensingsmetoder de siste årene, i kombinasjon med utviklingen av nye 3-dimensjonale avbildningsmodaliteter gitt ny innsikt inyrestruktur og funksjon. Denne oversiktsartikkelen beskriver en rekke nye innsikter inyreutvikling og sykdom oppnådd nylig ved bruk av disse nye metodiske tilnærmingene. For eksempel i utviklingennyredisse tilnærmingene har gitt nye forståelser av ureterisk forgreningsmorfogenese, nefronprogenitorcelleproliferasjon og -engasjement, interaksjoner mellom ureterisk spissceller og nefronprogenitorceller, og etablering av nefronsegmentering. I hel voksen musnyrer, vevsrensing kombinert med lysarkmikroskopi kan avbilde og kvantifisere det totale antallet glomeruli, et stort gjennombrudd på feltet. Lignende tilnærminger har gitt ny innsikt i strukturen til nyrevaskulatur og innervasjon, tubulointerstitiell remodellering, tap av podocytter og hypertrofi, cystedannelse, utviklingen av cellulære halvmåner og strukturen til den glomerulære filtrasjonsbarrieren. Mange flere fremskritt i forståelsen avnyrebiologi og patologi kan forventes ettersom flere rydnings- og bildeteknikker utvikles og tas i bruk av flere etterforskere.
Nøkkelord:3D-bilder; glomerulus; nyreutvikling; nefropatologi; vevsrensing; tubuli; nyre
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREFUNKSJONEN
Totalt antall nefroner i hvert normalt menneskenyrevarierer fra omtrent 200,000 til mer enn 2 millioner, 1 i gjennomsnitt omtrent 1 million. Disse nefronene så vel som de andre komponentene inyreinkludert samlekanaler, blodårer, interstitia og nervefibre er ordnet med utsøkt mikroanatomisk presisjon. 2 Dette presise mønsteret underbygger normalennyrefunksjonog helse, som kan bli alvorlig forstyrret når vevsarkitektur er endret på grunn av glomerulær eller tubulær hypertrofi eller krymping, nefrontap, medfødte abnormiteter, fartøysjeldenhet og interstitiell fibrose. En rekke avbildningsmetoder har bidratt til vår omfattende forståelse avnyremikroanatomi under utvikling og hos den friske og syke voksnenyre. For det meste har denne forståelsen kommet fra analyse av 2-dimensjonale (2D) seksjoner, enten de er lys- eller elektronmikroskopiske fysiske seksjoner eller konfokale optiske seksjoner. Kvantifisering av denne mikroanatomien har for det meste vært avhengig av stereologiske analyser av seksjoner som har gitt estimater av antall, lengder, overflatearealer og volumer av glomeruli, tubuli, kar, interstitia og deres cellulære komponenter. 3,4 Inntil nylig har 3D-visualisering avnyremikrostruktur var stort sett begrenset til konfokal mikroskopi, som muliggjør optisk seksjonering og 3D-rekonstruksjon opp til en dybde på 50 til 80 m m. Dessverre sprer brytningsegenskapene til protein- og lipidkomponenter i et vev lys og reduserer bildekvaliteten dramatisk når dybden øker. I løpet av de siste årene har en rekke rensemetoder blitt utviklet for å fjerne lipid- og pigmentinnhold i et vev og matche brytningsegenskapene til vev og monteringsmedier for å gjøre vevet gjennomsiktig. 5 Clearingmetoder varierer i kompleksitet fra inkubering av vev i ulike løsninger over en periode på timer til utvidede prosedyrer som involverer tilpasset elektrokjemisk utstyr. Vi henviser leserne til nylige anmeldelser 5,6 for en detaljert oversikt over gjeldende metoder, og papirene som er sitert her for spesifikke metoder og brukstilfeller.
