Komplementaktivitet er regulert i C3-glomerulopati av IgG-faktor H-fusjonsproteiner med og uten properdinmålrettingsdomener

Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Alyssa C. Gilmore, Yuchun Zhang, H. Terence Cook', Deborah P. Lavin, Suresh Katti, YiWang2, Krista K. Johnson, SungKwon Kim² og Matthew C. Pickering

'Center for Inflammatory Disease, Imperial College London, Storbritannia; og²Alexion Pharmaceuticals, New Haven, Connecticut, USA

C3 glomerulopatier preget av akkumulering av komplement C3 i glomeruli. Årsaker inkluderer, men er ikke begrenset til, abnormiteter i faktor H, den viktigste negative regulatoren av komplementalternativet. Mus med faktor H-mangel (Cfh-/-) utvikler C3glomerulopatisammen med en reduksjon i plasma C3-nivåer. Ved å bruke denne modellen vurderte vi effektiviteten til to fusjonsproteiner som inneholder faktor H alternative pathway regulatoriske domener (FH1-5)

koblet til enten et ikke-målrettet muse-immunoglobulin (IgG-FH1-5) eller et anti-museproperdin-antistoff (Anti-P-FH1-5). Begge proteinene økte plasma C3 og reduserte glomerulær C3-avsetning i tilsvarende grad, noe som tyder på at properdin-målretting ikke var nødvendig for at FH1-5 skulle endre C3-aktivering i verken plasma eller glomeruli. Etter administrering av IgG-FH1-5 korrelerte plasma C3-nivåer tidsmessig med endringer i faktor B-nivåer, mens plasma C5-nivåer korrelerte med endringer i plasmaproperdinnivåer. Spesielt økningen i plasma

C5- og properdinnivåene vedvarte lenger enn økningen i C3 og faktor B. Hos Cfh-/- mus reduserte IgG-FH1-5 nyreskade under akselerert serum nefrotoksisk nefritis. Dermed viser dataene våre at IgG-FH1-5 gjenopprettet sirkulerende alternativ baneaktivitet og redusert glomerulær C3-avsetning i Cfh-/- mus, og at plasmaproperdinnivåer er en sensitiv markør for C5-konvertaseaktivitet i faktor H-mangel. Det immunoglobulinkonjugerte FH1-5-proteinet, gjennom sin relativt lange plasmahalveringstid, kan være en potensiell terapi for C3glomerulopati.

Cistanche kan hjelpe med glomerulopati

Oversettelseserklæring

C3 glomerulopati(C3G) er en nyresykdom karakterisert ved unormal akkumulering av komplement C3 i glomeruli og glomerulær skade. Det skyldes ukontrollert aktivering av komplementalternativet. Fusjonsproteiner, bestående av funksjonelle domener av den alternative veiregulatoren, faktor H (FH), koblet til et antistoff, gjenopprettet komplementregulering og redusert glomerulær C3 i en C3G-musemodell. Den ikke-målrettede antistoffkonjugasjonen resulterte i en relativt lang fusjonsproteinplasmahalveringstid, og denne, eller lignende konjugasjonsmetoder, kan brukes til å øke FH-funksjonen i behandlingen av C3G.

C3 glomerulopati(C3G) er en komplementmediert nyrelidelse karakterisert ved unormale mengder C3 i glomeruli.1 Den kan utvikle seg til nyresvikt og har ingen definitiv behandling.2 C3G er assosiert med unormal aktivering av komplementalternativet (AP). AP-aktivering resulterer i produksjon av C3bBb (C3 convertase), et enzym som spalter C3. Etter tilsetning av et annet C3b-molekyl, kan det resulterende C3bBbC3b-komplekset (C5-konvertase) spalte komplement C5. Ukontrollert

AP-aktivering i C3G kan assosieres med en reduksjon i sirkulerende C3, C5, faktor B (FB) og properdin. Årsaker til ukontrollert AP-aktivering inkluderer tap av funksjonsendringer i komplementregulatorer og økning av funksjonsendringer i komplementaktivatorer.2 Den viktigste negative AP-regulatoren er faktor H (FH), og FH-mangel hos mennesker, griser og mus er assosiert med C3G. 3 C3 nefritisk faktor, et antistoff som stabiliserer AP C3-konvertasen er hyppig i C3G.4 C3 nefritisk faktor kan resultere i en reduksjon i C3 alene (properdin-uavhengig C3 nefritisk faktor) eller reduksjon i både C3 og C5 (properdin- avhengig C3 nefritisk faktor).5,6

Selv om properdinmangel ikke forbedret plasma C3-nivåene, økte C5-nivåene, noe som tyder på at properdin var nødvendig for aktiviteten til C5, men ikke C3-konvertasen.8,9

Administrering av mus10 eller human FH11,12 til Cfh–/– mus reduserte glomerulær C3-farging og økte sirkulerende C3-nivåer. Konstrukter som bare inneholder de regulatoriske og målrettede domenene til FH (mini-FH-molekyler) er også effektive i denne modellen.13 Andre tilnærminger inkluderer proteiner som målretter mot steder for komplementaktivering. Disse inkluderer TT30,14 et protein som inneholder de komplementregulatoriske domenene til FH (FH1-5) koblet til de komplementbindende domenene til komplementreseptor 2, og homodimere FH-molekyler,15 mini-FH-molekyler som inneholder komplementbindende domener av faktor H-relatert protein 1.

