Clr-f uttrykk regulerer nyreimmun og metabolsk homeostase Ⅲ

Diskusjon

Betennelse og immuncellemediertskade spiller en ledende rolle i utviklingen og progresjonen av nyreskade og dysfunksjon. I denne studien rapporterer vi et krav om Clr-f i vedlikehold avnyrehelseog funksjonsom en iboende homeostatisk kontroll motimmun- og metabolsk-mediert nyreskade. Våre funn viser immuncelleinfiltrasjon, og immunglobulin- og komplementproteinavsetning i nyrene til mus med Clr-f-mangel. Disse immunfunksjonene til Clr-f-mangelfulle mus er sammenkoblet med det aldersassosierte utseendet til tubulære og glomerulære lesjoner, ektopisk lipidakkumulering og dysregulering av en rekke transkripsjonelle prosesser.

Klikk for å cistanche herba for nyresykdom

Clr-proteinene som er kodet i NKC blant deres genetisk koblede NKR-P1-reseptorer har vært fokus for studien som ikke-redundante MHC klasse I-uavhengige mediatorer av manglende selvgjenkjenning av NKR-P1-uttrykkende immunceller9,27–31. Det økte uttrykket av utvalgte Clr-proteiner som respons på cellestress er også rapportert å funksjonelt begrense immunresponsene til vevsresidente immunceller7,12,32. Følgelig ble intestinal Clr-f antatt å bidra til immuntoleranse i det ellers svært immunogene tarmmiljøet gjennom dets interaksjon med de hemmende NKR-P1G-reseptoruttrykkende intraepiteliale lymfocytter7. Arbeid utført av Leibelt et al. viste at mus utfordret med poly(I:C) viste økt Clr-f-ekspresjon og at Clr-f/NKR-P1G-interaksjoner in vitro er sterkt hemmende for NKR-P1G-uttrykkende celler. Sammen kan disse funnene tolkes som en potensiell mekanisme der Clr-f kan forhindre reaktiviteten til intestinale intraepiteliale NKR-P1G positive undergrupper mot epitelbarrieren som stadig provoseres av mikrobiell stimuli7.

Generasjonen av Clr-f-mangelfulle mus ga oss den første muligheten til å vurderefunksjonelle implikasjonerav Clr-f-ekspresjon in vivo og tillot oss å undersøke de potensielle immunhomeostatiske rollene til Clr-f i nyrene. Nyreskaden observert i Clr-f−/− mus stemmer overens med modellen om at nedreguleringen av Clr-f fungerer som en indikator på cellestress og skade som frigjør begrensninger på NKR-P1G-uttrykkende efektorceller. Økningen i NKR-P1G på T-celler i nyrene til Clr-f−/−-mus tyder på at enten NKR-P1G-ekspresjon økes blant nyreboende T-celler i fravær av Clr-f, eller at nyrene til Clr- f-/- mus blir utsatt for infiltrasjon av NKR-P1G-uttrykkende T-celler. Fraværet av en påvisbar endring i tilstedeværelsen eller distribusjonen av NKR-P1G-uttrykkende celler i tarmen til Clr-f−/− mus kan tyde på at de funksjonelle konsekvensene av NKR-P1G: Clr-f interaksjon i tarmen er begrenset til kontroll av immunreaktivitet i sammenheng med infeksjon i stedet for immuntoleranse. Alternativt kan redundante interaksjoner også kontrollere aktiviteten til NKR-P1G-uttrykkende celler. Dette støttes av funn om at NKR-P1G binder seg ikke bare til Clr-f, men også til Clr-d og Clr-g33, hvor sistnevnte er moderat uttrykt i vevet i både nyre og tarm6. Mens funnene våre avslører et krav til Clr-f for å beskytte mot autoimmun nyreskade, er den NKR-P1G-medierte rollen i de autoimmune nyrepatologiene til Clr-f−/− mus ufullstendig. Spesielt, selv om det er en økning i NKR-P1G-uttrykkende T-celler i nyrene til Clr-f−/−mus, er forskjellen underveldende. Det er mulig at en alternativ reseptor deltar i overvåkingen av Clr-f i nyren. For fullt ut å adressere denne kontrollaksen i nyrehomeostase, er det nødvendig med ytterligere undersøkelser