Subcellulære strukturer og hele populasjoner av celler kan løses i fjernede hele organer eller tykke seksjoner. Nøyaktig avbildningsfunksjoner i renset vev krever spesialiserte mikroskoper og bildebehandling for å fange opp og rekonstruere volumetriske data fra prøver som kan variere fra hundrevis av mikron til centimeter i størrelse. Punkt skanning og spinn disk konfokale mikroskoper har blitt effektivt brukt til å avbilde funksjoner innenfor ryddetnyrevev, men lider av redusert oppløsning i Z-aksen og en progressiv reduksjon i fluorescensintensitet i dybden på grunn av en enkelt akse for belysning og bildebehandling. Teknikker for lysarkmikroskopi er spesielt egnet til å avbilde ryddet vev ettersom de muliggjør rask innsamling av store 3D-volumer og kan inkludere flervinkelbelysning og bildebehandling. Optisk projeksjonstomografi er en annen tilnærming som inkluderer flervinkelavbildning og digital rekonstruksjon for å produsere data der X-, Y- og Z-aksene til hver voxel har samme oppløsning. Uavhengig av den spesifikke tilnærmingen, gir vevsrensing og helmonteringsavbildning en ny mulighet til å utforske ukjente cellulære mikromiljøer og høyere ordens vevsstruktur. I denne anmeldelsen trekker vi frem noen ny innsikt inyreutvikling, voksennyrestruktur og patologi som er et resultat av vevsrensing etterfulgt av 3D kvantitativ analyse.
Ny innsikt i nyreutviklingTiår med genuttrykksprofilering og knockout-studier har ført til en detaljert forståelse av celletyper, genregulerende nettverk og signalveier som kontrollerer pattedyr.nyreutvikling. Denne kunnskapen informerte diagnostisering av medfødt sykdom og muliggjorde produksjon avnyrecelletyper fra pluripotente stamceller. 7 Men størrelsen, opasiteten og kompleksiteten til utviklingennyrepresenterte en betydelig barriere for nøyaktig å måle morfogenesen til dette organet og 3D-fordelingen av celler og proteiner i det. Anvendelsen av vevsclearing og multiscale imaging inyrehar muliggjort visualisering og kvantitativ analyse av ureterisk forgreningsmorfogenese, progenitorcellepopulasjoner og nefronbegavelse i intakte organer (figur 1). 8 Disse tilnærmingene underbygger en ny kapasitet for presisjonsfenotyping og åpne veier for å analysere de cellulære og molekylære driverne tilnyreutvikling og medfødt sykdom.
Avbildning og analyse av forgreningsmorfogenese i 3D.Etablering av ureteric treet er et definerende trekk vednyreutvikling og har blitt grundig studert ved bruk av musegenetikk og flatet utnyreeksplantasjonskulturer. Men å forstå hvordan individuelle gener bidrar til vekst, form og mønster av denne forgrenede epitelkanalstrukturen in vivo krevde kapasiteten til å avbilde og analysere dette komplekse nettverket over et bredt spekter av prøvestørrelser. Short et al. 8 tok opp disse problemene ved å bruke helmontert immunfluorescens, løsemiddelbasert clearing (benzylalkoholbenzylbenzoat) og avbildning av hele organer med optisk projeksjonstomografi. Bruker denne tilnærmingen for å ta 3D-øyeblikksbilder fra tidlig til midten avnyreutvikling, utviklet teamet tilpasset analyseprogramvare for å utlede enestående detaljer om uretertreet, inkludert spissnummer, grenvinkler og lengde, grenvolumer og antall generasjoner med forgrening fra intakte ureteriske trær (Figur 1c og d). 8 Opprinnelig brukt til å karakterisere og identifisere nye aspekter ved nyreforgrening, 9,10 forsøker pågående arbeid å definere prinsippene og nøkkelregulatorene som styrer grenmønsteret in vivo. 1
