ABSTRAKT

Melanin er hovedpigmentet i menneskelig hud, og spiller den primære rollen som beskyttelse mot ultrafiolett stråling. Endring av melaninproduksjonen kan føre til hyperpigmenteringssykdommer, med både estetiske og helsemessige konsekvenser. Dermed er undertrykkere av melanogenese ansett som nyttige verktøy for medisinske og kosmetiske behandlinger. Stor interesse er fokusert på naturlige kilder, rettet mot å finne sikre og kvantitativt tilgjengelige depigmenterende stoffer. Lav antas å være mulige kilder til denne typen forbindelser, ettersom forekomsten av mange fenoliske molekyler antyder mulige effekter på fenolaseenzymer involvert i melaninsyntese, som tyrosinase. I dette arbeidet brukte vi fire lavarter, Cetraria islandica Ach., Flavoparmelia caperata Hale og Letharia vulpina (L.) Hue, og Parmotrema perlatum (Hudson) M. Choisy, for å få ekstrakter i løsemidler med økende polaritet, nemlig. kloroform, kloroform-metanol, metanol og vann. Cellefrie, tyrosinaseinhiberingseksperimenter viste den høyeste hemmingen for L. vulpina metanolekstrakt, etterfulgt av C. islandica kloroform-metanol. Sammenlignbare resultater for depigmenteringsaktiviteter ble observert ved bruk av in vitro og in vivo systemer, slik som MeWo melanomceller og sebrafisklarver. Vår studie gir det første beviset på depigmenterende effekter av lavekstrakter, fra tyrosinasehemming til celle- og in vivo-modeller, noe som tyder på at L. vulpina- og C. islandica-ekstrakter fortjener å bli studert videre for å utvikle hudblekende produkter.

I følge relevante studier,cistancheer en vanlig urt som er kjent som "mirakelurten som forlenger livet". Hovedkomponenten ercistanoside, som har ulike effekter som f.eksantioksidant, anti-inflammatoriskog fremme av immunfunksjonen. Mekanismen mellom cistanche ogbleking av hudenligger i antioksidanteffekten til cistancheglykosider. Melanin i menneskelig hud produseres ved oksidasjon av tyrosin katalysert avtyrosinase, og oksidasjonsreaksjonen krever deltakelse av oksygen, så de oksygenfrie radikalene i kroppen blir en viktig faktor som påvirker melaninproduksjonen. Cistanche inneholder cistanosid, som er en antioksidant og kan redusere dannelsen av frie radikaler i kroppen, dermedhemmer melaninproduksjonen.

Klikk på Cistanche Tubulosa Supplement for Whitening

For mer info:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

EmnerPlantevitenskap, Dermatologi

NøkkelordTyrosinase, sekundære lavmetabolitter, sebrafisk, melanogenese, Letharia vulpina, Cetraria islandica

INTRODUKSJON

Hos virveldyr realiseres melaninsyntese av spesialiserte celler kalt melanocytter, innenfor lysosomlignende organeller kalt melanosomer. Melanisering styres av forskjellige prosesser, inkludert miljøfaktorer (f.eks. UV-stråler) og endogene (f.eks. -MSH) faktorer, stimulering av melanokortin-1-reseptor (MC1R), signaloverføring av cAMP- og MAPK-veier, aktivering av mikroftalmi- assosiert transkripsjonsfaktor (MITF), og uttrykk for pre-melanosomprotein (Pmel), tyrosinase (TYR) og tyrosinase-relaterte proteiner (TYRP1) (D'Mello et al., 2016; Cheli et al., 2010).

Tyrosinase (EC1.14.18.1) er et nøkkelenzym for melaninsyntese og har blitt mye undersøkt som et mål for modulerende melaniseringsmidler. Det er et multifunksjonelt kobberholdig enzym, vidt distribuert i naturen, ansvarlig for melanisering hos dyr og bruning i planter og mikroorganismer (Kondo & Hearing, 2011). Enzymet katalyserer to distinkte reaksjoner av melanindannelse: hydroksylering av tyrosin ved mykofenolataktivitet, og oksidasjon av 3,4-dihydroksyfenylalanin (L-DOPA) til o-dopakinon ved difenolvirkning. Disse reaktive o-kinonene gjennomgår ikke-enzymatisk polymerisering for å danne melanin.