Fordi den terapeutiske nytten av å hemme komplement C3-aktivering er under undersøkelse i C3G,2 er det viktig å forstå kinetikken til glomerulær C3-avsetning og dens forhold til AP-aktivering i både glomeruli og sirkulasjonen. I modeller av immunkompleksmediert glomerulonefritt forsvant glomerulær C3c innen 24 timer etter å forhindre komplementaktivering, mens glomerulær C3d vedvarte i flere uker.16 På samme måte resulterer eksogen FH i Cfh–/– mus i en reduksjon i glomerulær C3c-farging etter 24 timer , mens glomerulær C3d forblir uendret.11

I denne studien undersøkte vi effekten av 2 nye fusjonsproteiner med komplementregulatorisk aktivitet i Cfh-/- musemodellen til C3G. Proteinene inneholdt de regulatoriske domenene til muse-FH (FH1-5), som ble konjugert til muse-Ig for å forlenge den biologiske halveringstiden. Et av fusjonsproteinene, kalt IgG-FH1-5, ble konjugert til et ikke-målrettet musemonoklonalt antistoff. Den andre, kalt anti-P-FH1-5, ble konjugert til et monoklonalt antistoff mot museproperdin. Dette ble gjort for å teste hypotesen om at målretting av dette fusjonsproteinet til steder for komplementaktivering, ved å samhandle med properdinavsetning, ville forbedre vevskomplementreguleringen. Dataene våre viser at både de ikke-målrettede (IgG-FH1-5) og de properdin-målrettede (anti-P-FH1-5) proteinene gjenopprettet plasma- og glomerulær C3-regulering i Cfh–/– mus. Tidsforløpsstudier viste at restaurering av C3- og FB-nivåer speilet nivåene av fusjonsproteinene i sirkulasjonen. I motsetning til dette vedvarte økninger i plasma C5 etter at fusjonsproteinene hadde fjernet fra sirkulasjonen. Vi viser at IgG-FH1-5 forbedret glomerulær skade under akselerert serum nefrotoksisk nefritis hos Cfh–/– mus.

cistanche kan behandle nyresykdom forbedre nyrefunksjonen

RESULTATER

Generering av fusjonsproteiner og in vitro og in vivo vurdering av aktivitet Fusjonsproteiner ble opprettet ved å koble de første 5 kort konsensus repeterende (SCR) domenene til muse FH (FH1-5) til enten et anti-mus properdin antistoff (anti -P-FH1-5) eller et antistoff med et ikke-målrettet Ig-domene (IgG-FH1- 5, tilleggsfigur S1). Aktiviteten til proteinene ble vurdert ved å bruke en AP-spesifikk hemolytisk analyse (Figur 1a). Anti-P-FH1-5 og IgG-FH1-5 inhiberte hemolyse på en doseavhengig måte med større styrke for anti-P-FH1-5. Anti-properdin (anti-P) reduserte også hemolyse på en doseavhengig måte, men IgG-kontrollen hadde ingen effekt. Etter ekvimolare injeksjoner av proteinene i Cfh–/– mus, var IgG-FH1-5 proteinet påvisbart opptil 11 dager etter injeksjon, mens anti-P-FH1-5 var påvisbart opptil 4 dager etter injeksjon (tilleggsfigur S2). For å bestemme om IgG-FH1-5 og anti-P-FH1-5 kunne gjenopprette plasma AP-regulering i Cfh–/– mus, målte vi først plasma C3-nivåer etter injeksjon av fusjonsproteinene (Figur 1b) . Administrering av enten IgG-FH1-5 eller anti-P-FH1-5 økte plasma C3 signifikant etter 24 timer og, i mindre grad, 96 timer etter injeksjon (Figur 1b). Disse dataene viste at både IgG-FH1-5 og anti-P-FH1-5 midlertidig kunne gjenopprette plasma AP-regulering i Cfh–/– mus. Vi utførte deretter en detaljert analyse av disse endringene ved å karakterisere tidsforløpet for endringer i ikke bare plasma C3, men også plasma C5 og de alternative pathway-proteinene FB og properdin. Økninger i sirkulerende C5- og properdinnivåer vedvarer lenger enn økninger i C3 og FB etter administrering av IgG-FH1-5 og anti-P-FH1-5 i Cfh–/– mus

Vi sammenlignet kinetikken til endringer i C3, C5, FB og properdin ved å måle proteiner med intervaller på opptil 27 dager etter en enkelt injeksjon av enten IgG-FH1-5 eller anti-P-FH1-5 ( Figur 2). Etter administrering av IgG-FH1-5 skjedde den maksimale økningen i C3, C5, FB og properdin på dag 1 etter injeksjon. Tidspunktet for disse endringene å falle til nivåene før behandling var forskjellig. Returen til forbehandlingsnivåene skjedde mellom dag 1 og 4 for FB, mellom dag 7 og 11 for C3, og mellom dag 14 og 21 for både properdin og C5 (Figur 2a, c, e og g). Etter administrering av anti-P-FH1-5, forekom topp C3-nivåer på dag 1, men falt til førbehandlingsnivåer mellom dag 4 og 7 (figur 2b). Topp C5-nivåer oppsto på dag 4 og returnerte til forbehandlingsnivåer mellom dag 7 og 11 dager (figur 2d). Toppøkningen i FB skjedde på dag 1 og falt til forbehandlingsnivåer mellom dag 1 og 4 (Figur 2f). Som forventet var fritt plasmaproperdin utarmet etter injeksjon av enten anti-P-FH1-5 eller anti-P (figur 2h). Frie plasmaproperdinnivåer forble lave i opptil 7 dager etter anti-P-FH1-5 og opptil 14 dager etter anti-P (figur 2h). Selv om begge fusjonsproteinene midlertidig gjenopprettet plasma AP-regulering, reflekterte varigheten av forbedringen i C3-, FB- og C5-nivåer varigheten av påvisningen i plasma, som var kortere for anti-P-FH 1-5 (tilleggsfigur S2) . Oppsummert var endringer i nivåene av C3 og FB etter injeksjon av begge proteinene kortere enn for C5 og properdin. Disse dataene tyder på at plasma FB er en sensitiv markør for C3-konvertaseaktivitet i denne innstillingen, mens properdin er en markør for C5-konvertaseaktivitet. Spesielt etter anti-P-injeksjon var det en økning i C5 ved 24 og 96 timer og dag 7

Figur 1| (a) Komplementer alternativ veiavhengig hemolyseanalyse. Antistoffer ble titrert i 2-fold fortynninger fra 60 nM til 0,5 nM. IgG-FH1-5-, anti-P-FH1-5- og anti-P-reagensene reduserte kaninerytrocytthemolyse på en doseavhengig måte. Ingen inhibering ble brukt til IgG-kontrollproteinet. Horisontale streker angir gjennomsnittsverdier, og feilstreker representerer SD. (b) Plasmakomplement C3 i Cfh–/– mus etter injeksjon av fusjonsproteiner. Plasma C3 ble målt før og 24 timer og 96 timer etter administrering av IgG-FH1-5 (røde trekanter, n ¼ 5) Anti–P–FH1-5 (lilla trekanter, n ¼ 6), Anti -P (grønne prikker, n ¼ 5) og IgG-kontroll (blå prikker, n ¼ 5). Horisontale søyler angir gjennomsnittsverdier, og værhår angir SD. ***P # 0,001 versus forbehandlingsverdi og avledet fra 2-måte ANOVA med Bonferroni multiple sammenligningstest. FH, faktor H; P, properdin.