Koble stamfaderdynamikk til organmorfogenese med multiskala avbildning.Molekylære interaksjoner mellom ureterictip-celler og nefron stamceller spiller en viktig rolle i å etablere komplementet til nefroner som letternyrefunksjoni voksenlivet. Uinduserte nefronprogenitorer produserer faktorer som fremmernyrevekst gjennom ureterisk forgrening mens romlig begrensede signaler i ureterspissen både opprettholder nefronforløperens tilstand og induserer en undergruppe av disse progenitorene til å differensiere til et tidlig nefron. Disse interaksjonene driver en syklus med forgrening og nefroninduksjon som opphører rundt fødselen, når gjenværende nefronforfedre differensierer. Før vevsrydningsmetoder, vår forståelse av dynamikken tilnyremorfogenesen og den relative overfloden av stamcellepopulasjoner over tid var sterkt begrenset. Dette endret seg med utviklingen av multiskala avbildningstilnærminger ved bruk av utvidede immunfluorescensprotokoller, vevsrensing og avbildningstilnærminger for å kvantifiserenyreutvikling på cellulært (konfokalt) og hele organnivå (optisk projeksjonstomografi, lysark). 9,10 Det viste seg at satsene pånyreveksten varierer dramatisk med til å begynne med raske forgrenings- og spredningshastigheter som avtar i faser som korrelerer med reduksjoner i antall stamceller innenfor den nefrogene nisjen. 10 Tredimensjonal konfokal avbildning av fjernet hele menneskelige fosternyrer(uke 11) eller prøver franyrecortex (uke 11–23) bekrefter at denne nedgangen i nisjestørrelse er bevart på tvers av arter. 12 Ytterligere komparativ analyse av den nefrogene nisjen hos mennesker og mus i renset vev førte til en ny tidsbasert rekrutteringsmodell for nefrondannelse, der stamceller gradvis legges til et tidlig nefron og adopterer en segmentidentitet i henhold til rekkefølgen de ankommer i. . 13 I en annen studie fokusert på nefron-progenitor-engasjement, ble en hydrogel-basert vevsrensingsmetode (passiv Clear Lipid-utvekslet Acryl-amid-hybridized Rigid Imaging/Immunostaining/In situ hybridization-compatible Tissue-hYdrogel [CLARITY] 14 ) brukt for sin evne til å beholde fluorescens til en endogen tdTomat-reporter. Analyse av tdTomato-merking i det ryddede vevet viste at celler i det tidlige committerende nefronet kan gå tilbake til en stamfadertilstand, der tidligere resultater antydet at engasjement var ensrettet. 15 Dermed har vevsrydding forbedret vår forståelse av dynamiske utviklingsprosesser på tvers av skalaer og arter.
Presisjonsfenotyping. Fremskritt innen vevsrensing og kvantitativ analyse har muliggjort en ny kapasitet for presisjonsfenotyping. Statistisk robuste endringer i forgrening og nefrontall er identifisert i musemodeller med subtile fenotyper som Ret þ/? og Six2 þ/? mus (figur 2), som tidligere ble klassifisert som "normale". 10,16 Høyoppløselig konfokal avbildning av ryddet Wnt11 ?/?nyreridentifiserte en ny cellulær fenotype der nefronforløpere virker uorganiserte på grunn av manglende evne til å danne stabile cellulære bindinger med ureterspissen og differensiere for tidlig. 17 Disse metodene har også blitt brukt til å kvantifisere hvordan nye regulatorer av nefron stamcelletilstand som DNA-metyltransferase 1, mikroRNA Lin28 og Let7 og TSC1 påvirkernyreutvikling og nefronnummer. 18–20 Presisjonsfenotyping vil sannsynligvis bli et viktig verktøy i vår innsats for å forstå den additive effekten av genetiske og miljømessige faktorer som bidrar til lavt nefrontall og disposisjon for kroniskenyresykdom.
Matematisk modellering avnyremorfogenese. Dataene blir produsert fra den ryddede utviklingennyregir næring til en bølge av bildebasert matematisk modellering som forsøker å skjelne hvordan den makroskopiske formen og funksjonen til et vev oppstår fra molekylære interaksjoner mellom stamcellepopulasjoner. 11,21–23 Ytterligere anvendelse av hele organavbildning i renset vev vil være avgjørende for å forstå de molekylære og cellulære driverne til 3D-vevsmønster og kan ha nøkkelen til å forbedre strukturen og nøyaktigheten til stamcellemodeller avnyre.