Immun-mediert nyreskade er karakterisert ved en infiltrasjon av inflammatoriske celler i det interstitielle rommet eller til glomerulus34. Nyreakkumuleringene av monocytter, B- og T-celler, anti-glomerulære antistoffer, forhøyede IL-12- og IFN-cytokiner og ulike glomerulære patologier hos Clr-f−/−-mus ligner mye på det autoimmune landskapet til LN-musemodellene ( dvs. MRL-Faslpr)35–37. Selv om Clr-f−/− nyrer viser IgA-dominerende mesangiale avsetninger med assosiert IgM- og IgG-avsetning, og klynging av Clr-f−/− og IgAN transkripsjonsprofiler, er det sannsynligvis for tidlig å antyde at disse fenotypene er indikasjoner på en type CKD med IgAN38. Snarere er disse skadene, sammen med tilstedeværelsen av mesangiolyse, GBM-fortykning og podocyttdød i Clr-f−/− nyrer samt tubulointerstitielle endringer, fettakkumulering og den betydelige dysreguleringen i metabolske veier elementer som er felles for en rekke patologier. avledet fra metabolske defekter forverret av immunsystemet37,39,40. Uavhengig av den underliggende årsaken eller sykdomstypen til Clr-f−/− musenyredysfunksjon, ser det ut til at Clr-f spiller en dempende rolle mot utviklingen av autoimmunitet med en klar glomerulonefritt-relatert patologi.

Vår undersøkelse av Rag1-/-Clr-f-/-musene indikerer et fremtredende bidrag fra T- og B-celle-uavhengige mediatorer til de autoimmune responsene til Clr-f-/- mus. Spesielt var akkumuleringen av periglomerulære CD11c+-celler, F4/80+-celler og NKp46+-celler enda mer uttalt i fravær av T- og B-celler og korrelerte med en signifikant tilstedeværelse av glomerulær skade. Dette antyder at mens T- og B-celler kan bidra til nyreskadelig betennelse og autoantistoffkomplekser, kan det hende at disse hos Clr-f−/− mus ikke er sentrale determinanter for patologi, men enten sekundære bidragsytere til den inflammatoriske aktiviteten til andre immunceller eller potensielt tjene en immunregulerende rolle i mus som mangler Clr-f. Dette står i kontrast til bevis fra ddY-musemodellen av IgAN som viser en sterk T1-polarisert respons, med IFN-produserende T-celler som øker med alderen og progresjonen av glomerulær skade41. Nyreinfiltrasjonen av B-celler i Clr-f-mangelfulle mus har også blitt vist i musemodeller av SLE42. Til dags dato er det uklart om B-celler i nyrene bidrar til den skadelige betennelsen ved CKD eller spiller mer regulerende roller43. Nyere bevis på CKD hos eldre pasienter fant at reduksjoner i B-cellepopulasjoner var assosiert med progresjon av nyresykdom44. Bevis fra både T- og B-celler har vist seg å ha immundempende aktivitet i autoimmune nyresykdommer45,46, og derfor krever i hvilken grad de bidrar til eller regulerer patologiene til Clr-f−/− mus ytterligere undersøkelser.

Våre funn viser sammen et behov for Clr-f-ekspresjon i det tubulære epitelet til de proksimale kronglete tubuli, podocytter og/eller tarmepitelet. Tap av Clr-f-ekspresjon fører til en uttalt autoimmun og inflammatorisk kaskade som fører til nyreskade og tilhørende fett. Immunresponsene fremkalt ved tap av Clr-f ser ut til å være T- og B-celle-uavhengige. Samlet sett kan en funksjonell rolle for Clr-f i nyren ses for seg som et hemmende molekyl for overvåkende efektor-immunceller i nyren slik de er plassert i tarmen, eller som enindre regulator av tubulær cellefunksjon.

Materialer og metoder Mus.

