De Novo transkriptomsamling og genoppdagelse av Cistanche Deserticola kjøttfulle stamme-Ⅱ

Funksjonell klassifisering av alle uttrykte transkripsjoner basert på genontologi og KEGG-databaser

Gene Ontology (GO) merknad ble hentet fra UniProt merknads- og identitetsassosiasjonsfil. Totalt ble 20 907 transkripsjoner, som utgjør 32,69 % av de totale uttrykte sekvensene, tildelt 1 745 funksjonelle termer. Av de totale funksjonelle GO-termene utgjorde tilordninger til den biologiske prosessen majoriteten (1 116, 63,95 %) etterfulgt av cellulær komponent (329, 18,85 %) og molekylær funksjon (300, 17,20 %). De tildelte funksjonene til uttrykte transkripsjoner dekket et bredt spekter av GO-kategorier, og de 10 beste GO-termene med de mest kommenterte transkripsjonene ble oppført i tabell 3. Vi tilbyr distribusjon av alle uttrykte transkripsjoner i tre genontologikategorier (molekylær funksjon, cellulær komponent og biologisk prosess) i tilleggsfilen (S3-datasett). GO-termer relatert til bindingsfunksjoner og transferaseaktivitet var hovedsakelig representert i kategorien molekylær funksjon. Når det gjelder bindingsfunksjonene, representerte kationbinding (4.394 transkripsjoner) den mest utbredte, etterfulgt av nukleotid/nukleosidbinding (3.404 transkripsjoner i gjennomsnitt) og proteinbinding (2.422 transkripsjoner). Mens de er i transferaseaktivitetsgruppen, er de mest de med overførende fosforholdige grupper (2256 transkripsjoner, 65,77%). Blant den cellulære komponentkategorien var transkripsjoner mer lokalisert intracellulært (10 581 transkripsjoner i gjennomsnitt), mens blant kategorien biologiske prosesser var transkripsjoner mer involvert i den biopolymermetabolske prosessen (6 683 transkripsjoner i gjennomsnitt), etterfulgt av regulering av cellulær prosess (4 841 transkripsjoner) ), genuttrykk (4.678 transkripsjoner) og transport (3.512 transkripsjoner).

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR FOREBYGGING AV ALZHEIMER SYKDOM PHGS75% ECH 30% ACT 12%

For å utvinne gener involvert i biosyntesen av lignin og PhG, ble 21 358 ikke-overflødige potensielle proteinsekvenser søkt mot gensekvenser til 13 planteorganismer i KEGG-databasen, og de ble tildelt 275 KEGG-veier med minst 5 treff. De 10 beste banene med flest justerte sekvenser er oppført i tabell 4. De fleste banene var involvert i primære metabolske prosesser, slik som aminosyre- eller proteinmetabolisme (ko01230, ko04141 og ko04120), karbohydratmetabolisme (ko01200 og ko00500), og nukleotid- eller nukleosidmetabolisme (ko03018, ko00230 og ko00240). Dessuten er det 27 sekundære metabolismerelaterte veier (fig 2), slik som terpenoid ryggradsbiosyntese, fenylpropanoidbiosyntese, karotenoidbiosyntese, isokinolinalkaloidbiosyntese og tropan-, piperidin- og pyridinalkaloidbiosyntese. Disse resultatene gir ytterligere indikasjon på at aktive metabolske prosesser var i gang iC. deserticolastammevev. Alle uttrykte transkripsjoner assosiert med KEGG-veier ble oppført i tilleggsfilen (S4-datasett). Selv om det er noen betydelig endrede veier mellom C. deserticola og andre planter, for eksempel ris (S5 Dataset), er vårt hovedmål i denne studien å avsløre hele transkriptomprofilen til C. deserticola-stammen og å se de relaterte veiene for PhGs biosyntese som kan være nyttig for å lede dyrkingen.

