Differensielle VHL-mutasjonsmønstre i bilateral klarcellet RCC skiller mellom uavhengige primærtumorer og kontralateral metastatisk sykdom

Objektiv

For å evaluere om bilaterale, multifokale klarcellet nyrecellekarsinom (ccRCC)-pasienter kan differensieres ved VHL-mutasjonsanalyse til tilfeller som representerer enten flere uavhengige primære svulster eller en enkelt primærtumor som har spredt seg ipsilateralt så vel som til den kontralaterale nyren. Naturen til multifokalitet i nyrekreft utenfor kjente arvelige syndromer er foreløpig dårlig forstått.

Materialer og metoder

DNA fra flere svulster per pasient ble evaluert for somatisk VHL-genmutasjon og hypermetylering. En undergruppe av svulster med delte VHL-mutasjoner ble analysert med målrettede neste generasjons sekvenseringsanalyser.

Resultater

Denne kohorten inneholdt 5 pasienter med flere svulster som viste en delt somatisk VHL-mutasjon i samsvar med metastatisk spredning inkludert til den kontralaterale nyren. I flere tilfeller ble dette underbygget av ytterligere delte somatiske mutasjoner i ccRCC-assosierte gener. Derimot viste de resterende 14 pasientene med flere svulster unike, ikke-delte VHL-endringer i hver analyserte svulst, i samsvar med uavhengig oppståtte nyresvulster. Ingen av disse sistnevnte pasientene viste tegn på lokal spredning eller fjernmetastaser.

Konklusjon

Spekteret av VHL-endringer i evaluerte bilaterale, multifokale ccRCC-svulster fra en enkelt pasient kan skille mellom flere uavhengige tumorvekst og metastaser. Dette kan utføres ved hjelp av tilgjengelige kliniske genetiske tester og vil forbedre nøyaktigheten av pasientdiagnose og prognose, samt informere riktig ledelse.

Klikk her for å fåfordelene med Cistanche

Introduksjon

Klarcellet nyrecellekarsinom (ccRCC) er den vanligste typen nyrekreft, og står for 75 prosent av tilfellene. Prognosen og behandlingen av ccRCC-pasienter er avhengig av det kliniske stadiet. Hvis sykdom oppdages tidlig, og fortsatt er lokalisert i nyrene, er kirurgisk reseksjon assosiert med en overlevelsesrate på 95 prosent 5-10-år. Men hvis svulsten har spredt seg lokalt eller systemisk, faller 5-åroverlevelsen til henholdsvis 67 prosent eller 12 prosent. Klarcellet RCC er oftest preget av biallelisk tap av von-Hippel Lindau tumorsuppressorgenet, VHL. Mekanistisk oppnås dette ved tap av en kopi av kromosom 3p, inkludert regionen som koder for VHL, i kombinasjon med mutasjon eller promotorhypermetylering av den andre kopien av VHL. Somatiske VHL-genendringer er observert i omtrent 90 prosent av sporadiske ccRCC, med genmutasjon sett i over 80 prosent av ccRCC og CpG-øypromoter hypermetylering observert i omtrent 8 prosent av ccRCC.

Mens det i de fleste sporadiske ccRCC-tilfellene bare er en enkelt lesjon i en nyre, viser en brøkdel flere lesjoner i en eller begge nyrene. Disse pasientene viser bilateral multifokal (BMF) ccRCC og arten av disse multiple svulstene kan påvirke diagnose og pasientbehandling. Presentasjonen kan representere en enkelt primær svulst som har spredt seg i den ipsilaterale nyren eller som har metastasert til den kontralaterale nyren. Flere studier har undersøkt tilfeller av multifokal ccRCC ved å sammenligne enten graden av 3p tap eller spekteret av kromosomale endringer blant svulster i samme pasient for å vise at de deler en felles klonal opprinnelse i samsvar med metastatisk spredning eller at hver svulst representerer en uavhengig oppstått hendelse . Denne følsomheten kan induseres av en miljøeffekt, som eksponering for trikloretylen (TCE), eller på grunn av en genetisk endring i kimlinje. En kjent årsak til bilateral multifokal nyrekreft er kimlinjemutasjonen av et RCC-følsomhetsgen, slik som VHL, MET, BAP1 eller FLCN, assosiert med et arvelig tumorpredisposisjonssyndrom. Den vanligste av disse er von Hippel-Lindau (VHL) sykdom, forårsaket av kimlinjeendring av VHL-genet, noe som resulterer i en disposisjon for bilateral multifokal ccRCC. Mens noen BMF ccRCC-pasienter vil ha VHL-syndrom, vil mange pasienter med multifokal bilateral sykdom ikke ha noe diagnostisert RCC-følsomhetssyndrom.

Evaluering av forskjellen mellom metastatisk eller uavhengig oppstått sykdom er mulig ved genetisk analyse av svulstene for å identifisere enten vanlige delte genetiske endringer, i tilfelle metastaser, eller forskjellige varierte genetiske endringer i tilfelle uavhengige hendelser. Å skille mellom disse to kliniske presentasjonene er avgjørende for riktig behandling av pasienten. Hvis metastaser har oppstått, vil pasienten mest sannsynlig bli behandlet for systemisk sykdom. I motsetning til dette, hvis alle svulstene var flere uavhengige hendelser i nyren(e), ville pasienten sannsynligvis bli behandlet for lokalisert sykdom og bli undersøkt for genetiske lidelser i kimlinjen, med screening av potensielt utsatte familiemedlemmer også vurdert.

