Eksponering for dieseleksos endrer uttrykket til nettverk involvert i nevrodegenerasjon i sebrafiskhjerner del 2

Forberedelse av proteinprøver

For å forberede proteinprøver ble hodene fra 80 til 100 bedøvede larver (5 pdf) nøye isolert og vasket med PBS før de ble overført til en lyseringsbuffer som besto av 15 % forhåndskjølt TCA/aceton inneholdende 0,07 % beta-merkaptoetanol (ME) ) og proteasehemmercocktail (behovsprodusent) i et totalt volum på 500 ul.

De siste årene har det vært betydelig interesse for effekten av proteinprøver på hukommelsen. Flere og flere mennesker begynner å innse betydningen av kosthold for helsen, spesielt den viktige rollen til protein i menneskekroppen.

Proteiner er de grunnleggende byggematerialene i menneskekroppen, og de spiller en viktig rolle i menneskekroppen. På grunn av dette har proteinprøver blitt en viktig kanal for mange mennesker i deres jakt på helse og skjønnhet. I tillegg til å bygge muskler og forme kroppen, kan proteinprøver også forbedre en persons hukommelse.

Noen forskere har studert forholdet mellom proteiner og hukommelse. De fant at langsiktig inntak av tilstrekkelig protein er gunstig for alle aspekter av fysisk helse, spesielt hukommelse. Det er økende bevis på at proteininntak i kosten har en viktig innvirkning på hjernens funksjon og hukommelse.

Protein er en viktig komponent av nevroner i den menneskelige hjernen, så daglig proteininntak har en viktig innvirkning på folks hukommelse og tenkeevne. Langsiktig proteininntak dekker ikke bare kroppens proteinbehov, men hjelper også hjernen med å holde seg aktiv og sunn.

I tillegg kan protein også hjelpe kroppen med å opprettholde blodsukkerbalansen og opprettholde et stabilt humør. Dette er svært viktig for å opprettholde hukommelse og tenkeevne. Derfor kan moderat inntak av protein bidra til å forbedre ulike kognitive funksjoner og følelsesmessige tilstander i menneskekroppen.

Totalt sett er det en sterk sammenheng mellom proteinprøver og hukommelse. Å øke proteininntaket hjelper til med å holde hjernen og kroppen sunn, og forbedrer tankeferdigheter og hukommelse. For folk som trenger å forbedre hukommelsen, er det svært nødvendig å innta en passende mengde protein. Vi bør spise proteinmat på riktig måte og være oppmerksom på rimelige måltider for å opprettholde en sunn kropp og et skarpt sinn. Det kan sees at vi trenger å forbedre hukommelsen, og Cistanche deserticola kan forbedre hukommelsen betydelig, fordi Cistanche deserticola har antioksidant-, anti-inflammatoriske og antialdringseffekter, som kan bidra til å redusere oksidasjon og inflammatoriske reaksjoner i hjernen, og dermed beskytte helsen til nervesystemet. I tillegg kan Cistanche deserticola også fremme vekst og reparasjon av nerveceller, og dermed forbedre tilkoblingen og funksjonen til nevrale nettverk. Disse effektene kan bidra til å forbedre hukommelse, læring og tenkehastighet, og kan også forhindre utvikling av kognitiv dysfunksjon og nevrodegenerative sykdommer.

Klikk vet kosttilskudd for å øke hukommelsen

Etter kort homogenisering ble proteiner utfelt i 12 timer ved 20 grader, etterfulgt av sentrifugering ved 12,000 rpm i 5 minutter ved 4 grader. Supernatanten ble fjernet, og proteinpelleten ble vasket to ganger med kald aceton (inneholdt 0.07 % ME og proteasehemmercocktailer). Den endelige proteinpelleten ble oppløst i en lyseringsbuffer som inneholdt 7,0 M urea, og 2,0 M tiourea ved sonikering på is.

