Dendrimer-tesaglitazar-konjugat induserer en fenotypeforskyvning av mikroglia og forbedrer -amyloid fagocytose† Del 3

D-Tesa økte uttrykket av enzymer som er ansvarlige for fjerning av patogene proteiner

Insulinnedbrytende enzym (Ide) og matrisemetalloprotease 9(MMP9) er enzymer utskilt av mikroglia som bryter ned ekstracellulært -amyloid og -synuklein.71,72 D-Tesa-behandling økte uttrykket av Ide 3.1- ganger betydelig (p < 0.001) med en trend mot økende MMP9-uttrykk (1.8-foldøkning, p=0.057) sammenlignet med kontroller som kun er behandlet med LPS (fig. 6A og B).

De siste årene har flere og flere studier vist at det er en nær sammenheng mellom insulinnedbrytende enzymer og hukommelse. Denne oppdagelsen gir oss verdifulle ledetråder for ytterligere å utforske dannelses- og vedlikeholdsmekanismen til minne.

Insulinnedbrytende enzym er et viktig enzym, hvis hovedfunksjon er å bryte ned insulin for å opprettholde blodsukkerbalansen. Nyere studier har imidlertid vist at insulinnedbrytende enzym ikke bare spiller en metabolsk rolle, men også direkte påvirker veksten og reparasjonen av nevroner i hjernen, og spiller en viktig rolle for å opprettholde hukommelsen.

Mange studier har vist at jo høyere nivå av insulinnedbrytende enzym, jo ​​bedre hukommelse. Dette er fordi insulinnedbrytende enzymer kan fremme vekst og reparasjon av nevroner, og dermed forbedre lærings- og hukommelsesevnen til hjernen. I tillegg kan insulinnedbrytende enzymer også fremme forbindelsen mellom nevroner, og derved forbedre assosiasjonen og oppbevaringen av hukommelsen.

Den viktige rollen til insulinnedbrytende enzymer i hukommelsen har blitt mye brukt innen klinisk medisin. Forskere har funnet ut at ved å inhalere insulinnedbrytende enzymer kan ikke bare hukommelsen forbedres, men også kognitive evner og depressive symptomer kan forbedres.

Kort sagt er sammenhengen mellom insulinnedbrytende enzymer og hukommelse et svært viktig felt, som gir oss verdifulle ledetråder for å studere den biologiske mekanismen til hukommelsen. Fremtidig forskning vil videre utforske funksjonen og rollen til insulinnedbrytende enzymer, hjelpe oss bedre å forstå dannelsen og lagringsmekanismen til hukommelse, og gi et bedre grunnlag for å forbedre lærings- og hukommelsesevnen til den menneskelige hjernen. Det kan sees at vi trenger å forbedre hukommelsen, og Cistanche kan forbedre hukommelsen betydelig fordi Cistanche også kan regulere balansen av nevrotransmittere, som å øke nivåene av acetylkolin og vekstfaktorer, som er svært viktige for hukommelse og læring. I tillegg kan Cistanche også forbedre blodstrømmen og fremme oksygentilførsel, noe som kan sikre at hjernen får tilstrekkelig næring og energi, og dermed forbedre hjernens vitalitet og utholdenhet.

Klikk på vet måter å forbedre hukommelsen på

Free Tesa økte uttrykket av Ide 2- signifikant (p=0.011), og ikke-signifikant økt MMP92--fold (p=0.35) (fig. 6A) og B). M2 mikroglia i nevrodegenerative sykdommer kan fjerne -amyloid, -synuklein og andre patogene proteiner via enzymatisk nedbrytning eller fagocytose, og D-Tesa oppregulerer proteiner involvert i disse prosessene (dvs. Ide og MMP9).71–73

Ideekspresjon er nedregulert i AD- og PD-patologi og er kjent for å være oppregulert av PPAR-agonister, noe som stemmer overens med våre resultater.