Kandidatgener som koder for enzymer involvert i biosyntesen av lignin

Lignin er den nest vanligste naturlige terrestriske polymeren i planteriket, og utgjør opptil en tredjedel av materialet som finnes i plantecellevegger. Som en viktig komponent i celleveggene hjelper ligniner vanntransport, gir mekanisk støtte og strukturell integritet, og forsvarer seg mot patogener og planteetere. Disse rollene til lignin er svært verdifulle for å støtte den underjordiske erektive veksten av C. deserticola i ørkenen. I denne studien presenterte vi det komplette bildet av ligninbiosynteseveier i C. deserticola (fig 3), der ligninmonomerene biosyntetiseres fra fenylalanin gjennom en rekke enzymatiske reaksjoner, inkludert hydroksylering, metylering, reduksjon og oksidativ polymeriseringsprosess. Ligninbiosyntese-relaterte enzymer ble påvist for tre hovedsakelig syntetiserte former i vaskulært vev (p-hydroksyl-fenyl (H), guaiacyl (G) og syringyl (S) lignin) og 5- hydroksyl-guaiacyl lignin som bare ble identifisert i COMT (koffeinsyre 3-O-metyltransferase, EC 2.1.1.68) mangelfulle (som knock-down) planter.

Fenylalanin ammoniakk-lyase (PAL, EC 4.3.1.24) er det første nøkkelenzymet i ligninbiosynteseveien (fig 3) som transformerer fenylalanin til kanelsyre ved ikke-oksidativ deaminering. Totalt 6 297 PAL-avlesninger ble sekvensert og 7 PAL-transkripsjoner ble satt sammen i C. deserticola (tabell 5). Ved sammenligning av sekvenslikheter fant vi at 4 av dem (komp{28550_c1_seq1/2/3/5) hadde mer enn 95 % likhet med den kjente mRNA-sekvensen til C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), mens comp28550_c1_seq4 og comp25940_c0_seq1 hadde henholdsvis 77 % og 82 % likheter. ORF-prediksjon avslørte at 5 transkripsjoner hadde potensialer for kodende proteiner og båret med aromatisk aminosyrelyasedomene (PF00221.14). Blant dem var det bare comp28550_c1_seq4-transkriptet som kunne kode for en komplett proteinsekvens på 718 aminosyrerester. Det har blitt rapportert at PAL ble kodet av en liten multigenfamilie i de fleste plantearter, slik som 4 i Arabidopsis thaliana, 5 i Populus trichocarpa, 3 i Scutellaria baicalensis og 7 Cucumis sativus, etc. Vår fylogenetiske analyse antydet at det var 4 PAL-kodende gener i C.

deserticola og vi kalte dem henholdsvis CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 og CdPAL4 (S2 Fig). 4-kumarat-CoA-ligase (4CL, EC 6.2.1.12) og trans-cinnamat 4-monooksygenase (CYP73A, EC 1.14.13.11) er to enzymer som er ansvarlige for å transformere kanelsyre til dikumarol-CoA i to omvendte bestillinger. De er også i ryggrad, og deres uttrykks FPKM-verdier er henholdsvis 39,57 og 51,93.

De fire typene ligniner ble biosyntetisert av forskjellige veier som ble kontrollert av tre nøkkelenzymer, cinnamoyl-CoA-reduktase (CCR, EC 1.2.1.44), shikimat o-hydroxycinnamoyltransferase (HCT, EC 2.3.1.133) og ferulat{{1{ {56}}}}hydroksylase (F5H, EC 1.14.-.-). CCR ble rapportert som et kontrollpunkt for ligninbanen [50, 51] som katalyserte X-CoA (X inkludert dikumarol, caffeoyl, feruloyl, 5-hydroksyl-feruloyl og sinapoyl) til Y-aldehyd (Y inkludert p -cougar, caffeoyl, coniferyl, 5-hydroksyl-coniferyl og snap), mens HCT katalyserte p-coumaroyl-CoA til p-coumaroyl shikimic acid/p-coumaroyl kininsyre. De to enzymene, akkurat som en bryter, regulerte biosyntesen av P-hydroksyl-fenylligniner eller de tre andre typene ligniner. F5H var en annen grenbryter som regulerte syringyllignin og 5-hydroksyl-guaiacyllignin. Andre viktige enzymer, inkludert koffeinsyre 3-O-metyltransferase (COMT, EC 2.1.1.68), caffeoyl-CoA O-methyltransferase (CCoAOMT, EC 2.1.1.104) og cinnamyl-alkoholdehydrogenase (CAD, EC 1.51.1.1. ) ble også detektert uttrykt. Detaljert ekspresjonsinformasjon er oppført i tabell 6. Disse enzymgenene identifisert i denne studien vil gi en verdifull ressurs for funksjonelle genomiske studier i denne viktige medisinplanten. 10 gener relatert til ligninbiosynteseveien i tabell 6 ble valgt for RT-qPCR-verifisering for å bekrefte RNAseq-resultatene våre (fig 4), og deres høye korrelasjoner (Pearson-korrelasjonskoeffisient: 0,90343) indikerte høy nøyaktighet og reproduserbarhet av transkriptomanalysen vår. S1 Dataset viser primersekvensene som brukes i denne analysen.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBEDRING AV SEKSUELL FUNKSJON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Kandidatgener som koder for enzymer som er involvert i biosyntesen av PhG-er