(Figur 2d). Som rapportert indikerer 8,9 at C5-konvertasen er avhengig av properdin i Cfh-/- mus.

IgG-FH1-5 og anti-P-FH1-5 reduserte glomerulær C3c, men endret ikke C3d-farging i Cfh–/– mus

Vi vurderte deretter innflytelsen av IgG-FH1-5 og anti-P-FH1-5 på glomerulære C3b/iC3b/C3c, C3d, properdin og FH-relaterte (FHR) proteiner. 96 timer etter injeksjon av IgG-FH1-5 var glomerulær C3b/iC3b/C3c-farging redusert, men glomerulær C3d (figur 3a) og FHR-farging (figur 3b) var det ikke. Glomerulær C3b/iC3b/C3c forble uendret med enten IgG-kontroll eller anti-P. Det unormale lineære mønsteret av glomerulær properdinfarging i ubehandlede Cfh-/- mus9 forble 96 timer etter IgG-kontroll. Hos Cfh–/– mus injisert med enten anti-P eller IgG-FH1-5, var det glomerulære properdinnivået nesten ikke påviselig etter 96 timer (figur 3b). Uventet resulterte anti-P-FH1-5-injeksjon i et granulært glomerulært fargemønster ved bruk av anti-properdin-, anti-FH/FHR- og anti-IgG-antistoffer (figur 3b). Dette funnet antydet at anti-P-FH1-5-proteinet ble avsatt i glomeruli. Injeksjon av anti-P-FH1-5-protein i villtypemus resulterte i glomerulær farging med anti-properdin-, anti-FH/FHR- og anti-IgG-antistoffer etter 96 timer (tilleggsfigur S3), noe som indikerer at dette reagens interagerer med normale glomeruli. Vi spekulerte imidlertid i at anti-P-FH1-5-proteinet også kunne samhandle med det eksisterende glomerulære properdinet i Cfh–/– mus. Da vi injiserte reagenset i Cfh–/– mus som hadde blitt forbehandlet med anti-P for å fjerne glomerulært properdin, var det en reduksjon i de granulære fargingsmønstrene ved bruk av anti-properdin, anti-FH/FHR og anti-IgG antistoffer ( Supplerende figur S4). Disse observasjonene indikerer at den glomerulære interaksjonen av anti-P-FH1-5-protein i Cfh–/– mus er delvis avhengig av glomerulær properdin.

IgG-FH1-5 forbedret nyreskade under akselerert serum nefrotoksisk nefritis hos Cfh–/– mus

Hos pasienter med C3G kan akutt nyreskade utvikles i sammenheng med interkurrente infeksjoner. For eksempel er tap av nyrefunksjon ved FHR5-nefropati assosiert med episoder med synfaryngitisk makroskopisk hematuri.17 Den underliggende C3-dysreguleringen hos C3G-pasienter resulterer sannsynligvis i forsterket komplementmediert nyreskade etter en trigger som resulterer i nyrebetennelse. For å modellere dette induserte vi akselerert serum nefrotoksisk nefritis, et immunkompleks

Figur 2| Plasmakomplementprofiltidskurs i Cfh–/– mus injisert med IgG-FH1-5 og anti-P-FH1-5. Plasma C3 (a,b), C5 (c,d), FB (e,f) og properdin (P; g,h) fra eksperimentell start til 27 dager etter enkeltinjeksjon av IgG-FH{{1{{21 }}}} (a,c,e,g; røde trekanter, n ¼ 5) eller anti-P-FH1-5 (b,d,f,h; lilla trekanter, n ¼ 6). Kontroller inkluderte anti-P (grønne prikker, n ¼ 5) og et isotype-tilpasset monoklonalt antistoff (IgG-kontroll; blå prikker, n ¼ 5). Horisontale søyler angir gjennomsnittsverdier, og værhår angir SD. *P # 0.05, **P # 0,01, ***P # 0,001 versus forbehandlingsverdi og utledet fra 2-veisanalyse av varians med Bonferronis multiple sammenligningstest. FB, faktor B; FH, faktor H.

glomerulonefritt-modell som involverer komplement- og Fc-reseptor-medierte veier,18,19 i Cfh–/– musene. Vi har tidligere vist at Cfh–/– mus er overfølsomme for nyreskade i denne innstillingen7 og antok at FH1-5-proteinet, ved å forbedre AP-reguleringen, kunne lindre komplementmediert nyreskade i denne modellen. Fordi våre data indikerte at anti-P-FH1-5-proteinet ble avsatt i normale glomeruli, brukte vi IgG-FH1-5 under akselerert serumnefrotoksisk nefritis. Tjuefire timer før injeksjon av nefrotoksisk serum fra sau, fikk mus en ip-injeksjon av enten IgG-kontroll (n ¼ 7) eller IgG-FH1-5 (n ¼ 8). Den eksperimentelle protokollen er avbildet i figur 4a. Mus ble avlivet 6 dager etter administrering av nefrotoksisk serum fra sau. Alle de tre histologiske målene for glomerulær patologi (alvorlighetsscore, totalt celleantall og makrofagantall) var signifikant lavere i IgG-FH1-5-gruppen (figur 4b). Den tubulointerstitielle skaden var også lavere i IgG-FH1-5-gruppen (figur 4b). Serumurea var betydelig forhøyet