Alle mus ble holdt i et dedikert patogenfritt miljø. C57BL/6 (WT) og B6.129S7- Rag1tm1Mom /J (Rag1−/−) mus ble anskaffet fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Mus som bar de kombinerte nullmutasjonene i Rag1 og Clr-f (Rag1−/−;Clr-f −/−) ble generert ved å krysse Clr-f-mangelfulle (Clr f −/−) mus med (Rag1−/−) mus . All avl og manipulasjoner utført på dyr var i samsvar med universitetets retningslinjer og godkjent av Dalhousie University Animal Ethics Committee og Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Ottawa. Alle dyrestudiedesign, eksperimenter og rapportering ble utført i samsvar med ARRIVE-retningslinjene.

Generering av Clr-f-defekte mus. Clr-f-mangelfulle (Clr-f −/−) mus ble generert ved homolog rekombinasjon av en målrettingskonstruksjon som inneholdt en foxed fosfoglyseratkinase (PGK) -neomycinkassett og genomisk sekvens som spenner over ekson 3, 4 og en del av ekson 5 av Clr-f gen. Den komplette målrettingskonstruksjonen ble bekreftet ved sekvensering ved Ottawa Hospitals Research Institute (OHRI) før elektroporering i C57BL/6 Bruce-4 embryonale stamceller (ES). ES-klonevalg ved G{{10}}resistens ble utført av IRCM (Montreal Clinical Research Institute) Transgenic Core Facility (Montreal, QC, Canada). I mellomtiden ble 5'- og 3'-Clr-f-probene testet i en restriksjonsfragmentlengdepolymorfisme (RFLP)-analyse ved bruk av tymisk genomisk DNA fra en WT B6-mus, som ble fordøyd med henholdsvis BamHI og PstI. Fordøyd DNA-fragmenter ble oppløst på 1% agarosegel og overført til nylonmembranblotter. Clr-f cDNA-prober ble merket med radioaktivt 32P-dCTP (Perkin Elmer, Guelph, ON, Canada) ved å bruke NEB lot kit (New England Biolabs, USA). Blotter ble probet med 32P-merkede Clr-f cDNA-prober i en hybridiseringsløsning (10% (vekt/volum) dekstransulfat; 1 M NaCl; 1% SDS). Hybridisering ble utført over natten ved 65 grader og vask etter hybridisering ble utført med en løsning som inneholdt 2 x SSC og 1 % SDS forvarmet til 65 grader. Te blots ble eksponert for fotografiske filmer for å avsløre hybridiseringssignalene (fig. S1A, S3B). Membranene ble strippet med 0,2 % SSC/0,2 % SDS i 30 minutter ved 85 grader mellom forskjellige hybridiseringer. Neomycin-resistente kloner ble screenet ved Southern blot-analyse, og en målrettingseffektivitet på ~15 % ble observert. Utvalgte ES-kloner ble mikroinjisert i blastocyster ved IRCM Microinjection Service Facility for å generere de kimære Clr-flox-grunnleggermusene. Musene ble screenet ved Southern blot-analyse og ble deretter avlet med B6 hunner for å produsere Clr-fwt/lox heterozygote mus. Heterozygote mus ble interavlet for å oppnå Clr-flox/lox-mus. For å fjerne neomycinkassetten ble Clr-flox/lox-mus avlet med homozygote CMV-cre-transgene mus på B6-bakgrunn (Jackson Laboratory). Den resulterende doble heterozygote CMV-CreTg/0; Clr-f−/+ mus ble interavlet for å produsere Clr-f−/− mus som manglet CMV-cre transgenet. Mus ble genotypet ved bruk av spesifikke primere (tabell 1, fig. S1B, C og fig. S3C, D). PCR-amplifisering ble utført ved bruk av AccuStart II Taq DNA-polymerase (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, USA). PCR-blandingen ble fremstilt etter produsentens instruksjoner. Fenol/kloroform-ekstrahert øre-DNA ble brukt som maler. Følgende PCR-syklusparametere ble brukt: 30 amplifikasjonssykluser på 94 grader i 40 s, 60 grader i 45 s, 72 grader i 60 s. WT og Clr-f −/− kullkamerater ble brukt i alle eksperimenter med mindre annet er angitt.

In situ hybridisering.