De solubiliserte proteinprøvene ble sentrifugert ved 15,000 rpm i 10 minutter ved 4 grader for å utfelle uløselige partikler, og konsentrasjonen av de endelige proteinprøvene ble målt ved bruk av Bradford-metoden.

TMT-basert proteomikkanalyse med høy gjennomstrømning

Prøver ble redusert, alkylert og fordøyd ved sekvensiell tilsetning av trypsin og lys-C-proteaser. Peptider ble deretter merket med 10-plexTMT isobariske tagger i henhold til produsentens instruksjoner. Merkede prøver ble blandet og deretter fraksjonert fint ved bruk av reversert fasekromatografi med høy pH.

Individuelle fraksjoner ble deretter analysert ved LC–MS/MS ved bruk av online reversert fasekromatografi og tandem massespektrometri på et Thermofsher Fusion Lumos massespektrometer. Data ble innhentet ved bruk av den synkrone forløperseleksjonsbaserte MS3-metoden, som tidligere beskrevet (McAlister et al. 2014). Databasesøking og utvinning av TMT-reporterioninformasjon ble utført ved hjelp av MaxQuant-programvareplattformen (Cox og Mann 2008).

Sammenligningen av TMT-data på tvers av prøver ble utført ved bruk av MSStats (Choiet al. 2014). Transkriptomisk analyse Omtrent 80–100 hoder ble isolert fra bedøvede embryoer (120 timer), vasket med PBS og utsatt for total RNA-ekstraksjon ved bruk av Trizol (Sigma Aldrich, Saint Louis , USA) reagens etter produsentens instruksjoner.

Kvaliteten og mengden av RNA ble evaluert ved hjelp av et NanoDrop2000 spektrofotometer (Thermo Scientific, MA) og videre av Agilent 2100 Bioanalyzer for å sikre minimumskonsentrasjonen på 50 ng/ul og RNAintegritetstall (RIN) på 8. Bibliotekforberedelse ble deretter utført ved bruk av en Illumina HiSeq4 til000according. protokollen: "TruSeqStranded Total RNA Library Prep workflow withRibo-Zero Gold," og prøvene ble sekvensert under følgende forhold: "Pared End run,R1=75 cycles (antisense strand), Index=8 cycles, R2=75 sykluser (føle streng)."

Dataanalyse

Både datasett for proteomiske og transkriptomiske studier ble samtidig lastet opp og analysert ved hjelp av nettverktøyet Metascape, som tillater genannotering for ulike arter, inkludert Danio rerio (Zhou et al. 2019). For å evaluere bidraget til enten proteom- eller transkriptomprofilendringer i spesifikke veier, ble dataene analysert ved bruk av Ingenuity Pathways Analysis (IPA) programvare (Krämer et al. 2014).

Datasett som inneholder gen- eller proteinidentifikatorer og tilsvarende ekspresjonsverdier ble lastet opp til applikasjonen. Hver identifikator ble kartlagt til sitt tilsvarende objekt i Ingenuitys kunnskapsbase.

En ekspresjonsendringsgrense på 1.3-gang ble satt for å identifisere molekyler hvis ekspresjon var differensielt regulert. Funksjonell analyse identifiserte de biologiske funksjonene og/eller sykdommene som var mest signifikante for datasettet. Molekyler fra datasettet som oppfylte grensen og var assosiert med biologiske funksjoner ble vurdert for analysen. Right-tailedFishers eksakte test ble brukt til å beregne en p-verdi som bestemmer sannsynligheten for at hver biologisk funksjon og/eller sykdom tilordnet det datasettet skyldes tilfeldigheter alene.

Baneanalyse

For å evaluere bidraget til endringer i proteom-ortranskriptomprofilen i spesifikke veier, ble begge datasettene lastet opp til IPA-programvaren (Krämer et al. 2014). Topp signifikante endrede kanoniske veier ble deretter videre evaluert og tolket ved bruk av PCR og western blotting som beskrevet nedenfor.