Figur 3| Glomerulær komplement immunfarging i Cfh–/– mus 96 timer etter injeksjon av enten IgG-FH1-5 eller anti-P-FH1-5. (a) Representative bilder sammen med kvantifisering av glomerulær C3b/iC3b/C3c og C3d i de 4 eksperimentelle gruppene: IgG-FH1-5 (røde trekanter, n ¼ 5), anti-P-FH1-5 (lilla trekanter,n ¼ 6), anti-P (grønne prikker, n ¼ 5), og IgG-kontroll (blå prikker, n ¼ 5). (b) Datapunkter representerer medianverdier, og værhår angir et interkvartilområde. P-verdier avledet fra Kruskal-Wallis test med Dunn multiple sammenligningstest. (b) Representative bilder av glomerulært IgG, FHR og, farging i de 4 eksperimentelle gruppene. Bar ¼ 100 mm.AFU, vilkårlige fluorescerende enheter; FH, faktor H; P, properdin. For å optimalisere visningen av dette bildet, se nettversjonen av denne artikkelen påwww.kidney-international.org.

IgG-kontrollgruppen, men endringer i serumalbumin og urinalbumin-til-kreatinin-forholdet var ikke forskjellig (figur 4b). Som forventet ble glomerulær C3b/iC3b/C3c signifikant redusert i IgG-FH1-5-gruppen (figur 4b), men glomerulær muse-IgG (figur 4b) og sau-IgG (data ikke vist) skilte seg ikke mellom gruppene .

Figur 4| Forbehandling med IgG-FH1-5 forbedret nyreskade under akselerert serum nefrotoksisk nefritis hos Cfh–/– mus. (a) Skjematisk av protokollen for akselerert serum nefrotoksisk nefritis. Mus pre-immunisert med saue-IgG fikk enten IgG-FH1-5 (behandlingsgruppe, n ¼ 8) eller IgG-kontroll (kontrollgruppe, n ¼ 7) 24 timer før administrering av det nefrotoksiske serum fra sau. (b) Nyrefunksjon og histologi 6 dager etter induksjon av akselerert serum nefrotoksisk nefritis hos mus behandlet med enten IgG-FH1-5 (behandling; røde trekanter, n ¼ 8) eller IgG-kontroll (kontroll; blå sirkler, n) ¼ 7). Horisontale søyler angir medianverdier, og værhår angir et interkvartilområde. *P # 0.05, **P # 0.01, ***P # 0,001 versus kontroll og avledet fra Mann-Whitney-testen. FH, faktor H; P, properdin.

DISKUSJON

Både IgG-FH1-5 og anti-P-FH1-5 normaliserte C3-, FB- og C5-nivåer i Cfh–/– mus. Dette funnet stemmer overens med det faktum at de komplementregulatoriske domenene til muse-FH er lokalisert innenfor SCR-domener 1 til 5 (et C3b-bindingssete og kofaktoraktiviteten for faktor I-mediert spaltning av C3b).20 Overflategjenkjenningsdomener, som påvirker binding til heparin og endotelceller og inkluderer et andre C3b-bindingssete, er tilstede i SCR-domener 18 t.o.m.

20 (FH18-20) og er derfor ikke til stede i fusjonsproteinene.20 Likevel reduserte begge proteinene glomerulær iC3b/C3b/C3c, noe som indikerer at FH18-20 ikke var nødvendig i denne innstillingen. Dette funnet stemmer overens med tidligere data som viser at Cfh–/– mus som uttrykker et mutant FH-protein bestående av SCR-domener 1 til 15 (Cfh–/– .FHD16-20) ikke utviklet unormal glomerulær C3-avsetning.21,22 Imidlertid var Cfh–/–.FH D16-20-dyr ikke i stand til å regulere C3-aktivering langs nyreendotelet og utviklet trombotisk mikroangiopati. Det er mulig at, på grunn av mangelen på overflatemålrettede FH18-20-domener, kan administrering av fusjonsproteiner som inneholder FH1-5 i FH-mangel resultere i mottakelighet for trombotisk mikroangiopati. Det er også mulig at den økte aviditeten for C3b-binding, under den dimere strukturen til fusjonsproteinene, er tilstrekkelig til å kompensere for fraværet av de overflatemålrettede FH18-20-domenene. Imidlertid er overflategjenkjenning av C3b også påvirket av konformasjonsendringer i FH.23 A Streptococcus pneumoniae FH-bindende protein (PspCN, som binder SCR-domene 9), utløser en FH-konformasjonsendring, og FH-PspCN-komplekset hadde økt C3b-binding og forbedret forfallsakselererende aktivitet. FH20 C3d-bindingssetet blir ikke eksponert i FH, men blir eksponert i FH-PspCN-komplekset. Dette kan forklare hvorfor FH19-20 interagerer med overflate C3d, men FH ikke.24,25 Vi spekulerer i at agentene våre, gjennom konformasjonsendringer, kan samhandle effektivt med både væskefase og overflate C3b. Spesielt beskyttet både IgG-FH1-5 og anti-P-FH1-5 erytrocytter mot lysis i en AP-avhengig hemolyseanalyse.