In situ hybridiseringsanalyser av Clr-f ble oppnådd ved å klone full-lengde sense-tråden CDS og Clr-f-omspennende antisense-tråd inn i en pGEM-T Easy-vektor som beskrevet tidligere. Digoxi genin-merkede antisense- og sense-RNA-prober ble transkribert fra lineariserte plasmider som koder for Clr-f-genet med T7-polymerase ved bruk av DIG RNA-merkingsblanding (Roche, Basel, Sveits). Vev ble samlet fra voksne B6-mus og ble fiksert enten i 10% formalin ved RT eller i 4% paraformaldehyd ved 4 grader med forsiktig risting i opptil 24 timer. Vev ble deretter innebygd i parafin og 4 µm seksjoner ble preparert på objektglass. Vevsglass ble dekarbonisert ved behandling med 0.2 N HCl i 15 minutter og 30 µg/mL proteinase K ved 37 grader i 20 minutter. Vev ble fiksert i 4 % PFA i 10 minutter etterfulgt av behandling med 0,25 % eddiksyreanhydrid i 0,1 M trietanolamin to ganger i 5 minutter hver. Objektglass ble deretter forhåndshybridisert med hybridiseringsløsning (50 % (v/v) formamid/5×SSC, pH 4,5; 2 % (w/v) blokkeringspulver (Roche); 0,05 % (v/v) CHAPS; 5 mM EDTA; 50 µg/ml heparin; 1 µg/mL gjær-RNA) i en 58 graders ovn i minst 1 time, og deretter inkubert med hybridiseringsløsning som inneholder 500 ng/ml digoksigenin-merket probe over natten ved 58 grader. Post-hybridiseringsvasker ble utført med 50 % formamid/2× SSC, pH 4,5 ved 55 grader 3× i 20 minutter hver, og objektglass ble farget med sau-anti-digoksigenin alkalisk fosfatase-konjugert antistoff ved 1:1000 fortynning i blokkeringsløsning ( Roche). Fargeutvikling ble utført ved å tilsette nitroblått tetrazolium/5-brom, 4-klor og 3-indoylfosfat (NBT/BCIP, Roche)-substrater til objektglassene. Lysbildene ble holdt i mørket ved RT til optimale signaler dukket opp. Kontrollmerking ble utført ved bruk av en sense-streng-probe og konkurrerende bindingsstudier med sense- og antisense-probe bekreftet spesifisitet. Objektglass ble deretter motfarget med lysegrønt eller metylgrønt og visualisert under et lysmikroskop.

RT-PCR. Nyrevev fra alders- og kjønnstilpassede WT- og Clr-f −/− mus ble skåret ut, skylt med PBS og frosset ved -80 grad. RNA ble isolert fra frosset vev ved å bruke RiboZol RNA-ekstraksjonsreagens (AMRESCO Inc., West Chester, PA, USA) etter produsentens instruksjoner. Omtrent 1 ug RNA ble transkribert til cDNA ved bruk av et Verso cDNA-sett (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). PCR-amplifisering ble utført på 1 μL cDNA-produkt ved bruk av spesifikke primere (tabell 1). PCR-betingelser som ble brukt var 94 grader i 30 sekunder, 58 grader i 30 sekunder, 72 grader i 60 sekunder og 35 amplifikasjonssykluser. PCR-produkter ble visualisert på 1% agarosegel farget med etidiumbromid (fig. 1C, fig. S3A).

Immunhistokjemi.