Selv om melanin i menneskelig hud er et essensielt pigment for beskyttelse mot UV-indusert skade, forårsaker overdreven melaninproduksjon hyperpigmenteringsforstyrrelser, som melasma, efelider og lentiginer (Mukherjee et al., 2018). Disse forholdene representerer et problem for mange mennesker, og som en konsekvens har søket etter depigmenterende midler tiltrukket seg stor interesse innen det medisinske og farmasøytiske felt (Solano, 2014). Det er derfor rettet betydelig forskningsinnsats for å oppdage nye naturlige aktive produkter rike på sikre og kvantitativt tilgjengelige hemmere av pigmentering (Li et al., 2013; Lo et al., 2013; Wang et al., 2011). Hovedstrategien er å målrette tyrosinase, med en økende interesse for naturlige produkter som skal brukes som tyrosinasehemmere (Leyden et al., 2011). I litteraturen er det rapportert om et stort antall tyrosinasehemmere fra naturlige kilder for deres mulige bruk for å behandle pigmenteringshudlidelser (Mukherjee et al., 2018; Parvez et al., 2007). For mange av disse forbindelsene har den hemmende aktiviteten vært relatert til deres fenoliske struktur som gir høy antioksidantkraft. Ulike bevis tyder på at lav er verdt å undersøke som mulige kilder til denne typen forbindelser (Brandão et al., 2017; Higuchi et al., 1993; Honda et al., 2016; Lopes, Coelho & Honda, 2018).

Lav er symbiotiske assosiasjoner mellom en heterotrof sopp (mykobionten) og en eller flere fotosyntetiske partnere (fotobiontene) (Nash III, 2006). Som et resultat av symbiosen produserer mykobionten flere sekundære metabolitter (kalt lavstoffer), hvorav de fleste er unike for disse organismene (Ranković & Kosanić, 2015). Disse metabolittene kan bidra til å beskytte mot biotiske og abiotiske faktorer, som planteetere eller UV-stråling (Phinney, Solhaug & Gauslaa, 2018). De fleste av dem er fenoliske forbindelser som hovedsakelig stammer fra acetat-polymalonat-veien og forventes å gi flere biologiske aktiviteter. Følgelig brukes lav i tradisjonelle medisiner over hele verden til forskjellige formål (Crawford, 2015; Devkota et al., 2017), mens forskjellige lavsubstanser har blitt tatt opp for urte- og farmasøytiske anvendelser (Einarsdóttir et al., 2010; Gül¸ cin et al., 2002; Ranković & Kosanić, 2015). Blant forskjellige egenskaper antyder den fenoliske naturen til disse forbindelsene effekter på aktiviteten til fenolaseenzymer som tyrosinase (Honda et al., 2016). Lav er gode kilder til naturlige antioksidanter, hvorav noen er anerkjent som tyrosinasehemmere (Behera, Adawadkar & Makhija, 2004). Noen patenter hevder også aktiviteter mot tyrosinase-relatert til lavekstrakter eller lavforbindelser (Takayama et al., 2010), men de har lenge blitt neglisjert og oversett hovedsakelig på grunn av vanskeligheter med å skaffe lavsubstanser i mengder og renhet tilstrekkelig for strukturell belysning og farmakologisk testing (Boustie, Tomasi & Grube, 2011; Muggia, Schmitt & Grube, 2009).