Western blotting

Totalt 25 µg proteiner ble lastet på en 12% NuPAGE (Novex, CA) og overført til PVDF-membraner (Novex, CA) som beskrevet (MahmoudianSani et al. 2017; Rafee et al. 2019). Membranene ble blokkert med 5 % skummet melk i Tris-bufret saltvann og 0,01 % tween 20 (TBST-buffer) i 30 min romtemperatur og deretter inkubert over natten ved 4 grader med enten kanin polyklonal anti-Cyp1A1 (Abcam, CA) eller mus monoklonal anti-GAPDH( Abcam, CA), fortynnet i TBST-buffer inneholdende 1% skummet melk.

Etter vasking i TBST ble blottene inkubert med sekundære esel anti-kanin-HRP (Abcam, CA) eller geit anti-mus-HRP (Santa Cruz, CA) antistoffer i 2 timer, etterfulgt av utvikling med Pierce™ ECL Plus western blotting-substrat ( Thermo Fisher Scientific, USA). Båndene ble visualisert ved å bruke en LI-COR-skanner og analysert via densitometri (LI_COR Biosciences, NE).

Sanntids PCR

Totalt RNA ble isolert fra hodene ved å bruke TRIzol-reagens (Sigma Aldrich, Saint Louis, USA) etter produsentens instruksjoner og deretter målt med et NanoDrop 2000 spektrofotometer (Thermo Scientific, MA). En mengde på 1 ug av hver RNA-prøve ble revers-transkribert ved bruk av iScript™ revers transkripsjonssupermix (Bio-Rad, CA), annentids-PCR ble utført ved bruk av SsoAdvancedUniversal SYBR Green supermix (Bio-Rad, CA), og primerne er oppført i tilleggstabell 1. Relative uttrykksnivåer ble beregnet ved å bruke 2−ΔΔCT-metoden, og den statistiske T-testen ble brukt for å evaluere de signifikante forskjellene.

Resultater og diskusjon

Proteomiske og transkriptomiske analyser er to hovedverktøy for å forstå de molekylære mekanismene som ligger til grunn for sykdomsprosesser og respons på miljøstimuli (Duan et al. 2017; García-Estrada et al.2013; Jami et al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al.2012) . Her utførte vi dype ekspresjonsanalyser av både de transkriptomiske og proteomiske nivåene i hodet på sebrafiskembryoer utsatt for DEPe.

Hodene, hovedsakelig sammensatt av hjernevev, ble isolert for å eliminere ekspresjonsprofilene til annet vev fordi vi er interessert i å bestemme iboende patologiske veier i CNS.

Uttrykksprofilen til hodene til sebrafiskhembryoer

Profilanalyse ga 11 172 påviste proteiner og 14 748 mRNA-mål av mer enn 26 000 kodende gener (Howe et al. 2013). Blant de 11 172 proteinene identifisert fra de TMT-merkede prøvene (tilleggstabell 2), ble 141 proteiner betydelig oppregulert, og 607 ble nedregulert (tilleggstabell 3 og fig. 1a). Tilsvarende ble 367 transkripsjoner oppregulert, og 149 ble nedregulert blant de 14 748 transkripsjonene (tilleggstabell 4) påvist i RNA-seq-analysen (fig. 1b og tilleggstabell 5).
I de fleste tilfeller var funnene fra de oppregulerte proteomiske og transkriptomiske analysene konsistente. Topp høyt oppregulerte proteiner inkluderer for eksempel cytokrom P450 Cyp1a, Cyp1c1, Guaninenukleotidbindende proteinunderenhet gamma, Annexin, Plexin B2b kort isoform, Dehydrogenase/reduktase (SDR-familie) medlem 13-som 1, S-antigen fra retina/pinealkjertelen (arrestin) b, og Sulfotransferase6B1.