3D-morfologi og patologi til den voksne nyrenDen intrikate morfologien til den voksnenyrebegrenser bruken av 2D morfologiske verktøy da de kan formidle ufullstendige eller misvisende oppfatninger av 3D-struktur. Her diskuterer vi noen av de viktige metodiske fremskrittene de siste årene som nå tillater robust 3D-analyse av strukturer hos voksnenyre, alt fra intaktnyrerhelt til komponenter i den glomerulære filtrasjonsbarrieren (Figur 3). 2
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREFEILT
Nephron nummer og størrelse.Mennesketnyreviser et høyt nivå av intra- og interindividuell variabilitet i nefronantall og -volum, som er beskrevet i obduksjonsstudier fra forsøkspersoner uten åpenlystnyresykdommer1,30,31 og har vært knyttet til utviklingsforstyrrelser. I flere tiår har gullstandardverktøyet for å kvantifisere nefrontall i eksperimentelle og menneskelige prøver vært disektor-/fraksjoneringsmetoden, en designbasert stereologisk metode. 3,4 Selv om denne tilnærmingen er nøyaktig og presis, er den også praktisk, tidkrevende og krever betydelig opplæring. Av denne grunn har det blitt foreslått alternative tilnærminger for å utvikle effektive metoder som kan gi endepunkter av høy kvalitet: 32 for eksempel kombinasjoner av optiske rensemetoder, inkludert hydrofobe (tidligere kjent som løsemiddelbasert), hydrofil eller hydrogelbasert, med avanserte lysmikroskopi (f.eks. konfokal, multifoton eller lysark).
Så vidt vi vet, ble den første rapporten som kombinerte optisk clearing og lysarkmikroskopi for analyse av nefrontall og -størrelse publisert av Klingberg et al. 24 i et landemerkepapir som inneholdt flere viktige fremskritt. For det første introduserte denne rapporten etylkanel, et ufarlig løsningsmiddel som kunne erstatte giftige kjemikalier som benzylalkohol-benzylbenzoat, som inntil da regelmessig ble brukt i hydrofobe ryddeprotokoller. For det andre utførte etterforskerne nefrontelling i intakt musnyrer in en aggressiv og progressiv modell av immun-mediertnyresykdom, identifisere nefrontap under sykdomsforløpet. I tillegg ble betydelige skritt mot datastyrt automatisering av bildesegmenteringsalgoritmer introdusert, noe som ga en vei til betydelige effektivitetsforbedringer. Nylig har Østergaard et al. 25 presenterte en lignende hydrofob tømmemetode kombinert med lysarkmikroskopi og automatisert bildesegmentering som gir både totalt nefronantall og enkelt glomerulært volum i en musemodell av diabetisk nefropati. Videre viste denne studien elegant funksjonell merking av proksimale tubuli via in vivo albumininjeksjon for å visualisere den glomerulartubulære overgangen og en enkel protokoll for korrelativ histopatologi i de samme optisk rensede prøvene. Denne rapporten viser fleksibiliteten til disse protokollene, som er i ferd med å bli flerlags rørledninger for omfattende vevsprofilering.
Renal vaskulatur og innervasjon.Følger spor av forgrenet vaskulatur eller nervefibre hos den voksnenyreer nesten umulig i 2D konvensjonell histologi, da størrelsen på organet og kompleksiteten i den strukturelle distribusjonen krever omfattende og ekspert seriesnitt. Nylig har Huang et al. 33 rapporterte et kationisk nær infrarødt fluorescerende fargestoff (MHI148-PEI) for å spesifikt merke blodårer, som kan kombineres med en modifisert og akselerert clearing-protokoll basert på etylcinnamat for å forkorte vevsbehandlingstiden. Denne tilnærmingen åpner nye veier for vaskulær forskning inyre,spesielt når høyoppløselig bildebehandling i 3D er nødvendig. Tilsvarende har Hasegawa et al. 26 brukte Clear Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails og Computational Analysis (CUBIC) sammen med et spesialbygd lysarkmikroskopisystem for å identifisere fordelingen av sympatisk innervasjon i den intakte musenyren. Sympatiske nerver var primært fordelt rundt arterier. Etter 10 dager med iskemi eller reperfusjonsskade, ble sympatisk innervasjonstetthet signifikant redusert, og korrelerte med reduserte noradrenalinnivåer inyrevev. Disse endringene vedvarte delvis 28 dager etter den første skaden, noe som tyder på at kontinuerlige sympatiske endringer kan bli funnet under progresjonen av kroniskenyresykdom.
