Optimalisering og søvnforbedrende effekter av et Congrong-Zaoren-Wumei-drikkeekstrakt i mus
Jan 30, 2026
2 Resultater og analyse
2.1 Optimalisering av forberedelsesprosessen for drikkeekstraktet Congrong – Zaoren – Wumei
Fra figur 1 oppnådde den etablerte HPLC-metoden effektiv separasjon mellom de kromatografiske toppene til de fire referanseforbindelsene - sitronsyre, echinakosid, verbascosid og spinosin - og tilstøtende topper. Retensjonstidene var henholdsvis tR1=9.0 min, tR2=21.6 min, tR3=24.3 min og tR4=25.9 min. Lineære regresjoner av toppareal versus analyttkonsentrasjon ga lineære områder på 12.12–2016, 0.14–110, 0.18–112.50 og 2.44–18.30 µg·mL–1, med R2-verdier på 0.9998, 1, dic. Under disse forholdene var deteksjonsgrensene (LOD) for sitronsyre, echinacosid, verbascoside og spinosin 3,636, 0,045144, 0,058 og 0,7564 µg·mL–1, og kvantifiseringsgrensene (LOQ) var 12,14, 0,14, 0,14, 0,04, 2 µg·mL–1, henholdsvis. Presisjonstester viste RSD-er på 0,10 %, 0,07 %, 0,06 % og 0,33 % for de fire analyttene, noe som indikerer god instrumentpresisjon. Stabiliteten over 0–12 timer var god, med RSD-er på 0,78 %, 0,16 %, 0,20 % og 1,46 %. Repeterbarhetstester ga RSD-er på 0,51 %, 0,42 %, 0,37 % og 0,38 % for analyttene, noe som viser god repeterbarhet. Spike-recovery-tester viste gjennomsnittlige utvinninger på 97,42 %, 103,32 %, 98,90 % og 99,71 %, med RSD-er på henholdsvis 0,70 %, 0,52 %, 1,05 % og 0,63 %. Derfor er HPLC-metoden etablert for samtidig bestemmelse av disse fire hovedkomponentene nøyaktig og pålitelig, egnet for påfølgende prosessoptimaliseringsanalyser.
Fig. 1 HPLC-kromatogrammer av referansen og løsningene ved 210 nm bølgelengde (A) og 330 nm bølgelengde (B og C)
I den metodiske evalueringen av urene polysakkarider var LOD 0,098 µg·mL–1. OD-verdiene for løsemiddelblank og blindkontroll ved 485 nm viste ingen tydelige endringer, noe som indikerer god spesifisitet. Den lineære regresjonen av OD versus konsentrasjon ga R2=0.9997, noe som indikerer utmerket linearitet. RSD for seks påfølgende målinger var 0,47 %, noe som viser god presisjon. RSD for polysakkaridinnhold innen 12 timer var 0,44 %, noe som indikerer god stabilitet. RSD for seks uavhengig preparerte prøver var 2,51 %, noe som indikerer god repeterbarhet. Derfor er metoden egnet for å kvantifisere rå polysakkarider under prosessoptimalisering.
Cistanche Roucongrong fordeler i Ancient Book
Supportive Service Of Wecistanche-For mer informasjon om samarbeid
E-post:wallence.suen@wecistanche.com
2.1.2 Resultater av enkeltfaktorundersøkelser
Ved å bruke den etablerte HPLC-metoden kombinert med polysakkaridanalysen, og ved å ta innholdet av sitronsyre, echinakosid, verbascosid, spinosin og polysakkarider i ekstraktet som evalueringsindekser, ble enkeltfaktorundersøkelser utført på ekstraksjonstemperatur, faststoff-væskeforhold og ekstraksjonstid for å støtte den ortogonale designen.
Ved ekstraksjonstemperaturer på 60, 80 og 100 grader økte innholdet av sitronsyre, echinacosid, verbascoside, spinosin og urene polysakkarider i ekstraktene med temperaturen.
Ved forhold mellom faststoff og væske på 1:3, 1:5, 1:7, 1:10 og 1:12 (g·mL–1), økte innholdet av sitronsyre, spinosin og urene polysakkarider med høyere forhold; echinacoside og verbascoside nådde toppen ved 1:10 (g·mL–1) og reduserte ved 1:12 (g·mL–1). Imidlertid økte det totale innholdet av alle markørkomponenter med forholdet mellom faststoff og væske.