På samme måte inkluderer gener med høyest transkriptomikupregulering cytokrom P450 (Cyp1a), kjemokin (C–C-motiv) ligand 27a, aryl-hydrokarbonreseptor-repressor A, cytokrom P450 (Cyp1b) og Rh-familie C glykoprotein. Nedregulerte proteiner og transkripsjoner, på den andre hånden, var ikke alltid sterkt korrelert.

For eksempel er Complexin 2, Spectrin alpha, Cardiac myosin light chain-1, SEC23 interagering protein, ATPsynthase membrane subunit EA, Cytokrom b og NAD-avhengig protein deacetylase blant de øverste sterkt nedregulerte proteinene, mens retinalouter segment membranprotein 1a , oppløste bærerfamilie 5 (jodidtransportør), FBJ murin osteosarkom viral onkogen homolog B, kompleksin 4c, FOS-lignende antigen 1a, opsin 1 og v-fos viser den høyeste nedreguleringen av transkripsjon (tabell 1 og 2).

Antistoffer som gjenkjenner sebrafiskproteiner er begrenset, men vi bekreftet en prøve av disse endringene ved hjelp av western blot-analyse. Oppreguleringen av Cyp1A-protein og nedreguleringen av Complexin 2 (CPLX2) ble bekreftet ved å bruke GAPDH som en belastningskontroll (fig. 2a). Høyere nivåer av TAT og UGT1B1-transkripsjon og lavere nivåer av CHNRB og TH2 ble også bekreftet av qPCR ved bruk av Elf-alpha som intern kontroll (fig. 2b).

Genanmerkning

Det er flere online bioinformatiske verktøy og programvare som kan gi nyttig informasjon uten merknader. Blant dem ble Metascape, med evnen til genannotering for Danio rerio (Zhouet al. 2019), brukt i dette arbeidet.

Både datasett for proteomiske og transkriptomiske studier ble samtidig lastet opp og analysert ved hjelp av dette nettbaserte verktøyet. Etter å ha kombinert produksjonen av både proteomiske og transkriptomiske endringer i programvaren, flere prosesser som respons på xenobiotisk stimulus, metabolisme av xenobiotika ved cytokrom P450 og døgnregulering av genuttrykk ble funnet indusert ved DEPe-behandling (fig. 3a).

Denne analysen antydet også undertrykte nivåer av biologiske prosesser som "Visuell persepsjon", "Fototransduksjon" og "G-proteinkoblet reseptorinternalisering." Endringene i synsrelaterte uttrykksprofiler var ikke uventede siden DEPe-behandling under tidlig utvikling resulterte i mindre øyne (data ikke vist).

Xenobiotisk metabolismesignalering

Xenobiotika, som er fremmede naturlige eller syntetiske kjemiske forbindelser, kan utløse den cellulære stressresponsen, som fører til differensiering, spredning, apoptose eller nekrose. Faktisk trenger kroppen å aktivt beskytte seg mot fremmedfrykt, og også giftige endogene forbindelser og deres metabolitter, via uttrykket av enzymer og transportører involvert i deres eliminering og avgiftning.

Disse enzymene er klassifisert i tre grupper: FaseI-enzymer (CYP, ALDH, FMO) som introduserer polaritet i xenobiotika; Fase II-enzymer (UGT, GST, SULT) som introduserer hydrofilisitet via konjugering av hydrofile molekyler som sulfat, glukuronsyre og glutation til xenobiotika; og fase III-enzymer (MDR1, OATP2, MRP) som transporterer fremmedfrykt eller konjugater II dannet under Pha til det ekstracellulære området.

Disse enzymene induseres gjennom signalkaskader som involverer spesifikke reseptorer (CAR, PXR, AHR) og MAPK-mediert aktivering av transkripsjonsfaktorer (NRF2, MAF) (Omiecinski et al. 2011).