Tubulointerstitiell ombygging.Det renale tubulære systemet er spesielt vanskelig å analysere i 3D. Den kronglete og komplekse morfologien utgjør flere utfordringer for konvensjonelle metoder basert på seriesnitt og standard lysmikroskopi. Imidlertid tillater optisk clearing analyse av intakte tubuli og deres omkringliggende mikromiljø. Saritas et al. 34 utførte en kombinasjon av hydrogelbasert og hydrofob optisk clearing etterfulgt av avansert lysmikroskopi og semiautomatisk 3D-analyse for å karakterisere distal tubulær ombygging på grunn av kaliummangel i kosten. Etterforskerne kvantifiserte tubulær hyperplasi og oppdaget en økning i prolifererende celler i tubulointerstitium. Denne studien utnyttet allsidigheten til både optisk clearing og
Figur 3| Tredimensjonal (3D) morfometri i den voksne nyren. (a) Telling av nefroner i hele nyrer ved bruk av CD31-merking av endotelceller. Panelet viser en 3D-rekonstruksjon (til venstre), en optisk seksjon i en todimensjonal (2D) visning (midt), og spesielle områder som viser enkelt glomeruli i en sammenligning mellom lysarkmikroskopi (LSFM) og konfokal og 2- foton (2P) mikroskopi. Tilpasset med tillatelse fra American Society of Nephrology, fra Journal of the American Society of Nephrology, Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy, Klingberg A, Hasenberg A, Ludwig-Portugall I, et al. ., bind 28, utgave 2, 2017; tillatelse formidlet gjennom Copyright Clearance Center, Inc. 24 (b) Dimensjonering av glomeruli med romlig registrering – fargekoding representerer glomerulær størrelse, der rødt er det største objektet og rosa det minste. Tilpasset med tillatelse fra American Society of Nephrology, fra Kidney360, Automated Image Analyzes of Glomerular Hypertrophy in a Mouse Model of Diabetic Nephropathy, Østergaard MV, Sembach FE, Skytte JL, et al., bind 6, utgave 6 , 2020; tillatelse formidlet gjennom Copyright Clearance Center, Inc. 25 (c) Sporing av vaskulatur og innervasjon, med en 3D-rekonstruksjon av en intakt nyre med immunmerking av sympatiske nerver (grønn), vaskulatur (magenta) og sammenslått (venstre). Tilpasset fra Kidney International, bind 96, utgave 1, Hasegawa S, Susaki EA, Tanaka T, et al., Omfattende tredimensjonal analyse (CUBIC-nyre) visualiserer unormale nyre sympatiske nerver etter iskemi/reperfusjonsskade, side 129–138, Copyright ª 2019, med tillatelse fra International Society of Nephrology. 26 (d) Podocyttmorfometri i individuelle glomeruli ved bruk av immunmerking for podocyttspesifikk markør p57 (grønn) og DNA-markør 4 0,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Panelene viser (til venstre) en 3D-rekonstruksjon og (til høyre) de gjengitte overflatene. Tilpasset med tillatelse fra American Society of Nephrology, fra Journal of the American Society of Nephrology, Validation of a Three-Dimensjonal Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli, Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al., bind 27, utgave 10, 2016; tillatelse formidlet gjennom Copyright Clearance Center, Inc. 27 (e) Cellulær dynamikk ved bruk av avstamningssporing, viser podocytter (helt til venstre), parietale epitelceller (PECs) som danner cellulære halvmåner i 3D (midt-venstre), en 2D-visning av PEC-er som invaderer den glomerulære siden med vaskulær skade (midt til høyre), og en 2D-visualisering av det rørformede utløpet (helt til høyre). Tilpasset fra Kidney International, bind 96, utgave 2, Puelles VG, Fleck D, Ortz L, et al., Ny 3D-analyse ved bruk av optisk vevsrensing dokumenterer utviklingen av murin raskt progressiv glomerulonefritt, side 505–516, Copyright ª 2019, International Society of Nephrology, under CC BY-NC-ND-lisensen (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 28 (f) Visualisering av spaltemembranen ved økende forstørrelser fra venstre til høyre. Tilpasset fra Kidney International, bind 99, utgave 4, Unnersjö-Jess D, Butt L, Höhne M, et al., A fast and simple clearing and swelling protocol for 3D in-situ imaging av nyren på tvers av skalaer, side 1010–1020 , Copyright ª 2021, International Society of Nephrology, under CC BY-NC-ND-lisensen (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 29 For å optimalisere visningen av dette bildet, se nettversjonen av denne artikkelen påwww.kidney-international.org.