Verken fusjonsprotein reduserte glomerulær C3d-farging, kanskje på grunn av den vedvarende naturen til glomerulær C3d. Ved eksperimentell immunkompleks nefritt forsvant glomerulær C3c innen 24 timer etter opphør av komplementaktivering, men C3d vedvarte i flere uker.16 I tillegg er glomerulær C3d vedvarende ved lupusnefritt.26 Dette reflekterer sannsynligvis dens kovalente interaksjon med glomerulære overflater. Gjentatte injeksjoner av human FH i Cfh–/– mus viste en reduksjon i glomerulær C3d over 10 dager.11 Det er sannsynlig at gjentatt dosering av IgG-FH1-5 kan redusere glomerulær C3d i denne modellen. Det var heller ingen endring i glomerulær FHR-farging. Lite er kjent om funksjonene til muse-FHR-proteinene, men de kan samhandle med både C3b27,28 og C3d.27 Faktisk er den tilsynelatende affiniteten til både FHR-A og FHR-B for C3d sterkere enn den til FH.27 Vi spekulerer i at glomerulære FHR-proteiner sannsynligvis vil fjerne fra glomeruli bare når C3d er fjernet. I denne sammenheng er det bemerkelsesverdig at i humant C3G assosieres faktor H-relatert protein 5 med glomerulær C3d.29

Anti-P-FH1-5-proteinet utarmet fritt plasmaproperdinnivåer som forventet fordi anti-properdin-delen av dette fusjonsproteinet kan blokkere AP-aktivitet (på grunn av properdin-utarming) i 8 dager etter en enkelt injeksjon.30 Imidlertid, dataene våre viste at effekten av FH1-5 for å øke plasma C3-nivåer og redusere glomerulær C3b/iC3b/C3c-farging var sammenlignbar mellom de 2 fusjonsproteinene (dvs. var uavhengig av properdin-målretting). Dessuten ble den unormale glomerulære properdinfargingen betydelig redusert etter administrering av enten anti-P eller IgG-FH1-5. Tydeligvis, i motsetning til C3d- og FHR-proteiner, fjernes glomerulært properdin lett etter gjenoppretting av C3-regulering. Glomerulært properdin endret seg i mønster etter administrering av anti-P-FH1-5-proteinet, men dette ble komplisert av observasjonen at vi oppdaget avsetning av dette fusjonsproteinet i både Cfh–/– og villtype glomeruli. Dette var delvis på grunn av en interaksjon med glomerulær properdin, men avsetningen i villtype glomeruli indikerte at den også delvis var helt uavhengig av glomerulært komplement og sannsynligvis relatert til de fysisk-kjemiske egenskapene til fusjonsproteinet.

Våre kinetiske data demonstrerte nye funn angående de tidsmessige endringene i FB, C5 og properdin som følger med økninger i C3 i Cfh-/- mus etter injeksjon av fusjonsproteinene. FB-nivåene steg raskt etter injeksjon

og returnerte til baseline-nivåer på et tidspunkt da både C5- og properdinnivået forble forhøyet. Properdinnivåene i Cfh–/– mus ble redusert ved baseline og økte til normale nivåer (20 mg/ml30) etter injeksjon av IgG-FH1-5 og holdt seg på disse nivåene i minst 14 dager. Et lignende tidsforløp ble sett for økningen i plasma C5-nivåer. Påfallende nok var IgG-FH1-5 stort sett fraværende fra sirkulasjonen etter 11 dager, noe som indikerer at dannelsen av C5-konvertasen i Cfh–/–-mus er langsommere enn for C3-konvertasen (fordi C3-nivåene returnerte til baseline mellom kl. 7 og 11 dager). Plasma C5 økte etter anti-P-behandling og økte ytterligere med anti-P-FH1-5-protein. Derfor bidro både properdinmålretting og effekten av FH1-5 til de økte C5-nivåene og indikerer at C5-konvertasen er delvis properdinavhengig i Cfh–/– mus. Dette funnet er i samsvar med forbedringen av C5-dysregulering hos mus med kombinert mangel på FH og properdin.8,9 Sirkulerende properdinnivåer kan reduseres i C3G og ser ut til å korrelere med overflate-C5-konvertaseaktivitet i motsetning til enten plasma C5 eller løselig C5b{ {30}}.31,32 Dataene våre støtter en intim kobling mellom properdinnivåer og C5-konvertaseaktivitet og støtter bruken av properdinnivåer som en biomarkør for pågående glomerulær C5-aktivering.

Spesielt var IgG-FH1-5-proteinet fortsatt påviselig i sirkulasjonen opptil 11 dager etter en enkelt injeksjon. Dette er mye lengre enn det vi tidligere rapporterte for det ukonjugerte muse-FH1-5-proteinet, som ble fjernet fra sirkulasjonen innen 24 timer.14 Dette funnet indikerer at den lengre plasmahalveringstiden til IgG-FH{ {9}} protein er avledet fra antistoffkonjugasjonen. Plasmahalveringstiden til IgG-FH1-5-proteinet var også lengre enn det vi tidligere observerte for FH i full lengde.10,11 For eksempel ble humant FH fjernet fra sirkulasjonen 96 timer etter en enkelt injeksjon i Cfh–/– mus.11 Kombinert med våre data som viser effektiviteten til IgG-FH1-5-proteinet i komplementregulering, anser vi at konjugering av FH1-5-protein for å forlenge dets farmakokinetiske profil har potensiell terapeutisk verktøy i C3G.

Oppsummert viser vi at til tross for manglende overflategjenkjenningsdomener, var FH1-5-fusjonsproteinene effektive for å redusere glomerulær C3-aktivering og gjenopprette plasmakomplementregulering i FH-mangel. Det var ingen åpenbar fordel ved å konjugere FH1-5-domenene til antiproperdin, og IgG-FH1-5-proteinet reduserte nyreskade ved eksperimentell nefritt. I motsetning til utfordringene med å produsere storskala preparater av FH for terapeutisk bruk, er storskalaproduksjonen av antistoffbaserte terapier godt etablert, noe som gjør IgG-FH1-5 til et attraktivt potensielt terapeutisk middel for C3G.

METODER

Fusjonsproteiner

IgG-FH1-5. De første 5 muse-FH SCR-domenene (mFH1-5) koblet til

til et ikke-målrettet IgG1 muse-Ig (et anti-idiotypisk antistoff reist mot et muse monoklonalt antistoff).

Anti-P-FH1-5. Murint FH1-5 koblet til muse-antiproperdin-antistoff (anti-P),30 levert til Alexion av W. Song, University of Pennsylvania).

Kontroller. Kontroller var isotype-matchet ikke-målrettende muse-Ig (IgG-kontroll) og muse-anti-properdin (anti-P) (tilleggsfigur S1). Proteiner ble generert ved bruk av pVEK-vektorer og Expi293-celler (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), renset ved bruk av protein A (MabSelect SuRe, Cytiva, Marlborough, MA).