I fravær av aktivatorer er den konstitutivt aktive reseptoren (CAR) lokalisert i cytoplasmaet som kompleks med CCRP og HSP90. Men når en aktivator er tilstede, translokerer CAR inn i kjernen og binder seg til RXR for å danne en heterodimer og binder seg videre til flere varianter av det gjentatte motivet, slik som DR3, DR4, ER6 og ER8, og bidrar til genuttrykksregulering (tilleggstabell 2).

Vår proteomikkanalyse avslørte aktiveringen av xenobiotisk metabolisme. Faktisk viser den klare oppreguleringen av CYP1A1, CYP3A7, HMOX1 (hem oksygenase 1), CAT (katalase) og CES1 (karboksylesterase 1) induksjonen av fase I metabolisme, mens økt uttrykk for UGT1A1 (UDP glukuronosyltransferase familie 1 medlem A1 og GSTP1) glutationS-transferase pi 1) indikerer aktivering av fase II metabolisme.

Interessant nok antyder nedregulering av sulfattransferaser som SULT1A1 (sulfotransferasefamilie 1A medlem 1), SULT1C2 (sulfotransferasefamilie 1C medlem 2) og SULT2B1 (sulfotransferasefamilie 2B medlem 1) at økende hydrofilisitet i fase II-metabolisme skjer med fortrinnsvis konjugasjon av glulutonsyre og fortrinnsvis tilbøyelig glulutionsyre. , men ikke sulfatkonjugering (fig. 4).

Resultatene av den transkriptomiske studien er ganske konsistente, ettersom CYP1A, CYP1B, CYP3A7, GSTO1, GSTP1 og UGT1A1 alle er oppregulert på RNA-nivåer. Imidlertid viser SULT2B1 oppregulering på RNA-nivå (mens underrepresentert på proteinnivåene).

Dette kan skyldes involvering av andre mekanismer som induserer nedbrytning eller inaktivering av sulfattransferase-enzymer ved behandling med DEPe. Det som er spesielt overraskende er at disse endringene i xenobiotisk metabolisme skjedde i hodet (antagelig hjernen) til fisken. Uttrykk av xenobiotiske gener er beskrevet i nervesystemet til pattedyr, men dette er den første rapporten om dem i sebrafiskhjerner (McMillan og Tyndale 2018).

Disse funnene samsvarer med en lignende studie utført av Shankar og medarbeidere som testet effekten av ulike grupper av miljømessige polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH) på utviklingen av embryoer og videre evaluerte virkningen av hvert behandlingsregime på transkriptomprofilen.

På hele kroppen av 48 hpost-fertilisering (hpf) embryoer viste de at oppreguleringen av Cyp1a ved både transkripsjons- og proteinnivåer var en tidlig pålitelig biomarkør for xenobiotisk AHR-aktivering og nedstrøms transkriptomiske endringer (Shankar et al. 2019).

NRF2-mediert oksidativt stressrespons

Oksidativt stress kan utløse apoptose og nekrose og antas å være involvert i nevrodegenerasjon (Ahmadinejad et al. 2017; Jami et al. 2014b, 2015). En viktig cellulær forsvarsrespons på oksidativ stress er induksjon av antioksidanter og avgiftende enzymer.

Nukleær faktor-erytroid 2-relatert faktor 2(Nrf2) binder seg til promotor antioksidantresponselementer (ARE) og aktiverer deres transkripsjon. Inaktiv Nrf2 er assosiert med et aktinbindende proteinKeap1 og beholdes i cytoplasmaet.

Utløst av oksidativt stress, blir Nrf2 fosforylert som respons på proteinkinase C, fosfatidylinositol 3-kinase og MAP kinaseveier. Den fosforylerte Nrf2 kan deretter translokere til kjernen og binde ARE for å transaktivere avgiftende og antioksidantenzymer (tilleggstabell 3) (Ma 2013).

For more information:1950477648nn@gmail.com