Denne studien var rettet mot å utforske de biologiske effektene av lavstoffer på ulike pigmenteringsmodeller, både cellefrie og cellulære, inkludert in vivo sebrafiskeksperimenter. I tillegg ga vi tips om muligheten for å utnytte lav for utvinning av depigmenterende forbindelser og fremstilling av farmasøytiske og kosmetiske depigmenteringsprodukter. På grunn av begrenset kunnskap om laveffekter på melanisering, utførte vi først en screening utført på forskjellige arter kjent for deres brede utbredelse og overflod, nemlig. Cetraria islandica Ach., Flavoparmelia caperata Hale, Letharia vulpina (L.) Hue og Parmotrema perlatum (Hudson) M. Choisy. Fra hver art fikk vi en serie på fire ekstrakter ved å bruke løsemidler med økende polaritet, fra ren kloroform til vann. Som en første undersøkelse ble alle ekstrakter testet i cellefrie, tyrosinaseinhiberingseksperimenter. Ekstraktene som viser markert doseavhengig hemmende aktivitet ble brukt på in vitro og in vivo melaniseringsmodeller, ved bruk av kulturer av henholdsvis melaninproduserende melanomceller (MeWo) og utvikling av sebrafiskembryoer. Vi brukte sebrafisk fordi den nylig er etablert som en in vivo-modell for fenotypebasert screening av melanogene regulatoriske forbindelser (Lin et al., 2011). Spesielt har sebrafisk blitt en viktig virveldyrmodell for å vurdere medisineffekter fordi den viser unike egenskaper, inkludert enkel vedlikehold og medisinadministrasjon, kort reproduksjonssyklus, ekstern befruktning og utvikling, som tillater manipulering av utviklingsmiljøet og optiske målinger gjennom den transparente kroppsvegg.

MATERIALER OG METODER

Kjemikalier

Alle reagenser ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Milan, Italia) med mindre annet er angitt.

Lavarter og ekstraktbearbeiding

Thalli av F. caperata og P. perlatum ble samlet inn i et skogsområde i østlige Liguria (NW Italia), L. vulpina i et skogsområde i Valtournenche (NE Valle d'Aosta, Italia), og C. islandica ble kjøpt fra Kubja Ürditalu (Tallinn, Estland). Ingen tillatelser for lavinnsamling kreves i henhold til italiensk lovgivning. Lavmaterialer ble identifisert av en av oss (PG) ved hjelp av mikroskopanalyse ved hjelp av identifikasjonsnøkler og punkttester. Deretter ble lavmaterialet renset fra rusk, lot tørke ved romtemperatur over natten og lagret i papirposer ved romtemperatur frem til bruk.

Tørket lav thalli ble ekstrahert ved romtemperatur (ca. 23 ◦C) med fire løsemiddelpolariteter fra kloroform til vann: kloroform, kloroform-metanol (9:1), metanol og vann (14,4 g F. caperata i 70 ml av hver) løsningsmiddel, 10,4 g P. perlatum i 60 mL, 13,3 g L. vulpina i 75 mL og 100,6 g C. islandica i 500 mL). Ekstraksjoner ble utført i 5 dager og 3 ganger for hvert løsningsmiddel, med hyppig omrøring. Supernatantvæsken ble deretter filtrert og inndampet til tørrhet under redusert trykk i et roterende system (Rotavapor Heidolph, Schwabach, Tyskland) for å oppnå tørkede ekstrakter (Souza et al., 2016). Lavekstraktutbytte er rapportert i tabell 1.

Tyrosinase-hemmingsanalyse

Konvensjonell TLC-kromatografisk profil ble utført på 20 x 20 cm plater (Merck silikagel 60 F254) etter litteraturprotokoller (Culberson & Kristinsson, 1970; White & James, 1985). Kort fortalt ble prøver av L. vulpina metanolisk ekstrakt og C. islandica kloroform-metanolekstrakt resolubilisert i deres ekstraksjonsløsningsmidler og deretter flekket på en TLC-plate ved bruk av et kapillarrør. TLC-profil ble utført ved å bruke toluen:eddiksyre (200:30 ml) som en mobil fase (løsningsmiddel C). Etter at løsningsmiddelfronten var nådd, fikk platen tørke ved romtemperatur. Tørkede plater ble undersøkt og fotografert først i synlig lys (dagslys) for å oppdage pigmenter som fargede flekker, og deretter i fluorescenslys, ved bruk av 254 og 350 nm eksitasjoner.

For å visualisere tilstedeværelsen av tyrosinaseinhiberingsaktivitet på hvert sted, ble TLC-plater sprayet med L-tyrosinløsning (ca. 2,5 × 10-5 mmol/cm2) og deretter med tyrosinaseløsning (ca. 3,6 U/cm2). Flekker med tyrosinaseinhiberende aktivitet virket hvite på mørk bakgrunn (Wangthong et al., 2007).