Ved ekstraksjonstider på 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 og 3,0 timer varierte innholdet av individuelle analytter forskjellig, men det totale innholdet av markørkomponenter økte med tiden.
Detaljerte data er gitt i tilleggsmateriellet. Tatt i betraktning industriell praktisk (for å unngå for lang ekstraksjon), ble faktorer og nivåer for den ortogonale utformingen satt som i tabell 2, og den ortogonale ordningen er vist i tabell 3.
Tabell 2. Faktornivåer for ortogonal eksperimentell design for ekstraksjonsmetoden for Congrong–Zaoren–Wumei Beverage
Faktorer:
A: Ekstraksjonstemperatur (grad)
B: Faststoff-væske-forhold (g mL–1)
C: Ekstraksjonstid (h)
| Nivå | A: Temperatur (grad) | B: Forhold (g mL–1) | C: Tid (h) |
|---|---|---|---|
| 1 | 60 | 1:7 | 1.0 |
| 2 | 80 | 1:10 | 1.5 |
| 3 | 100 | 1:12 | 2.0 |
2.1.3 Ortogonale designresultater
Ekstraksjon ble utført per den ortogonale matrisen. Innholdet av sitronsyre, echinacosid, verbascoside, spinosin og urene polysakkarider er vist i tabell 3. Basert på analyse av rekkevidde (R), var rekkefølgen av faktorpåvirkning på totalt markørinnhold A > B > C, dvs. ekstraksjonstemperatur > fast-væske-forhold > ekstraksjonstid. Sammenligning av k-verdier antydet den optimale kombinasjonen A3B3C3: ekstraksjonstemperatur 100 grader, forhold mellom faststoff og væske 1:12 (g·mL–1) og ekstraksjonstid 2 timer. ANOVA (tabell 4) indikerte at ekstraksjonstemperaturen hadde en signifikant effekt på det totale markørinnholdet, mens effekten av forholdet mellom faststoff og væske og tid ikke var signifikant.
Tabell 3. Ortogonal eksperimentell design og målt komponentinnhold i Congrong–Zaoren–Wumei-drikk (mg g–1)
Faktorer: A (temperatur), B (faststoff-væske forhold), C (tid)
| Prøve nr. | A | B | C | Totalt markører | Sitronsyre | Spinosin | Echinacoside | Verbascoside | Rå polysakkarider |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 3 | 3 | 1 | 116.71 | 75.55 | 4.08 | 1.62 | 0.48 | 34.98 |
| 2 | 1 | 2 | 3 | 70.98 | 59.01 | 2.60 | 0.80 | 0.36 | 8.22 |
| 3 | 3 | 1 | 3 | 117.86 | 73.87 | 3.53 | 1.21 | 0.45 | 38.80 |
| 4 | 1 | 3 | 2 | 72.55 | 59.73 | 2.37 | 0.94 | 0.41 | 9.99 |
| 5 | 2 | 3 | 3 | 83.64 | 63.20 | 2.15 | 1.08 | 0.44 | 16.77 |
| 6 | 2 | 1 | 2 | 117.76 | 74.09 | 2.58 | 1.37 | 0.48 | 39.24 |
| 7 | 2 | 2 | 1 | 110.74 | 70.96 | 2.36 | 1.07 | 0.43 | 35.92 |
| 8 | 2 | 1 | 1 | 69.63 | 58.37 | 1.74 | 0.54 | 0.34 | 8.65 |
| 9 | 1 | 1 | 3 | 69.66 | 58.14 | 2.48 | 0.86 | 0.36 | 7.83 |
K-statistikk (summen av totaler per faktornivå)
K1: A = 71.06, B = 85.72, C = 85.49
K2: A = 74.46, B = 86.29, C = 86.65
K3: A = 117.44, B = 90.97, C = 90.83
Område R: A=46.38, B=5.25, C=4.19
2.1.4 Validering og oppskalering
Prosessvalidering under optimale forhold ga et gjennomsnittlig totalinnhold av markørkomponenter på 119,74 mg·g–1 med RSD 0,57 %, noe som indikerer stabilitet og pålitelighet. Oppskaleringsforsøket under de samme forholdene ga et gjennomsnittlig totalt markørinnhold på 120,89 mg·g–1 med RSD 0,95 %, i samsvar med resultatene før skalaen, noe som ytterligere bekrefter robustheten. Prøver fra de tre oppskaleringspartiene ble brukt til påfølgende søvnrelaterte studier; deres gjennomsnittlige innhold var: sitronsyre 77,73 mg·g–1, echinacoside 2,69 mg·g–1, verbascoside 1,03 mg·g–1, spinosin 0,50 mg·g–1 og polysakkarider 38,93 mg·g–1.