AP-spesifikk hemolytisk analyse

Tjue prosent normalt museserum titrert fra 60 nM til 0,5 nM ble inkubert med kaninerytrocytter (1,5 106 celler/ml) ved 37 C i 30 minutter. Hemfrigjøring ble kvantifisert spektrofotometrisk (optisk tetthet 415 nm); 100 prosent lysis var serum uten inhibitor.

Plasma FB og FH

Plasma ble oppnådd etter sentrifugering av blod samlet inn i rør inneholdende etylendiamintetraeddiksyre (Sarstedt, Nordrhein-Westfalen, Tyskland). Proteiner ble målt ved kapillær elektroforese immunoassay (WES, ProteinSimple, San Jose, CA). Antistoffer som ble brukt var polyklonalt anti-mus-FH-antistoff (Alexion Pharmaceuticals, Boston, MA) og anti-mus-FB-antistoff (Abcam, Cambridge, UK); WES anti-kanin deteksjonsmodul (ProteinSimple, San Jose, CA) ble brukt. Kjemiluminescerende signaler ble analysert med Compass for SW-programvare (ProteinSimple, versjon 5.0.1), kvantifisert som toppområder og normalisert til analysekontrollen.

Mus

Alle mus ble holdt under spesifikke patogenfrie forhold; prosedyrer ble utført i henhold til institusjonelle retningslinjer og godkjent av United Kingdom Home Office. C57BL/6 villtype mus ble kjøpt fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME), og Cfh–/– mus ble generert som tidligere beskrevet.7 Mus ble matchet for alder og kjønn; ekvimolare doser av proteiner ble administrert via ip-injeksjon (1 mg for anti-properdin og IgG-kontroll; 1,4 mg for IgG-FH1-5 og anti-P-FH1-5). Akselerert serum nefrotoksisk nefritis ble indusert ved iv injeksjon av sau nefrotoksisk serum i mus pre-immunisert med sau IgG.7 Administrering av fusjonsproteinene ble utført 24 timer før sau nefrotoksisk serum induksjon (Figur 4a).

C3, C5 og fritt properdin Plasma C3 ble målt ved enzymkoblet immunosorbentanalyse.14 Plasma "fritt" properdin og C5 nivåer ble målt ved bruk av elektrokjemiluminescens immunoassays (Meso Scale Discovery [MSD], Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD) med anti - properdin eller en tilpasset anti-murin C5 belagt på høybindende MSD-plater. Bundet "fritt" properdin og C5 ble påvist med anti-properdin (fra W. Song) eller biotinylert monoklonal anti-C5 (Alexion) kombinert med streptavidin-SULFO (MSD, Meso Scale Diagnostics). Det kjemiluminescerende signalet ble oppnådd ved bruk av en SECTOR S 6000-bildeapparat (MSD, Meso Scale Diagnostics) og ble analysert med MSD Discovery Workbench-programvare (Meso Scale

Diagnostikk, versjon 4.0.12.1). Rekombinant murint properdin og C5 ble brukt som standarder.

Nyrefunksjon og histologi

Hematuri og proteinuri ble vurdert ved bruk av Hema-Combistix (Bayer, Reading, Storbritannia); plasma urea ble målt og nyrevev behandlet som tidligere beskrevet.9 Urinkreatinin ble bestemt på punkturinprøver ved bruk av Creatinine Companion Protocol-analysen (#1012; Excell, Philadelphia, PA) og punkturin/ plasmaalbumin ble målt ved enzymkoblet immunosorbentanalyse (#E99-134; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Periodic acid-Schiff-fargede nyresnitt ble vurdert på en blind måte og rangert i henhold til alvorlighetsgraden av glomerulær og tubulointerstitiell skade (0 [ingen], 1 [mild], 2 [moderat]). Ti glomeruli per seksjon ble vurdert for å bestemme gjennomsnittlig glomerulære celleantall. Immunofluorescensfarging ble utført på 5-mm kryoseksjoner montert ved bruk av Vectashield-medium med DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Antistoffer som ble brukt var fluorescein-isotiocyanat (FITC)-konjugert polyklonal geit-anti-mus C3b/C3c/iC3b (1:200; #55500; MP Biomedical, Santa Ana, CA)9; Fig-kjede-spesifikk FITC-konjugert polyklonal geit anti-mus IgG (1:400; #F5387; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); FITC-konjugert monoklonalt muse-anti-geit/sau-IgG (1:100; #F5137; Sigma-Aldrich); eller FITC-konjugert geit-anti-menneskelig properdin (1:50; #GAHu/PPD/FITC, Nordic Immuno- logic Laboratories, København, Danmark).9 Biotinylert geit-anti-mus C3d (1:10; # BAF2655; R&D Systems) , Minneapolis, MN) ble brukt på biotinblokkerte seksjoner (Biotin Blocking System; Agilent Dako, Santa Clara, CA), med streptavidin AF488 sekundært antistoff (1:200; #S-32354; Thermo Fisher Scientific). FH ble visualisert i renset rotte anti-mus CD16/CD32-blokkerte seksjoner (1:100; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) ved bruk av geit-anti-menneskelig FH (1:1000; #A312; Quidel, San Diego , CA) og monoklonalt anti-geit IgG-FITC sekundært antistoff (1:100; klon GT-34; F4891; Sigma-Aldrich). Glomerulære makrofager ble identifisert ved bruk av FITC-konjugert rotte anti-mus CD68 (FA-11 klon GTX43518; GeneTex, Irvine, CA). Kvantitativ immunofluorescensanalyse ble utført ved bruk av et Leica DM4B optisk mikroskop kombinert med Leica DFC700T digitalkamera (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) og Image-Pro Plus-programvare (Media Cybernetics, Rockville, MD, versjon 7). Ti glomeruli ble undersøkt per seksjon, og gjennomsnittlig intensitet ble uttrykt i vilkårlige fluorvitenskapelige enheter.