71,72 Funksjonelt har bare en 2-dobling av Ide-nivåer vist seg å redusere -amyloidakkumulering og nevronal død in vivo.74,75 Derfor er den 3-dobling av Ide observert av D-Tesa, og 2-dobling av Ide av freeTesa kan være terapeutisk effektiv in vivo.

D-Tesa øker fagocytose av -amyloid

CD36 er en mikroglial scavenger-reseptor som letter fagocytose og nedbrytning av -amyloid.73 Dens nedregulering iAD resulterer i redusert fjerning av -amyloid, men den oppreguleres av PPAR-aktivering.

Både D-Tesa og gratis Tesa økte CD36-ekspresjonsnivåene betydelig sammenlignet med bare LPS-eksponerte celler (p < 0.0001 vs. p < 0,005 for D-Tesa og gratis Tesa , henholdsvis), men D-Tesa var mye mer effektiv enn gratis Tesa (6-fold økning vs. 2.8-fold økning for henholdsvis D-Tesa og fri Tesa, p < 0,0005) (fig. 6C) ).

Resultatene våre stemmer overens med tidligere studier med pioglitazon (en annen PPAR-agonist) som viste at økt mikroglial fagocytose av -amyloid skjer gjennom en PPAR- og CD36-avhengig mekanisme.73

For å undersøke om oppreguleringen av CD36 fra D-Tesatreatment korrelerte med den økte fagocytiske evnen til disse cellene, utførte vi en funksjonell fagocytoseanalyse av -amyloid. 73

Kort fortalt, etter å ha behandlet cellene som vi gjorde i de tidligere in vitro-analysene, påførte vi fluorescerende merket -amyloid1–42 på cellene i to timer, vasket cellene og utførte deretter flowcytometri for å undersøke omfanget av cellulært opptak av -amyloid. D-Tesa økte både prosentandelen av celler som fagocyterte -amyloid og den gjennomsnittlige mengden av -amyloid internalisert per celle (fig. 7A og B).

I motsetning til, ga fri Tesa ingen forbedringer i fagocytose av -amyloid. De overlegne effektene av D-Tesa sammenlignet med Tesa kan sannsynligvis tilskrives forbedret cellulær internalisering muliggjort av dendrimer-konjugering.

Dette er i samsvar med tidligere arbeid som viste at over 95 % av BV2-celler behandlet med fluorescensmerket G4-PAMAM-OH hadde internalisert dendrimeren innen tretti minutter og fortsatte å internalisere dendrimeren i minst 24 timer.76

På samme måte viste konjugering av det lille molekylet minocyklin til fluorescensmerket G4-PAMAM-OH at 99 % av BV2-cellene hadde internalisert det fluorescensmerkede dendrimer-medikamentkonjugatet innen 3 timer.26 De viste også at konjugatet reduserte nivået av nitrogenoksid til det frie stoffet etter å ha behandlet BV2-celler med LPS, i samsvar med resultatene våre.

Cellene behandlet med D-Tesafagocytoserte 1.9- ganger mer -amyloid enn de LPS-behandlede kontrollcellene (p < 0.001), som er sammenlignbar med 2.5--økningen på -amyloid fagocytose av primære mikroglialceller fra rotter behandlet med pioglitazon rapportert av Yamanaka et al.73Den litt høyere grad av -amyloid fagocytose i den forrige studien kan enten skyldes at de ikke behandlet cellene sine med LPS slik vi gjorde, eller fordi primær mikroglia uttrykker PPAR kl. et høyere nivå enn BV2-celler brukt i denne studien.77

Som sådan kan en dose av D-Tesa lavere enn den estimerte fra in vitro-eksperimentene i vår studie sannsynligvis være effektiv in vivo-studier og mennesker, siden BV2-celler er kjent for å uttrykke PPAR ved lavere nivåer enn primærmikroglia.77