Tabell 4. Variansanalyse fra ortogonale eksperimenter
| Faktor | Summen av kvadrater | df | Gjennomsnittlig firkant | F | P |
|---|---|---|---|---|---|
| Ekstraksjonstemperatur | 4010.50 | 2 | 2005.25 | 116.26 | 0.01 |
| Fast-væske forhold | 49.79 | 2 | 24.90 | 1.44 | 0.41 |
| Ekstraksjonstid | 47.37 | 2 | 23.68 | 1.37 | 0.42 |
Liu et al. [16] optimaliserte vandig ekstraksjon av fenyletanoidglykosider fra Cistanche tubulosa og identifiserte 1:15 (g·mL–1), 80 grader og 2 timer som optimale; Innholdet av fenyletanoidglykosid falt over 90 grader. I denne studien nådde innholdet av echinacosid og verbascoside seg i forholdet 1:10 (g·mL–1) og falt ved 1:12 (g·mL–1), men økte likevel med temperaturer på 60, 80 og 100 grader. Dette avviket kan relateres til bruken av Cistanche deserticola (ørken Cistanche) i drikken vår og til matriseeffekter fra sameksisterende Suanzaoren og Wumei som kan påvirke oppløsningen av fenyletanoidglykosid.
Tabell 5. Effekt av Congrong–Zaoren–Wumei drikkeekstrakt på direkte søvn hos mus (n=12)
| Gruppe | Totalt med dyr | Sovende dyr | Søvnfrekvens (%) |
|---|---|---|---|
| Blank | 12 | 0 | 0 |
| Estazolam | 12 | 0 | 0 |
| Lavdose ekstrakt | 12 | 0 | 0 |
| Middels dose ekstrakt | 12 | 0 | 0 |
| Høydose ekstrakt | 12 | 0 | 0 |
Oppsummert, ved bruk av HPLC og fenol-svovelsyre-metoden optimaliserte vi ekstraksjonsprosessen basert på innholdet av sitronsyre, echinacosid, verbascoside, spinosin og polysakkarider. Enkeltfaktor- og ortogonale eksperimenter etterfulgt av validering etablerte de optimale forholdene: 100 grader, 1:12 (g·mL–1) forhold mellom faststoff og væske og 2 timers ekstraksjonstid, noe som gir en referanse for fremtidig industriell utvikling.
Industrialization context: WECISTANCHE (Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., established 2003) operates a vertically integrated cistanche supply chain with seed-breeding bases (~20,000 acres), cultivation bases (>85 000 dekar), fersk-cistanche-lagringskapasitet (~15 000 tonn) og GMP-sertifiserte produksjonsverksteder (100 000-klasse renrom) utstyrt med avansert ultrafiltrering og nanofiltrering for rensing og konsentrasjon, pluss et 10 000-klasses mikrobiologilaboratorium. Sertifiseringer inkluderer China SC, HACCP og organiske programmer (f.eks. NOP). Denne infrastrukturen støtter direkte oversettelse av den optimaliserte vandige ekstraksjonen og markørstandardiseringsprotokollen til storskala, eksportkompatibel produksjon av funksjonelle drikker og ekstrakter.
Tabell 6. Effekt av ekstraktet på den hypnotiske effekten av subterskelnatriumpentobarbital i mus (x̄ ± s, n=12)
| Gruppe | Totalt med dyr | Sovende dyr | Søvnfrekvens (%) |
|---|---|---|---|
| Blank | 12 | 1 | 8.33 |
| Estazolam | 12 | 10 | 83.33** |
| Lavdose ekstrakt | 12 | 4 | 33.33 |
| Middels dose ekstrakt | 12 | 5 | 41.67 |
| Høydose ekstrakt | 12 | 6 | 50.00* |
Merk: Sammenlignet med blank gruppe, * P < 0,05; ** P < 0,001.