Fenyletanoidglykosider (PhGs) er kjent for å være de primære aktive ingrediensene i C. deserticola med aktiviteter for å forbedre seksuell potens, fjerne frie radikaler og anti-aldring. Tre kjemiske komponenter i PhG er organisk syre, sakkarid og fenyletanolaglykon (fig 3). De organiske syrene inkludert koffeinsyre, ferulsyre og kumalsyre er produkter av fenylpropanoid biosynteseveien. Komponentene til sakkarid inkludert glukose og rhamnose er produkter av karbohydratmetabolismeveier, slik som stivelse- og sukrosemetabolisme, aminosukker- og nukleotidsukkermetabolisme, fruktose- og mannosemetabolisme, etc. Biosynteseveien til fenyletanoldelen er imidlertid ikke klar ennå. Her foreslo vi to mulige biosynteseveier for fenyletanol basert på sekvensdataene våre. Den ene er den rapporterte koffeinsyre- eller ferulsyreveien, også kjent som kanelsyreveien som ligner på ligninbiosyntese-ryggradsveien. En annen er basert på fenylalaninmetabolismeveien (fig 3), der fenylalanin til fenyletanol ble oppnådd ved en kjent 'Enrlich-vei' som først ble funnet i gjær for ett århundre siden og validert i petunia-blomster, tomat og rose. Fire enzymgener som koder for aspartat/tyrosinaminotransferase, histidin-fosfataminotransferase og primær-aminoksidase som er ansvarlige for omdannelsen av fenylalanin til fenyletanol ble påvist uttrykt i stammen til C. deserticola. Produktet av fenyletanol kan oksideres ytterligere av monooksygenase eller metyleres av metyltransferase til dets derivater (fenyletanolaglykon) som deltar i PhG-biosyntesen. Oppsummert ble to antatte biosynteseveier av fenyletanolaglykon foreslått forC. deserticolamen trenger fortsatt å studere videre.

Diskusjoner

De siste årene har plantegenomikk utviklet seg raskt med bruk av neste generasjons sekvenseringsteknologi, mens få undersøkelser har vært fokusert på genomikken til ørkenmedisinplanter. Det er påtrengende nødvendig å utføre genomisk eller transkriptomisk forskning for å forstå dens tilpasning til tørke- og saltholdighetsmiljøer og biosynteseveien til de viktigste bioaktive komponentene. De novo transkriptom-oppdagelsen for noen medisinske planter,