Mikroglia har vært involvert i mange nevrodegenerative sykdommer, og BBB har forhindret mange legemidler som kan modifisere fenotypen til mikroglia fra en pro-inflammatorisk, nevrotoksisk M1-fenotype til en anti-inflammatorisk, nevrobeskyttende M2-fenotype fra å nå terapeutiske nivåer i hjernen.5,6, 14,15

For eksempel ble to PPAR-agonister, pioglitazon og rosiglitazon, hver undersøkt gjennom kliniske fase III-studier for Alzheimers sykdom på grunn av deres evne til å endre fenotypen av mikroglia, men mislyktes sannsynligvis på grunn av dårlig transport over BBB.13,14 Dermed er det klinisk interesse for endring fenotypen til mikroglia i nevrodegenerative sykdommer.

En slik tilnærming krever levering av stoffet til mikroglia i tilstrekkelige nivåer til å drive en respons. For dette formål har G4-OH-PAMAM dendrimerer vist seg å levere medisiner til mikroglia i mange dyremodeller etter systemisk injeksjon, og som et resultat blir de for tiden evaluert i kliniske studier for behandling av ccTLD (NCT03500627) og alvorlig COVID -19 assosiert betennelse (NCT04458298).18–28

For å kombinere de gunstige effektene av å endre mikroglial fenotype med evnen til å levere medikamenter til mikroglia, konjugerte vi tesaglitazar (en PPAR / dobbel agonist) til en G4-OH-PAMAMdendrimer (fig. 1–3). Vi demonstrerte at D-Tesa er i stand til å endre fenotypen til M1 mikroglia mot en M2-fenotype (fig. 4 og 5), noe som resulterer i en reduksjon i utskillelsen av skadelige reaktive oksygenarter.

Videre demonstrerte vi at mikroglia behandlet med D-Tesa øker deres uttrykk for enzymer som bryter ned patologiske proteiner som -synuklein og -amyloid, samt oppregulerer fagocytosen til -amyloid i en funksjonell analyse (fig. 6 og 7).

Selv om vi ikke presenterer data som viser evnen til D-Tesa til å omgå BBB og akkumulere i mikroglia, har vi tidligere vist at G4-OH-PAMAM legemiddelkonjugater med lignende medikamentbelastning, størrelse og zetapotensiale er i stand til å passere gjennom svekket BBB og akkumulerende inmicroglia etter intravenøs administrering.26,36,52

Disse resultatene støtter videreutviklingen av D-Tesa for behandling av flere nevrologiske sykdommer. Mens vi fokuserer på Alzheimers og Parkinsons sykdommer i denne artikkelen, har D-Tesa potensiale for klinisk oversettelse av flere nevrologiske lidelser. På grunn av mikroglias lignende rolle i patologien til flere nevrodegenerative sykdommer, ble PPAR-agonisten pioglitazon også undersøkt eller undersøkes for tiden i fase II kliniske studier for Parkinsons sykdom, 78 ALS, 79 adrenomyeloneuropati (NCT03864523), multippel sklerose (NCT02T083), hem02T0831 og hem02T081 oppløsning ved intracerebral blødning (NCT00827892).

Hvis disse kliniske forsøkene også mislykkes på grunn av dårlig levering av pioglitazon over BBB, kan D-Tesa overvinne denne leveringshindringen og behandle pasienter med disse sykdommene.

Andre grupper har brukt nanopartikler for å forbedre leveringen av PPAR-agonister til makrofager, men de har ikke forsøkt å levere disse agonistene til mikroglia. Osinski et al. demonstrerte at Tesa-lastede liposomer for det meste ble tatt opp av makrofager i visceralt hvitt fett i en mannlig leptinmangel fedmemodell.80

De viste i tillegg at Tesa-lastede liposomer ikke endret uttrykket av M1-markøren Mcp-1, men økte uttrykket av M2-markøren Arg1, mens behandling med fri Tesa reduserte det totale antallet M1-makrofager og uttrykket av Mcp{{6 }}, og økte ikke uttrykket av Arg1.