Statistisk analyse

GraphPad Prism, versjon 8.0 (GraphPad, San Diego, CA) ble brukt til statistisk analyse. Gjentatte tiltak 2-måte variansanalyse med Bonferroni multiple sammenligningstest (faktorer var tid og behandling) ble brukt for tidsforløpsanalysen. Kruskal-Wallis med Dunn multiple sammenligningstesten ble brukt ved sammenligning av flere grupper, og Mann-Whitney testing ble brukt for 2 grupper.

FORMIDLING

MCP har mottatt konsulenthonorarer fra Alexion, ChemoCentryx, Novartis, Gyroscope og Achillion Pharmaceuticals. HTC har mottatt konsulenthonorarer fra Alexion, Novartis, Aurinia og Achillion Pharmaceuticals. YZ, YW, KKJ og SK-K er ansatte i Alexion Pharmaceuticals. SK er tidligere ansatt i Alexion Pharmaceuticals og er for tiden ansatt i Gemini Pharmaceuticals. Alle de andre forfatterne erklærte ingen konkurrerende interesser.

TAKK

MCP er en Wellcome Trust Senior Fellow i Clinical Science (stipendreferanse 212252/Z/18/Z), og ACG og DPL støttes av dette stipendiet. YZ, SK, YW, KKJ og SK-K ble finansiert av Alexion Pharmaceuticals.

TILLEGGSMATERIALE

Tilleggsfil (PDF)

Figur S1. Fusjonsproteiner brukt i denne studien.IgG-FH1-5 inneholder de første 5 domenene av musefaktor H (FH1-5) koblet til en ikke-målrettet muse-Ig. Anti-P-FH1-5 består av mFH1-5 knyttet til et nøytraliserende muse-anti-mus properdin-antistoff (anti-P; se Miwa et al.30). Kontrollproteiner inkluderte et isotypetilpasset ikke-målrettet muse-Ig (IgG-kontroll) og det nøytraliserende muse-anti-muse-properdin-antistoffet (Anti-P). Figur S2. WES blot-analyse for å oppdage FH1-5 i plasmaprøver fra FH-mangelfulle mus injisert med enten (A) IgG-FH1-5 eller (B) Anti-P-FH1-5. 94-kDaIgheavychainlinkedtomouseFH1-5 (HC-FH1-5)kan detekteres opptil 11 dager etter injeksjon av IgG-FH1-5 og opptil 4 dager etter injeksjon av anti-P-FH1-5-protein (røde bokser) Kontroller inkluderte plasma fra mus av villtype der full-lengde faktor H-proteinet er påvist (FH, svarte bokser, bane C1) og ikke-injiserte FH-mangelmus, der ingen FH er tydelig (svarte bokser, bane C2,). Som forventet er verken FHnorFH1-5 påviselig i plasmaprøver fra mus injisert med Anti-P eller IgG-kontroll.

Figur S3. Glomerulær komplement immunfarging 96 timer etter injeksjon av IgG-kontroll eller anti-P-FH1-5 i villtype mus. Representative glomerulære bilder vises (bar ¼ 100 mm).

Figur S4. Rollen til properdin på avsetningen av anti-P-FH1-5 i glomeruli av FH-mangelfulle mus. Cfh–/– mus ble injisert med enten IgG-kontroll eller anti-P (behandling 1) fulgt 24-timer senere av enten IgG-kontroll eller anti-P-FH1-5 (behandling 2). Dyrene ble slaktet 120 timer etter behandling én og glomerulær farging for IgG, properdin og FH/FHR ble vurdert. Representative bilder vises. Anti-P-injeksjon reduserte markert properdin (rad 1, kolonne 2), men ikke FH/FHR (forblir uendret) eller IgG (forblir fraværende) farging. Administrering av anti-P-FH1-5 24-timer etter IgG-kontroll resulterte i utseendet av granulær farging med anti-IgG, anti-FH/FHR og anti-P antistoffer som sett etter injeksjon av anti-P-FH 1-5 alene (se figur 3b). Denne granulære fargingen ble redusert når anti-P-FH1-5-injeksjonen ble innledet av anti-P-injeksjon, som tømmer både sirkulerende (se figur 1h) og glomerulær (se figur 3b). Glomerulær farging med anti-IgG var tydelig bare hos mus injisert med anti-P-FH1-5 (rad 3, kolonne 3 og 4) og var signifikant lavere hos mus som mottok anti-P-FH1-5 innledet av anti-P. Vi konkluderte med at avsetningen av anti-P-FH1-5 i glomeruli hos Cfh–/– mus var delvis avhengig av properdin. Horisontale søyler angir medianverdier, og værhår angir interkvartilområdet. P-verdien ble avledet fra Mann-Whitney-testen. Bar ¼ 100 mm.

REFERANSER

1.FakhouriF, Frémeaux-Bacchi V, Noöl LH, et al. C glomerulopathy∶ ny dassifisering. Nat Rev Nephrol.20106:494-499.

2 SmithRH.AppeG8.BlomAMet aLC3gkomeripati—forstå sjeldne komplement-drevet virkelig sykdom. Nat ReyNephrol.201915129-143

3. Pickering MC, Cook HT. Translasjonell minirevyserie om komplementfaktor H: nyresykdommer assosiert med komplementfaktor H ny innsikt fra mennesker og dyr. Cin Exp Immunol.2008;151:210-230.

4. Daha MR Fearon DT Austen KF, C3nechritic factor (C3NeF)∶stabilisering av væskefase og cellebundet alternativ pathway convertase. J Immunol 1976;116: 1-7.

5. Mollnes TE, Ng YC, Peters DK, et al-effekten av en nefritisk faktor på C3 og på den terminale komplementveien in vivo og in vitro. Oin Exp Immunol. 1986;65:73-79.

6. Nq YC, Peters DK. G3 nefritisk faktor (C3NeF): dissosiasjon av cellebundet og væskefasestabilisering av alternativ C3-konvertase. Cn Exp Imunol.19865:450-457.

7. Pickering MC, Cook HT, Warren J, et al. Ukontrollert C3-aktivering forårsaker membranproliferativ glomerulonefritt hos mus som mangler komplementfaktor H. Nat Genert.2002:31;424-428.