lysmikroskopi for å utføre tubulær analyse i intakte nyrer ved bruk av hydrogel-innstøping og lysarkmikroskopi, samt enkeltcelle kvantifisering i nyreskiver ved bruk av hydrofob clearing og konfokal mikroskopi, da hver kombinasjon var bedre egnet for det spesifikke forskningsspørsmålet. Kombinasjoner av optisk clearing og avansert lysmikroskopi ble brukt av Tahaei et al. 35 som karakteriserte seksuell dimorfisme i lengden av den distale innviklede tubuli, som kan bestemme dens evne til å tilpasse seg fysiologisk stress, og Schuh et al. 36 som avslørte aksiale forskjeller i proksimal tubulusligandopptak og endolysosomal funksjon, og fremhevet at S1-segmentet er høyt spesialisert til å reabsorbere proteiner via reseptormediert endocytose. I en fersk studie har Blanc et al. 2 analyserte en modell for cystedannelse, og viste at cyster utviklet seg bare i spesifikke nefronsegmenter, som bestemte deres form og var lokalisert tilstøtende normale ikke-dilaterte tubuli. Totalt sett har vi nå flere eksempler på direkte anvendelse av optisk clearing for systematisk analyse av det tubulointerstitielle rommet.
Podocytt tap og hypertrofi.Glomerulus gir et unikt eksempel for analyse av intakte funksjonelle enheter i et organ. Spesielt har studiet av utarming av podocytter dratt direkte nytte av disse teknologiske fremskrittene ettersom de designbaserte metodene med gullstandard krever betydelig investering av tid og ressurser. 37 Det første verktøyet for 3D-podocyttmorfometrisk analyse av intakte museglomeruli kombinert immunmerking avnyreskiver ved bruk av en modifisert protokoll for indirekte immunfluorescens, hydrofob optisk clearing og konfokal mikroskopi, noe som lettet kvantifiseringen av totalt podocyttantall i hele individuelle glomeruli med kjent volum. Vi mener denne tilnærmingen er ideell for studiet av prosesser som påvirker en spesifikk undergruppe av strukturer (f.eks. tap av podocytter som fører til fokal og segmentell glomerulosklerose). 27 Den samme teknikken ble senere brukt for å karakterisere rollen til podocytthypertrofi som en kompenserende respons etter tap av podocytter, en mekanisme som formidles av pattedyrmålet til rapamycin-signalveien. 38 Mens disse 2 studiene fokuserte på analyse av glomerulære podocytter, kan denne rørledningen basert på konvensjonell immunmerking brukes til å karakterisere morfologiske endringer av enhver celletype ved høy romlig oppløsning.
Utviklingen av cellulære halvmåner.Et annet viktig verktøy som måtte integreres i verktøykassen for 3Dnyremorfometri er genetisk avstamningssporing. De fleste optiske rensemetoder har en tendens til å indusere en viss grad av fluorescensslukking (som varierer fra mild til alvorlig). 6 Vi presenterte nylig en protokoll som kombinerer avstamningssporing, optisk clearing og multifotonmikroskopi for den omfattende analysen av podocyttap og parietal epitelcelleaktivering. 28 I denne studien ble podocyttap identifisert som et trekk ved eksperimentell halvmånenesefritt ved bruk av metabolsk merking av podocytter med forbedret grønt fluorescerende protein. Utviklingen av cellulære halvmåner ble visualisert og kvantifisert basert på spredning og migrasjon av parietale epitelceller, som også ble preget av forbedret grønt fluorescerende protein og sporet i løpet av en eksperimentell modell av halvmånenefritt. Analyse av intakte glomeruli tillot identifisering av fokalt podocytt-tap og lesjonsdannelse, som utviklet seg til tubulære okklusjoner av parietale epitelceller, noe som førte til dannelse av atubulære glomeruli. Denne studien baner vei for fremtidige studier av komplekse immun-epiteliale interaksjoner innen intaktnyrer.