som Panax ginseng, Ginkgo biloba og Glycyrrhiza uralensis har først blitt utnyttet ved å bruke Roche 454-plattformen for sin lange leselengde. På grunn av den effektive monteringsevnen med korte avlesninger, spesielt de fordelaktige avlesningene med parende ende, har Illumina-basert transkriptomsekvensering og montering også blitt mye brukt for modell- og ikke-modellorganismer. I denne studien genererte vi omtrent 8G av 101 bp parede endeavlesninger og produserte lengre unigensekvenser med 725 bp gjennomsnittlig lengde. Storskala stamspesifikke transkriptomdata kan gi nyttige referansedata og brukes til å utvinne den sekundære metabolismen av bioaktive komponenter av C. deserticola. Det er 81,62 % av de totale råavlesningene som har bestått strenge kvalitetsfiltre (inkludert adaptertrimming og avlesning av lav kvalitet) før montering, noe som tyder på den høye kvaliteten på sekvenseringsdataene våre, og 82,08 % av avlesningene av høy kvalitet var nyttige for montering. Andre lesninger som ikke ble brukt til montering kan komme fra sekvenseringsfeil, monteringsparametere et al. Disse ubrukte høykvalitetslesningene forble nyttig for å forbedre de novo-monteringen kombinert med lengre lesninger fra en annen plattform (som Roche 454) i fremtiden.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBEDRING AV SEKSUELL FUNKSJON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Et stort antall sammensatte transkripsjoner (30 098) viste høye sekvenslikheter med kjente gener i offentlige databaser, noe som tyder på at våre Illumina-baserte parede data dekket en betydelig del av transkripsjonene av C. deserticola. Transkripsjoner uten BLAST-treff kan skyldes 3' eller 5' utranslaterte regioner, ikke-kodende RNA eller nye gensekvenser av C. deserticola. De uttrykte transkripsjonene ble kommentert til et bredt spekter av GO-kategorier og KEGG-veier (tabell 3 og 4), der mange transkripsjoner ble tildelt sekundære metabolismerelaterte veier. Som vi vet, kan fenylpropanoid fungere som en induserbar antimikrobiell forbindelse med stor fordel for en underjordisk livsstil [1], og også fungere som et signalmolekyl i plante-mikrobe interaksjoner i tillegg til dens medisinske nytte [68, 69]. Terpenoid brukes til biosyntese av bioaktive komponenter (som 6- deoksykatalpol) [70]. Vi fant gener involvert i biosynteseveien for fenylpropanoid og terpenoid ryggrad var svært rikelig i C. deserticola. Enda viktigere, oppdagelsen av godt representerte veier for ligninbiosyntese (fig 3) indikerte den aktive metabolske prosessen av lignin i C. deserticola-stammen. Alle kjente enzymgener involvert i biosyntesen av lignin (fig 3) ble påvist uttrykt, og fire nøkkelenzymer inkludert PAL, CCR, HCT og F5H hadde lavere ekspresjonsmengde (henholdsvis FPKM 26.47, 3.89, 3.4 og 3.83) sammenlignet med andre enzymgener (tabell 6). Hvorvidt ekspresjonsendringen av disse tre genene kan påvirke ligninproduksjonen i C. deserticola er verdt å studere videre. PAL er et nøkkelenzym i ligninbiosyntesen og er også involvert i biosyntesen av fenylpropanoid, resveratrol, flavonoid og kumarin [71–74]. Vi oppdaget fire distinkte PAL-gener i C. deserticola-genomet (S2 Fig) som var sammenfallende med at PAL ble kodet av en liten multigenfamilie [39, 43, 45-49] og viste videre at det kan spille viktige roller i metabolsk karbonfluks .

PhG er den primære aktive ingrediensen i C. deserticola. Gener involvert i biosyntesen av fenyletanol er viktige for kvaliteten til C. deserticola. Vi utledet to forskjellige biosynteseveier av fenyletanol og 17 enzymgener involvert i PhG-biosyntese i C. deserticola-stammen. De mulige post-kaffein/ferulinsyre-prosessene (fig 3) ble også utledet for første gang basert på en strukturformel av mellomprodukter og katalytiske egenskaper til tilsvarende enzymer, der koffein/ferulsyren først ville bli oksidert til fenylpyruvatderivat; deretter ble karboksylgruppen fratatt av dekarboksylaser; til slutt ble aldehydgruppen omdannet tilbake til alkoholgruppe ved dehydrogenase. Dette er den første anvendelsen av Illumina-sekvenseringsteknologi med paret ende for å undersøke hele transkriptomet til C. deserticola og for å sette sammen RNA-seq-lesninger uten et referansegenom. Denne studien vil gi nyttige ressurser og gensekvenser for funksjonell genomikk og proteomikkforskning på C. deserticola i fremtiden.

Konklusjoner

I denne studien profilerte vi transkriptomet til C. deserticola-stammen basert på sekvenseringsdata med høy gjennomstrømning, identifiserte gener involvert i biosynteseveier av lignin, og antydet også den potensielle biosynteseveien til PhGs for første gang, noe som sikkert vil akselerere forståelsen av de tvetydige fysiologiske prosessene og den store medisinske verdien på molekylært nivå. Til nå er dette det første forsøket på å de novo sette sammen hele transkriptomet til C. deserticola-stammen og å oppdage biosynteseveien til medisinske komponenter ved å bruke Illumina-baserte sekvenseringsdatasett. Vår studie kan fremme utviklingen av naturmedisiner og utvalg av kultivarer med medisinske egenskaper.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBEDRING AV SEKSUELL FUNKSJON PHGS75% ECH 30% ACT 12%