Cellekultur, cellelevedyktighet og melaninanalyser

MeWo human melanomcellelinje (kat. HTB-65, ATCC, Manassas, VA, USA, ble brukt til cellelevedyktighetsanalyse, som rapportert av Pastorino et al. (2017), og for melaninanalyse, som beskrevet av Cornara et al. (2018).

Sebrafisk-depigmenteringsanalyse

Voksen sebrafisk (Danio rerio) ble hentet fra en kommersiell forhandler og holdt i et sirkulasjonssystem med vannledningsevne på 500–530/cm ved 27 ◦C, pH 7,0–7,5 under konstant 14/10 lys/ mørk fotoperiode. Veterinærpleie av dyrene ble utført i henhold til italiensk lov (D.to L.Vo 26/2014) og forsøkene ble godkjent av Institutional Ethics Review Body (University of Genoa) og det italienske helsedepartementet (autorisasjon 720/ 2015-PR). Gyting av voksen sebrafisk ble utført etter standardmetoder. Spesielt ble synkroniserte embryoer hentet fra naturlig gyting indusert om morgenen ved å slå på lyset. Embryoer ble satt opp i 6-brønnplater som inneholdt 2 ml embryomedium og 15 embryoer per brønn. Ekstraktstamløsninger ble fortynnet til ønsket konsentrasjon med embryomedium rett før bruk (L. vulpina metanolekstrakt: 6–45 µg/ml; C. islandica kloroform-metanolekstrakt: 5–65 µg/ml). Fortynnede ekstrakter ble tilsatt til hver brønn og inkubert fra 8 til 56 hpf (timer etter befruktning), noe som resulterte i 48 timers eksponering. Arbutin 10 mM ble brukt som en positiv kontroll. Utskifting av mediet ble utført hver 24. time for å sikre en jevn fordeling av testforbindelsene. Embryoer ved 56 hpf ble dekorionert med tang, bedøvet i trikainmetansulfonatløsning (Sigma Aldrich), og deretter fotografert under et stereomikroskop (Leica M205C). Effektene på pigmentering ble evaluert ved å bruke ImageJ-programvaren v. 1.74. Pikselmålingsanalysatorfunksjonen ble brukt til å evaluere området med sebrafiskpigmentering.

Statistisk analyse

Dose-responskurver oppnådd ved tyrosinaseinhibering, MTT og pigmenteringsdata for sebrafisk ble analysert ved hjelp av en logistisk regresjonsmodell, og ga IC50- og IC05-verdier som ble antatt som henholdsvis median- og terskelnivåer. Statistiske sammenligninger ble gjort med R 3.0.1 (R Core Team, 2013) miljø, ved bruk av ANOVA-testen, t Student med Bonferronis korreksjon og Dunnetts tester for flere sammenligninger.

RESULTATER

Effekter på tyrosinaseaktivitet

Lavekstrakter viste et kompleks av modulerende effekter på sopptyrosinaseaktivitet, evaluert in vitro i en cellefri analyse. Noen ekstrakter induserte tyrosinaseaktivering, spesielt F. caperata metanol, kloroform og L. vulpina vannekstrakter, andre viste en bifasisk oppførsel, mens noen var hemmende (fig. 1 og tabell 2). Spesielt kloroform-metanol (fig. 1B) og metanolekstrakter (fig. 1C) viste i det hele tatt sterkere tyrosinaseinhibering, med doseavhengige effekter. Den sterkeste inhiberingsaktiviteten ble registrert for metanolekstraktet av L. vulpina (fig. 1C), etterfulgt av kloroform-metanolekstraktet av C. islandica (fig. 1B). De hemmende aktivitetene til disse ekstraktene var de eneste som tillot å estimere IC50-verdier med 95 prosent CI (tabell 2). Som en positiv kontroll, i disse eksperimentene kojinsyreindusert tyrosinaseinhibering med en IC50 på 13,9 µg/ml (95 prosent konfidensintervall: 12,4–15,7).

For mer informasjon: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501