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRE DIALYSEN
Glomerulær filtreringsbarriere.Et viktig diagnostisk verktøy for rutinevurdering av glomerulære sykdommer er ultrastrukturell analyse av nyrebiopsier ved hjelp av elektronmikroskopi. Et alternativ til elektronmikroskopi kan finnes innen ekspansjonsmikroskopi, som per definisjon har som mål å øke den optiske oppløsningen ved å øke vevsdimensjonene. Gjennom årene har Unnersjo-Jess et al. 39,40 har gitt flere protokoller for visualisering av nanoskalastrukturer inyre.Nylig rapporterte disse etterforskerne om en rask og enkel prosedyre for 3D-visualisering avnyremorfologi, som kombinerer optisk clearing og vevsekspansjonskonsepter for å løse nanoskalastrukturer ved bruk av konvensjonell konfokalmikroskopi. 29 Denne protokollen ble brukt for å visualisere og kvantifisere flere patologiske funksjoner hos mus og menneskernyrebiopsier inkludert utsletting av fotprosesser, endringer i den glomerulære basalmembranen, spaltediafragmalengde, IgG-avleiringer og klassiske patologiske trekk (f.eks. glomerulo-sklerose, tubulointerstitiell fibrose og tubulær atrofi). Oppsummert tillater denne metoden multiskala visualisering og kvantifisering av nyrepatologi ved hjelp av en enkel metode og tilgjengelige bildeanalyseverktøy. Skalerbarheten og implementeringen av denne tilnærmingen i klinisk praksis vil sannsynligvis bli bestemt av behovet for avansert lysmikroskopiutstyr og utviklingen av automatiserte bildeanalyseverktøy.
Konklusjon
Det nåværende spekteret av vevsrensingsmetoder inkluderer enkle teknikker som kan implementeres i de fleste laboratorier for å forbedre 3D-avbildning på vanlig tilgjengelige mikroskoper. Etter hvert som mulighetene som tilbys av disse nye tilnærmingene blir tydelige, forventer vi et bredere opptak av spesialiserte mikroskopisystemer for å effektivt avbilde ryddet vev med høy oppløsning og utvikling av skreddersydd forskning og kliniske arbeidsflyter for å løse spesifikke spørsmål. Feltet nevrovitenskap har fungert som et testområde for klarerte vevsavbildningsmetoder og -applikasjoner. Automatisert bildeanalyse, nye tilnærminger for å studere cellulær tilkobling, og vevsomfattende gen- og proteinekspresjonsatlas-prosjekter er utviklet i denne sammenhengen. Det er sannsynlig at lignende tilnærminger vil gi ny innsikt i den cellulære anatomien og gjensidig avhengighet av cellepopulasjoner i utviklings- og voksnenyre.
Praktiske begrensninger for disse fremskrittene inkluderer kostnadene for bildebehandlingsmaskinvare og vanskeligheter med å håndtere, lagre og analysere store datasett. Andre begrensninger oppstår fra manglende reproduserbarhet av farging med vev varierende påvirket av fikseringsforhold og antistoffmerking. Som et resultat er det behov for at nye 3D-analyser vurderes kritisk og sammenlignes med etablerte metoder. Til tross for de imponerende fremskrittene i vurderingennyreutvikling og voksennyrestruktur og sykdom fremhevet i denne gjennomgangen, tror vi at det beste innen vevsrensing og 3D-avbildning ennå ikke er kommet og sannsynligvis vil være et spennende vekstområde fornyreforskning i flere tiår fremover.