Nakashiro et al. brukte poly(melke-ko-glykolsyre) (PLGA) nanopartikler for å levere pioglitazon (en PPAR-agonist) til makrofager i sammenheng med åreforkalkning.81

In vivo viste de at PLGA-pioglitazon reduserte nivåene av immunceller i blodet. Inprimære benmargsavledede makrofager behandlet med LPS og interferon, fant de at PLGA-pioglitazon økte IL-4 og IL-10 (M2-markører) og ikke reduserte IL-6- eller TNF-nivåer.

Funnene deres ligner på våre; M2-markører ble økt ved behandling med nanopartikkel-PPAR-agonist, mens IL-6- og TNF-nivåer ikke sank. Di Mascolo et al. brukte PLGA-polyvinylalkohol-nanopartikler for å levere rosiglitazon (en annen PPAR-agonist).82

In vitro viste de at deres nanopartikkel-legemiddelkomplekser reduserte iNOS-, TNF- og IL-1-uttrykk i benmargsavledede makrofager. De forbehandlet cellene sine med nanopartikkelstoffet før de stimulerte med LPS, mens vi forbehandlet celler med LPS før de behandlet med D-Tesa, noe som kan være en grunn til at vi ikke observerte en reduksjon i TNF- og IL-1, selv om vi også observerte reduksjon i iNOS-uttrykk.

Konklusjon

Det er for tiden ingen patologiendrende behandling for mange nevrodegenerative sykdommer, og ettersom befolkningen fortsetter å leve, vil utbredelsen og kostnadene ved behandling av disse sykdommene fortsette å stige, noe som understreker det presserende behovet for å utvikle en løsning. Nylig er pro-inflammatoriske M1 mikroglia kritiske i patologien til flere nevrodegenerative sykdommer.

Det å kunne levere medikament over blod-hjerne-barrieren som kan indusere et "M1 til M2"-fenotypeskifte i mikroglia har deretter terapeutisk potensielle flere sykdommer, spesielt Alzheimers og Parkinsons sykdom.

D-Tesa ble designet for å levere et 'M1 til M2' induserende medikament til mikroglia etter systemisk administrering for å redusere mikroglial sekresjon av nevrotoksiske stoffer, samtidig som det induserer en antiinflammatorisk tilstand som øker nedbrytning og fagocytose av patogene proteiner i hjernen. Vi har vellykket syntetisert D-Tesa ved hjelp av en svært effektiv klikkkjemitilnærming.

Medikamentet er festet til dendrimeren via en esterbinding som kan spaltes intracellulært ved lysosomale forhold, hvor omtrent 60 % av Tesa frigjøres i løpet av de første 48 timene under lysosomale forhold.

D-Tesa ble vist å være overlegen Tesa in vitro ved å indusere et M1 til M2a/M2b/M2cfenotypeskifte, noe som resulterte i redusert nitrogenoksidsekresjon, økt ekspresjon av -synuklein og -amyloidnedbrytende enzymer og økt fagocytose av -amyloid.

Dermed kombinerer D-Tesa de fordelaktige leveringsegenskapene til dendrimeren, med M1 til M2-svitsjingsegenskapene til Tesa. På grunn av den felles rollen til mikroglia og den vanlige terapeutiske fordelen ved å indusere et M1 til M2 fenotypeskifte, har D-Tesa potensial til å behandle mange nevrologiske lidelser når det administreres på riktig stadium av sykdomsprogresjonen.

Forfatterbidrag

LD, AS, KL, RS, SK og RMK konseptualiserte eksperimentene. LD, AS og RS utførte syntese og karakterisering av dendrimer-medikamentkonjugatet. LD, KL og JJ utførte celleeksperimentene. LD og K. L. utførte statistikken. LD og AS skrev manuskriptet, og alle forfattere redigerte manuskriptet.