Nyrevev av alders- og kjønnstilpassede WT- og Clr-f −/−-mus ble avparafinisert ved tre 5-minutters inkubasjoner i xylen, to 5-minutters inkubasjoner i 100% etanol, etterfulgt av 90 % etanol, deretter 80 % etanol og til slutt 70 % etanol. Objektglassene ble rehydrert ved vasking i destillert vann (20 fall), og varmeindusert epitoputhenting ble utført ved bruk av en trykkoker i sitratbuffer (pH 6,0). Endogene peroksidaser ble blokkert med 3% hydrogenperoksid i sterilt vann i 10 minutter, og proteiner ble blokkert ved bruk av Background Sniper (Biocare Medical, Pacheco, CA, USA). Seksjoner ble deretter inkubert med rotte anti-mus monoklonale anti-Clr-f antistoffer7 ved 4 grader over natten. Neste dag ble objektglassene skylt med 0,1 M PBS og inkubert i 1 time i sekundære antistoffer. Farging ble utviklet ved bruk av et Geit-on-Rodent HRP-Polymer-sett (Biocare Medical) og Betazoid DAB Bufer (Biocare Medical), etterfulgt av hematoxylin-motfarging. Den samme prosessen ble brukt til å farge nyrevevssnitt for IHC-merking av NKp46+- og CD3+-celler, ved bruk av anti-NKp46 (eBioscience, Santa Clara, CA, USA, klon 29A1.4, CAT# 48-3351-82) og anti-CD3 (BioLegend CAT#100,327) henholdsvis som primære antistoffer. IHC-merking av F4/80 ble utført på frosne nyreseksjoner ved bruk av et anti-F4/80 rotte monoklonalt BM8-antistoff. Et geit anti-rotte IgG H&L HRP-konjugert sekundært antistoff (Abcam, Cambridge, UK CAT#ab97057) ble brukt som ovenfor og IHC ble utviklet med, et pepperrotperoksidase (HRP) substrat ble brukt DAB Substrate Kit (Abcam, CAT#) ab64238).

Immunfluorescens.

Nyre- og/eller tarmvevet til alders- og kjønnstilpassede WT- og Clr-f −/− mus ble kryokonservert i 30 % sukrose ved −80 grader i Tissue-Tek optimal kuttetemperaturforbindelse (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). 20 μm kryostatseksjoner ble fiksert med aceton i avtrekkshette ved romtemperatur i 16 minutter og lufttørket i minst 30 minutter, etter vasking i 0,01 M PBS, pH 7,4. Uspesifikk binding ble blokkert med 10 % eselserum. Seksjoner ble inkubert over natten ved 4 grader med de primære antistoffene: anti-Clr-f7, anti-NKR-P1G (et rotte anti-mus monoklonalt antistoff beskrevet tidligere7), anti-IgA (geit anti-mus IgA alfa-kjede (Abcam, Cambridge) , UK CAT#ab97235), anti-IgG-PE (BioLegend, San Diego, CA, USA CAT#405324, anti-IgM-FITC (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA CAT#A21042), Complement C3 Antibody (11H9) ) (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA Cat# NB200-540), anti-IFN -PE (BD-Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA CAT#554411), anti-IL-12-PE (BD-Pharmingen CAT# 554479), anti-CD45-FITC (BioLegend CAT#103108), anti-CD11c-FITC (eBioscience CAT#11-0114-85), anti-F4/80- APC (BioLegend CAT#123116), og anti-NKp46-eFluor 450 (eBioscience, CAT#48-3351-82) ved 1:100 konsentrasjon i 5 % normalt serum i et fuktet kammer. Sekundær antistoffmerking av anti -Clr-f og anti-NKR-P1G antistoffer ved bruk av FITC-konjugerte polyklonale antistoffer ble utført ved RT i 1 time inkubering Prøver ble DAPI kjernefarget ved RT i 5 minutter, vasket med PBS og montert på glassplater med én dråpe VECTASHIELD PLUS antifade monteringsmedier (Vector Laboratories, San Francisco, CA, USA) og dekket med et dekkglass. Objektglass ble undersøkt ved å bruke et Zeiss LSM 510 laserskanningskonfokalmikroskop.

Scoring for histologi og patologi.

Nyreseksjoner av alders- og kjønnsmatchede WT, Clr-f −/−, Rag1−/− og Rag1−/−Clr-f −/− mus (3 μm) ble farget med periodic acid-Schif (PAS). Nyrevev ble vurdert for mesangial cellularitet (definert som 4 eller flere kjerner per mesangialt område), endokapillær proliferasjon, halvmåner og glomerulær sklerose. Seksjoner ble også vurdert for tilstedeværelse av tubulopati, interstitiell fibrose, tubulær atrofi og tubulointerstitielle celleinfiltrater. For glomeruli-patologiskåring ble en semi-kvantitativ poengsum brukt for å evaluere graden av glomerulær skade. Minst 50 glomeruli i hver gruppe ble undersøkt og alvorlighetsgraden av lesjonen ble gradert fra 0 til+3: en+1 lesjon representerte en involvering på mindre enn eller lik 30 % av glomerulus,+2 på 30–60 %, mens en+3 lesjon indikerte at mer enn eller lik 60 % av glomerulus var involvert. Måling av GBM-tykkelse ble utført på glomerulære elektronmikrofotografier av WT og Clr-f −/− ved bruk av Image J V1.53a47. PAS-farget nyrevev fra to Rag1−/− og to Rag1−/−Clr-f −/− mus ble i tillegg skåret blindt for tilstedeværelsen av de patologiske trekkene ovenfor, og de kvantifiserte trekkene ble beregnet ut fra de gjennomsnittlige fire nyresnittene pr. mus.