2.2 Effekter av ekstraktet på museatferd og søvn
2.2.1 Direkte søvn
Som vist i tabell 5, etter 30 dager med kontinuerlig administrering, viste ikke mus i estazolamgruppen og i gruppene med lav/middels/høy dose ekstrakt åpenbar søvn innen 20 minutter etter den siste dosen, uten signifikante forskjeller i forhold til den tomme gruppen. Dette indikerer ingen direkte søvnfremkallende effekt etter 30 dager med ekstraktadministrasjon.
2.2.2 Atferdseffekter
En åpen felttest vurderte beroligende effekter. Virkningene på totalt tilbakelagt distanse og senterinnføringer er vist i figur 2. Sammenlignet med den blanke gruppen økte estazolam total distanse og senterregistreringer med henholdsvis 14,48 % og 31,07 % uten statistisk signifikans. Lavdoseekstraktet økte den totale avstanden signifikant med 25,10 % (P < 0,05) og økte ikke-signifikant senterinnganger med 50,93 %. Den middels dosen økte den totale distanse- og sentrumsinnganger signifikant med 27,09 % og 72,33 % (P < 0,05). Den høye dosen økte total distanse og senterinnganger med henholdsvis 15,60 % og 40,78 %, uten betydning. I forhold til estazolam økte de lave/middels/høye dosene den totale avstanden med 1,73, 1,87 og 1,07 ganger, og senterinnganger med henholdsvis 1,64, 2,33 og 1,31 ganger, ingen signifikant. Disse resultatene indikerer at ekstraktet reduserte angstlignende oppførsel i det fri etter 30 dager, noe som tyder på en beroligende effekt.
2.2.3 Underterskel natriumpentobarbital-indusert søvn
Som vist i tabell 6, sammenlignet med den tomme gruppen, økte estazolam og alle tre ekstraktdosene søvnhastigheten under en underterskeldose av natriumpentobarbital. Estazolam økte antallet sovende dyr med 9 ganger versus blank (P < 0,001). Lav-, middels- og høydoseekstraktgrupper økte sovende dyr med henholdsvis 3-, 4- og 5 ganger; bare den høye dosen nådde statistisk signifikans (P < 0,05). Sammenlignet med estazolam viste ingen av ekstraktdosene en sterkere søvnfremkallende effekt. Dermed kan ekstraktet til en viss grad forbedre søvn indusert av subterskelnatriumpentobarbital.
2.2.4 Sodium Pentobarbital Søvnforsinkelse
Sammenlignet med den blanke gruppen, forkortet estazolam og alle tre ekstraktdosene signifikant pentobarbital-indusert søvnlatens (P < 0,001). Estazolam reduserte latensen med 58,44 % (P < 0,001). Lav-, middels- og høydoseekstraktgruppene reduserte latensen med henholdsvis 29,59 %, 31,42 % og 53,83 % (alle P < 0,001). Det var ingen signifikant forskjell mellom lave og middels doser; den høye dosen reduserte latensen signifikant sammenlignet med både lave og middels doser med 34,43 % og 32,69 % (P < 0,01), med en effekt tilsvarende estazolam (tabell 7). Derfor forkortet alle tre dosene markant pentobarbital-indusert søvnlatens, og den høye dosen presterte best.