8. Lesher AM, Zhou L, Kimura Y, et al. Kombinasjon av faktor H-mutasjon og properdinmangel forårsaker alvorlig C3 glomerulonefritt. J Am Soc Nephrol. 2013;24:53–65.

9. Ruseva MM, Veron KA, Lesher AM, et al. Tap av properdin forverrer C3 glomerulopati som følge av faktor H-mangel. J Am Soc Nephrol. 2013;24:43-52.

10. Paixao-Cavalcante D, Hanson S, Botto M, et al. Faktor H letter clearance av GBM-bundet iC3b ved å kontrollere C3-aktivering i væskefasen. Mol Immunol.2009;46:1942-1950.

11Fakhouri F, de Jorge EG. Brune F, et al. Behandling med human komplementfaktor H reverserer raskt nyrekomplementavsetningen hos mus med faktor H-mangel. Nyre Int.2010:78:279-286.

12. Michelfelder S, Parsons J, Bohlender Ll, et al Moss-produsert, glykosyleringsoptimalisert human faktor H for terapeutisk anvendelse ved komplementforstyrrelser. JAm Soc Nephrol.201728:1462-1474.

13. Nichols EM, Barbour TD, Pappworth Y, et al. Et utvidet mini-komplement faktor H-molekyl forbedrer eksperimentell C3 glomerulopati. Nyre Int. 201588:1314-1322.

14. Ruseva MM, Peng T, Laser MA, et al Effekten av målrettet komplementhemming i eksperimentell C3 glomerulopati. J Am Soc Nephrol. 2016;27:405-416.

15. Yang Y, Denton H, Davies OR, et al. En konstruert komplementfaktor H-konstruksjon for behandling av C3 glomerulopati. J Am Soc Nephrol. 2018;29:1649-1661.

16. Schulze M, Pruchno CJ, Burns M, et al. Glomerulær C3-klokalisering indikerer pågående immunavleiring og komplementaktivering ved eksperimentell glomerulonefritt. Am J PatholL. 1993:142179-187.

17. Athanasiou Y, Voskarides K Gale DP, et al Familiær C3 glomerulopati assosiert med CFHRS-mutasjoner kliniske karakteristika til 91 pasienter i 16 stamtavler. CTn JAm Soc Nephrol.20116:1436-1446.

18. Kaneko Y, Nimmer动hn F, Madaio MP, et al. Patologi og beskyttelse ved nefrotoksisk nefritis bestemmes av selektivt engasjement av spesifikke Fc-reseptorer. J Exp Med.2006;203:789-797.

19. Sheerin NS, Springall T, Carroll MC, et al. Beskyttelse mot anti-glomerulær basalmembran (GBM-mediert nefritt hos C3-og C4-deficiente mus. C Exp Immunol. 1997;110:403-409.

20. Cheng ZZ Hellwae J, Seeberger H et al. Sammenligning av overflategjenkjenning og C3b-bindingsegenskaper til mus og human komplementfaktor H.Mol Immunol.2006;43.972-979.

21dp rogn EG. Macor P.Paixao-Caakante D. et al Utviklingen av typisk hemolytisk uremisk syndrom avhenger av komplement C5.J Am Soc Nephrol.2011;22:137-145.

22. Pdkering MC, de Jorge EG. Martinez-Barricarte Ry et al Spontant hemolytisk uremisk syndrom utløst av komplementfaktor H som mangler overflategjenkjenningsdomener. J Exp Med.2007;204:1249-1256.

23 Herbert AP. Mike E, Chen ZAet aL Komplementunndragelse mediert av forbedring av fanget faktor H: implikasjoner for beskyttelse av selvoverflater fra komplementet. J Immunol. 2015;195:4986-4998.

24. Goicoechea de Jorge E Caesar JJ, Malik TH, et al Dimerisering av komplementfaktor H-relaterte proteiner modulerer komplementaktivering i med. Proc Natl Acad Sci US A.2013;110:4685-4690.

25. Schmidt CQ, Bai H Lin Z, et al. Rasjonell utvikling av en minimert immunhemmer med unike trippelmålrettingsegenskaper. J Immunol. 2013;190:5712-5721.

26. Wilson HR, Medjera-Thomas NR, Gilmore AC, et al. Glomerulært membranangrepskompleks er ikke en pålitelig markør for pågående C5-aktivering ved lupus nefritis. Nyre Int. 2019.95655-665.

27. Antonioli AH White J, Crawford F, et al. Modulering av den alternative komplementveien av murine faktor H-relaterte proteiner. J Immunol. 2018;200:316-326.

28. Cserhalmi M, CsincsiALMezei Z, et al. Det murine faktor H-relaterte proteinet FHR-B fremmer komplementaktivering. Front Immunol.20178:1145.

29. Medjeral-Thomas NR, Moffett H, Lomax-Browne HJ et al. Glomerulær komplementfaktor H-relatert protein 5 (FHR5) er svært utbredt i C3 glomerulopati og assosiert med nedsatt nyrefunksjonKdney Int Ren. 2019;4:1387-1400.

30. Miwa T, Sato S, Gullipalli D, et al. Blokkering av properdin, den alternative veien, og anafylatoksinreseptorer forbedrer nyreiskemi-reperfusjonsskade i forfallsakselererende faktor og CD59-dobbelt knockout-mus. J Immunol. 2013;190:3552-3559.

31. Corillo F, Bravo Garcia-Morato M, Nozal P, et al. Serumproperdinforbruk som en biomarkør for C5-konvertase-dysregulering i C3-glomerulopati. Clin Exp Immunol.2016;184:118-125.8. Lesher AM, Zhou L Kimura Y, et al. Kombinasjon av faktor H-mutasjon og properdinmangel forårsaker alvorlig C3-glomerulonefritt.JAm Soc Nephrol.2013;2453-65.

32. zhang Y, Nester OM Martin B. et al. Definere komplementbiomarkørprofilen til C3 glomerulopati. Clin J Am Soc Nephvol.20149:186-1882.