Elektronmikroskopi.

Behandling av vev for transmisjonselektronmikroskopi fulgte den publiserte protokollen48. Kort fortalt ble små biter av nyrevev fra 12-uke gamle WT- og Clr-f −/− mus fiksert i 2,5 % glutaraldehydløsning og deretter behandlet ved bruk av 1 % osmiumtetroksid/uranylacetat-metoden. Prøver ble innebygd i Epon Araldite-harpiks før kutting ved bruk av en Reichert-Jung ultrakuttet E ultramikrotom. Prøver ble visualisert på et JEOL JEM 1230 transmisjonselektronmikroskop og bilder ble tatt med et Hamamatsu ORCA-HR digitalkamera.

Urin og plasma kjemisk avfall og elektrolyttmåling.

Omtrent 150 μL urin ble samlet daglig fra 12-uke gamle WT-hann- og Clr-f −/− mus på samme tid på dagen i 5 påfølgende dager. Urin ble sentrifugert ved 10,000 rpm for å fjerne rusk og deretter lagret ved -80 grader. Ansiktsveneblod ble samlet fra de samme musene i hepariniserte rør og isolert ved sentrifugering ved 3000 g i 5 minutter og lagret ved -80 grader. Urin- og plasmaprøver ble sendt til Idexx Laboratories (Markham, Ontario) for protein-, kreatinin- og elektrolyttkonsentrasjonsmålinger.

Blodtrykksmålinger på 12 og 24 uker gamle mus. Systolisk og diastolisk blodtrykk (BP) ble målt ved halemansjettpletysmografi på 12 og 24-uker gamle WT- og Clr-f −/− hannmus ved steady state ved bruk av en BP2000 Visitech-modell. BP ble målt daglig i samme rom og til samme time på dagen i 5 påfølgende dager. BP-verdier av de siste 3 påfølgende målingene ble brukt til å beregne gjennomsnittlig BP-verdi, da de første 2 dagene ble ansett som essensielle for musetilpasning.

Kidney RNA sequencing. For kidney RNA-seq, total RNA was isolated from freshly frozen kidneys of three age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice at 7, 13, and 24 weeks of age using TRIzol (Thermo Fisher Scientific) and RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). RNA samples were sent to Genome Quebec Innovation Centre, McGill University, Montreal, QC for library preparation and RNA-seq. RNA-seq was performed on the Illumina HiSeq 4000 platform, with paired-end reads, at>30× 106 avlest dybde per prøve.

RNA‑seq analysis. Te quality of the sequencing reads was inspected using FastQC tool V0.11.5 (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) and reads with a Phred quality score of 30 over 90% of the reads were retained utilizing the Fastx-toolkit V0.0.13 (http://hannonlab.cshl.edu/). Next, the high-quality reads were mapped to the mouse GENCODE M25 annotation database (GRCm38.p6)49 using the STAR aligner V2.7.5a50. STAR aligner was then used to remove duplicates, create transcriptome hits count tables, and generate wiggle fles. Subsequently, DESeq2 package V1.28.151 was used to remove hits with CPM values less than 1 and calculate differentially expressed genes with FDR-transformed P-value>{{0}}.05 og loggfold endring cutoff på 1,5. FPKM-verdier for alle tidspunkt og prøver er gitt (tilleggsdatasettfil 1). Funksjonell berikelsesanalyse. Genontologi og funksjonell berikelsesanalyse ble utført ved bruk av g: Profiler (versjon e102_f.eks.49_p15_7a9b4d6) med g: SCS multiple testing korreksjonsmetode som bruker signifikansgrense på 0,05 (https: //biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost) 52 og PANTHER-klassifiseringssystemet med Fishers Exact-testing og FDR-terskel på<0.05 (http://pantherdb.org/citePanther.jsp) 53. 