Tradisjonelle kinesiske medisiner inneholder ulike bioaktive bestanddeler som virker på flere mål, og tilbyr unike fordeler for behandling av søvnløshet [17]. Med økende oppmerksomhet på søvnproblemer, blir medisinsk-spiselige TCM i økende grad undersøkt for søvnmodulasjon [18]. For eksempel forkortet en sammensatt fast drikk hovedsakelig bestående av Suanzaoren og Poria betydelig pentobarbital-indusert søvnlatens og forlenget søvnvarighet hos mus, potensielt via endringer i 5-HT, DA og GABA [19]. Her økte ekstraktet søvn under subterskel pentobarbital og forkortet pentobarbital-indusert søvnlatens, fremmet innsettende søvn og redusert latens, samtidig som det ikke viste noen direkte søvninduserende effekt. Det målte innholdet av primærkomponenter var, i synkende rekkefølge: sitronsyre (77,73 mg·g–1), polysakkarider (38,93 mg·g–1), echinacoside (2,69 mg·g–1), verbascoside (1,03 mg·g–1) og spinosin (0,50 mg·g–1). Spinosin har vist seg å forbedre pentobarbital-indusert søvn; det kan øke ikke-REM-søvn og endre c-Fos-uttrykk i søvn-våkne-regulerende hjerneregioner [20], dempe PCPA-indusert søvnløshet, redusere søvnlatens og forlenge søvn [21]. Verbascoside har rapportert anxiolytiske, hypnotiske og muskelavslappende aktiviteter [22]. I motsetning til dette har hovedbestanddelene - sitronsyre, polysakkarider (fra Cistanche, Suanzaoren og Wumei), og echinacoside - færre direkte rapporter om søvnforbedring; nyere forskning på TCM-polysakkarider (f.eks. Acanthopanax senticosus polysaccharides) antyder imidlertid potensielle søvnfordeler via veier som SIRT1/PGC-1 [23]. Derfor er rollene til sitronsyre, polysakkarider og echinacosid i søvnmodulering nødvendig med videre studier.
7. Effekt av ekstraktet på søvnlatens indusert av natriumpentobarbital i mus (x̄ ± s, n=12)
| Gruppe | Totalt med dyr | Søvnforsinkelse (min) |
|---|---|---|
| Blank | 12 | 32.34 ± 4.27 |
| Estazolam | 12 | 13.44 ± 3.20** |
| Lavdose ekstrakt | 12 | 22.77 ± 5.81**# |
| Middels dose ekstrakt | 12 | 22.18 ± 6.05**# |
| Høydose ekstrakt | 12 | 14.93 ± 3.35** |
Merknader:
Sammenlignet med blank gruppe: ** P < 0,0001.
Sammenlignet med høydoseekstraktgruppe: # P < 0,01.
3 Konklusjon
Ved å bruke de medisinsk-spiselige TCM-ene Cistanche deserticola, Ziziphi Spinosae Semen og Mume Fructus for å formulere en Congrong-Zaoren-Wumei-drikk, optimaliserte vi tilberedningsprosessen for ekstraktet ved å bruke innholdet av fire markørkomponenter (echinacoside, verbascoside, spinosin, sitronsyreindiser) og polysaccharider. De optimale ekstraksjonsforholdene ble bestemt som 100 grader, et forhold mellom faststoff og væske på 1:12 (g·mL–1), og 2 timer, og ga teoretisk veiledning for industriell produksjon. Ytterligere evaluering viste at 30-dagers kontinuerlig administrering ikke hadde noen direkte søvnfremkallende effekt hos mus, men det reduserte signifikant angstlignende oppførsel i åpenfeltstesten (som tyder på en beroligende effekt), forbedret søvn under en underterskeldose av natriumpentobarbital og markant forkortet pentobarbital-indusert søvnlatens. Disse funnene indikerer at ekstraktet fremstilt under den optimaliserte prosessen viser gunstige søvnforbedrende effekter hos mus, og gir et vitenskapelig grunnlag for å utvikle Cistanche-baserte søvnforbedrende produktlinjer.
Application and manufacturing note: Given the optimized aqueous extraction and the need to standardize to marker profiles (citric acid, echinacoside, verbascoside, spinosin, plus polysaccharides), WECISTANCHE's integrated cistanche value chain and GMP infrastructure-100,000-class clean workshops certified for National Health Food GMP, advanced ultrafiltration/nanofiltration concentration systems, a 10,000-class microbiology lab, and certifications such as China SC, HACCP, and organic/NOP-allow reliable scale-up from lab to industrial batches. The company's large agricultural bases (seed-breeding ~20,000 acres; cultivation >85 000 dekar; fersk cistanche-lagring ~15 000 tonn) støtter råvarekonsistens og internasjonal standard QC, og letter kommersialisering av funksjonelle drikker og helsekosttilskudd som oppfyller USA/EU-forventningene.