Interessekonflikter

RMK og SK er medoppfinnere av å bruke den hydroksylterminerte dendrimeren for målrettet levering til mikroglia ved nevrologiske sykdommer, samt patenter relatert til dendrimerteknologien beskrevet i denne artikkelen.

De er medgründere av Ashvattha Therapeutics, Orpheris Inc. og RiniSight Inc., som er selskaper som leder den kliniske utviklingen av plattformen. SK og RMK er styremedlemmer i AshvatthaTherapeutics Inc. RS er for tiden ansatt i AshvatthaTherapeutics og eier aksjer i selskapet; arbeidetR. S. utførte for dette papiret ble gjort før han begynte i Ashvattha. Interessekonflikten administreres av JohnsHopkins University.

Anerkjennelser

Vi vil gjerne takke Elizabeth Smith Khoury for nyttige diskusjoner om in vitro-eksperimentene. Dette prosjektet ble finansiert av Patz Distinguished Professorship Endowment fra JohnsHopkins og NICHD (stipendnummer HD076901) (RMK). Vi takker Wilmer Core Grant for visjonsforskning, mikroskop og kjernemodul (tilskuddsnummer EY001865) for tilgang til Sony flowcytometer.

Vi takker Servier Medical Arts for bruken av deres samling av bilder (http://smart.servier.com/) som er lisensiert under en Creative Common Attribution 3.0 Generic License, som ble endret for å gjøre den grafiske abstrakte.

Referanser

1 CL Gooch, E. Pracht og AR Borenstein, Byrden av nevrologisk sykdom i USA: En sammendragsrapport og oppfordring til handling, Ann. Neurol., 2017, 81, 479–484.

2 JL Cummings, T. Morstorf og K. Zhong, utviklingspipeline for Alzheimers sykdom: få kandidater, hyppige feil, Alzheimers Res. Ther., 2014, 6, 37.

3 P.-P. Liu, Y. Xie, X.-Y. Meng og J.-S. Kang, Historie og fremgang av hypoteser og kliniske studier for Alzheimers sykdom, Signal Transduction Targeted Ther., 2019, 4, 1–22.

4 C. Soto og S. Pritzkow, Protein feilfolding, aggregering, og konformasjonsstammer i nevrodegenerative sykdommer, Nat. Neurosci., 2018, 21, 1332–1340.

5 VH Perry og C. Holmes, Microglial priming in neurodegenerative disease, Nat. Rev. Neurol., 2014, 10, 217–224.

6 Y. Tang og W. Le, Differential Rolles of M1 and M2Microglia in Neurodegenerative Diseases, Mol. Neurobiol., 2016, 53, 1181-1194.

7 MW Salter og B. Stevens, Microglia fremstår som sentrale aktører innen hjernesykdom, Nat. Med., 2017, 23, 1018–1027.

8 S. Krasemann, et al., The TREM2-APOE Pathway Drives theTranscriptional Phenotype of Dysfunctional Microglia in Neurodegenerative Diseases, Immunity, 2017, 47, 566–581.e9.

9 Q. Zhao, et al., De antidepressiva-lignende effektene av pioglitazon i en musemodell med kronisk mild stress er assosiert med PPAR-mediert endring av mikrogliale aktiveringsfenotyper, J. Neuroinflammation, 2016, 13, 259.

10 L. Wen, et al., Polarization of Microglia to the M2 Fenotype in a Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma-Dependent Manner Demper Axonal InjuryInduced by Traumatic Brain Injury in Mouse, J. Neurotrauma, 2018, 30–2323035, 23243035.

11 W. Cai, et al., Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR): En hovedportvakt innen CNS-skade og reparasjon, Prog. Neurobiol., 2018, 163–164, 27–58.12 B. Brakedal, et al., Glitazonbruk assosiert med redusert risiko for Parkinsons sykdom, Mov. Disord., 2017, 32, 1594–1599.

For more information:1950477648nn@gmail.com