Funksjonelle anrikningsnettverk ble opprettet ved å bruke gensett av GO Biological Processes (GO: BP) for Mus Musculus (GRCm38. p6) BioMart-utgivelse: 2020-12-08 lastet ned fra g: Profiler (https://biit.cs.ut.ee) /gprofiler/gost). Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) ble utført ved bruk av GSEA V4.0354,55 ved bruk av nettverksanriking basert på FDR<0.05. Networks were assembled, curated, and visualized using Cytoscape V3.7.156. Heatmaps were generated and clustered by Euclidian distance using Morpheus (https://sofware.broadinstitute.org/morpheus).

Abdominal og ektopisk lipidanalyse. Fettakkumulering ble bestemt av vekten av abdominalt fett dissekert fra individuelle mus. Kroppsvektsmålinger ble tatt før fettekstraksjoner. For Oil Red O (ORO)-farging ble frosne nyreseksjoner kuttet ved 10 μm ved hjelp av en kryostat og deretter lufttørket i 30 min. ORO-farging ble utført ved å fikse seksjonene med 3 vask med 60% isopropanol, og inkubere dem med en arbeidskonsentrasjon (66%) av ORO-løsning (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) farging i 15 min. Objektglass ble deretter vasket raskt med 60 % isopropanol, raskt farget med Mayers hematoxylin for å fremheve kjerner, og deretter montert ved bruk av VectaMount AQ Aqueous Mounting Media (Vector Laboratories).

Patotypeanalyse. Patotypeanalyse ble utført ved bruk av differensielt uttrykte gener (DEGs) med q<0.05 identified from RNA-seq of WT and Clr-f −/− 13-week-old mouse kidneys. Signifcant Clr-f −/− DEGs with identifiable ENSEMBL human orthologs were compared with DEGs of 15 human kidney disease expression sets (disease versus healthy kidney)57–64 downloaded from Nephroseq database at (http://www.nephroseq.org) (Supplementary Dataset File 2)65. Clr-f −/− mouse and human kidney disease DEG sets were hierarchically clustered by Euclidean distance and graphed in a similarity matrix using the Morpheus software (https://sofware.broad institute.org/morpheus). Functional enrichment using g: Profler, (using parameters described above) was performed on four groups of expression clusters with corresponding increased and decreased DEGs and non-corresponding DEGs from the compared expression profiles of Clr-f −/− and IgA nephropathy (IgAN) kidney disease. Flow cytometry. Kidneys from age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice were harvested, homogenized in a Petri dish on ice with RPMI media containing collagenase type 4 (2 mg/mL) (Fisher), and incubated at 37 °C for 30 min with gentle agitation. 

Fordøyd vev ble ført gjennom et 70-μm nylonfilter, PBS vasket, og de gjenværende røde cellene ble lysert med ACK-lyseringsbuffer i 5 minutter på is. Nyreimmunceller ble isolert ved RT-sentrifugering ved 2000 rpm i 30 minutter i 40% Percoll. Cellepelleten ble resuspendert i PBS og celletall ble oppnådd med hemocytometer. Ulike mAbs ble brukt for å verifisere celleoverflateproteinekspresjon, celler ble farget for fowcytometrianalyse med fluorokrom-merkede museantistoffer: anti-CD45 (eBioscience, klon 30-F11), anti-TCR (eBioscience, klon H{ {12}}), anti-NK1.1 (eBioscience, klon PK136), anti-CD19 (BioLegend, klon 1D3/CD19), anti-CD11b (BioLegend, klon M1/70), anti-F4/80 (BioLegend, klon BM8), anti-MHCII(IA/IE) (BioLegend, klon M5/114.15.2), anti-Ly6G (BioLegend, klon 1A8), anti-NKp46 (eBioscience, klon 29A1.4) og isotypekontroller. Cellelevedyktighet ble bestemt ved å bruke en Fixable Viability Dye (eBioscience, Cat# 65-0865-14). For å identifisere og kvantifisere immuncellepopulasjoner i WT- og Clr-f −/− nyrene, ble multiparametriske fowcytometrianalyser ved bruk av antistoffer mot cellespesifikke markører brukt for å identifisere nøytrofiler (CD11b+Ly6G+), makrofager (CD11b+Ly6G−F4/{ {57}}MHCII+), NK-celler (CD11bloLy6G−TCR −NK1.1+), og NKp46+-celler (CD11bloLy6G−TCR −NKp46+), T-celler (Ly6G−NK1 .1−TCR +) og B-celler (CD11b−Ly6G−TCR −CD19+). Alle prøver ble tatt på et BD-Fortessa fowcytometer.

Referanser

1. Hato, T. & Dagher, PC Hvordan det medfødte immunsystemet føler problemer og forårsaker problemer.Clin. J. Am. Soc. Nephrol.10, 1459–1469 (2015).

2. Krüger, T.et al.Identifikasjon og funksjonell karakterisering av dendrittiske celler i den friske murine nyren og i eksperimentellglomerulonefritt.J. Am. Soc. Nephrol.15, 613–621 (2004). 

3. Weisheit, CK, Engel, DR & Kurts, C. Dendritiske celler og makrofager: Sentineller i nyrene.Clin. J. Am. Soc. Nephrol.10, 1841–1851 (2015).

4. Woltman, AMet al.Kvantifisering av dendrittiske celleundergrupper i humant nyrevev under normale og patologiske forhold.Nyre Int.71, 1001–1008 (2007). 5. Gottschalk, C.et al.Batf3-avhengige dendrittiske celler i nyrelymfeknuten induserer toleranse mot sirkulerende antigener.J. Am.Soc. Nephrol.24, 543–549 (2013).

6. Zhang, Q.et al.Mus Nkrp1-Clr-genklyngesekvens- og ekspresjonsanalyser avslører bevaring av vevsspesifikk MHCuavhengig immunovervåking.PLoS One7, e50561 (2012).

7. Leibelt, S.et al.Dedikert immunosensing av musens tarmepitel tilrettelagt av et par genetisk koblede lektinlignendereseptorer.Slimhinneimmunol.

8, 232–242 (2015). 8. Rahim, MMAet al.Musen NKR-P1B: Clr-b-gjenkjenningssystem er en negativ regulator av medfødte immunresponser.Blod125, 2217–2227 (2015). 

9. Carlyle, JRet al.Manglende selvgjenkjenning av Ocil/Clr-b av hemmende NKR-P1 naturlige drepecellereseptorer.Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 101, 3527–3532 (2004). 

10. Rutkowski, E.et al.Clr-a: Et nytt immunrelatert C-type lektinlignende molekyl utelukkende uttrykt av musetarmepitel.J. Immunol.198, 916–926 (2017).

11. Balaji, GRet al.Gjenkjennelse av vert Clr-b av den hemmende NKR-P1B reseptoren gir grunnlag for manglende selvgjenkjenning.Nat.Commun.9, 4623 (2018)

12. Friede, ME, Leibelt, S., Dudziak, D. & Steinle, A. Velg Clr-g-uttrykk på aktiverte dendrittiske celler letter kognat interaksjonmed en mindre undergruppe av milt-NK-celler som uttrykker den hemmende Nkrp1g-reseptoren.J. Immunol.200, 983–996 (2018). 

13. Abou-Samra, E.et al.NKR-P1B-ekspresjon i tarmassosierte medfødte lymfoide celler er nødvendig for kontroll av gastrointestinalluftveisinfeksjoner.Celle. Mol. Immunol.16, 868–877 (2019).

14. Germain, C.et al.Karakterisering av alternativt spleisede transkriptvarianter av CLEC2D-genet.J. Biol. Chem.285, 36207–36215 (2010).

Supportive Service Of Wecistanche - Den største cistanche-eksportøren i Kina:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf:+86 15292862950

Handle for flere spesifikasjoner:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

FÅ NATURLIG ORGANISK CISTANCHE EKSTRAKT MED 25 % ECHINACOSIDE OG 9 % ACTEOSIDE FOR NYRESINFEKSJON