I denne studien brukte vi VHL-genmutasjonsanalyse i ccRCC som en genetisk markør for å sammenligne svulster i hver pasient i en kohort av bilaterale multifokale ccRCC-pasienter som ikke hadde noen kjent genetisk endring i kimlinje. To pasientpopulasjoner ble identifisert: de med uavhengige svulster og de med metastaser til den kontralaterale nyren.

Cistanche-effekter

Materialer og metoder

1. Pasienter

Pasienter ble sett ved den urologiske onkologiske grenen (UOB) ved National Cancer Institute (NCI), National Institutes of Health (NIH) for klinisk vurdering. Pasienter ble ansett for å ha en familiehistorie hvis de har minst én første- eller andregradsslektning med en historie med klarcellet RCC, og tidlig debut dersom de ble diagnostisert i en alder av 46 eller yngre. Denne studien ble godkjent av Institutional Review Board ved National Cancer Institute, og alle pasienter ga skriftlig informert samtykke til Urologic Oncology Branch-protokoller. Alle pasienter fikk et laboratorietildelt avidentifisert 6-siffernummer for intern referanse.

2. PCR og DNA-sekvensering

DNA ble ekstrahert fra blod og tumorvev ved å bruke Promega Maxwell 16 Blood and Tissue DNA Purification Kits (Promega, WI,). DNA-sekvensering ble utført ved PCR ved bruk av et Qiagen Taq PCR Core Kit (Qiagen, MD) i henhold til produsentens spesifikasjoner, etterfulgt av toveis sekvensering ved bruk av Big Dye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA) i henhold til produsentens spesifikasjoner og kjøre på en ABI 3130xl eller 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, CA). Sanger Sequencing ble utført ved CCR Genomics Core ved National Cancer Institute, NIH, Bethesda, MD 20892. Forover- og reverssekvenser ble evaluert ved bruk av Sequencher 5.0.1 (Genecodes, MI).

3. DNA-metyleringsanalyse

DNA-er ble utsatt for bisulfittbehandling ved bruk av et Qiagen EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, MD) i henhold til produsentens spesifikasjoner. To primerpar ble designet som ville være i stand til å anneale til både metylert og umetylert/bisulfitt-konvertert DNA i nærheten av VHL-promotoren. PCR ble utført som ovenfor med de ytre primerne, etterfulgt av en andre runde med PCR med de indre primerne, og produktene ble utsatt for toveis sekvensering som ovenfor.

4. Oncomine og TruSight Oncology 500-analyse

Utvalgte svulster fra klinisk indiserte operasjoner ble valgt for analyse av Oncomine Comprehensive Assay v3 (ThermoFisher, MA) eller senere, TruSight Oncology 500 (Illumina, CA), neste generasjons sekvenseringsanalyser som er i stand til å oppdage enkeltnukleotidvariasjoner, kopiantallvariasjoner, genfusjoner og indeler fra henholdsvis 161 til 523 kreftdrivergener. Formalinfikserte, parafininnstøpte prøver ble behandlet av Molecular Diagnostics Section ved Laboratory of Pathology ved NCI.

Standardisert Cistanche

Diskusjon

Evnen til å bedre karakterisere pasienter med bilaterale multifokale nyretumorer vil muliggjøre bedre pasientbehandling og kan føre til ny innsikt i den genetiske naturen til klarcellet nyrecellekarsinom. Generelt er det relativt lite kjent om utviklingen av bilateral multifokal ccRCC. Hyppigheten av bilateral og/eller multifokal RCC enten ved presentasjon eller innen et år etter initial tumoroppdagelse er relativt lav, og den rapporterte frekvensen varierer sterkt fra 0,8 prosent til 5,4 prosent . Ytterligere studier av større kohorter med universelle diagnostiske kriterier er nødvendig for å fastslå den nøyaktige frekvensen av BMF ccRCC. Wiklund et al rapporterte at BMF RCC er mer vanlig hos yngre pasienter og Syed et al viste økt forekomst med lengre oppfølging. Noen få studier har undersøkt om multifokal RCC representerer lokal metastase eller uavhengig oppståtte hendelser ved å sammenligne enten graden av 3p tap eller spekteret av kromosomale endringer mellom svulster i samme pasient. Miyake et al og Junker et al viste begge delte mønstre av kromosom 3p tap eller kromosomendring mellom svulster hos samme pasient i samsvar med metastatisk spredning, mens Ji et al viste ulike grader av 3p tap blant svulstene fra 2 forskjellige pasienter forenlig med uavhengig oppstått svulster i begge tilfeller. Noen få kasusrapporter viser tegn på metastatisk spredning fra 1 nyre til den kontralaterale nyre-, binyre- eller nyreregionen.

I den aktuelle studien utviklet alle pasienter svulster i begge nyrene. Den metakrone sykdommen var mer vanlig (4/5; 80 prosent ) i gruppen som viste kontralaterale metastaser enn i de der svulstene vokste uavhengig (3/14; 21 prosent ), men både synkron og metakron kontralateral sykdom ble observert i begge kohorter . Analyse av mønsteret av VHL-mutasjon blant svulster fra hver pasient tillot alle pasienter å bli utpekt til å ha enten bekymring for metastatisk sykdom eller lokaliserte bilaterale nyretumorer som sannsynligvis har oppstått uavhengig. Pasienter med metastatisk sykdom delte en vanlig VHL-endring blant alle svulster, mens pasienter med uavhengig oppståtte nyresvulster hadde forskjellige VHL-endringer i forskjellige svulster.

Pasienter som viste en delt VHL-mutasjon i flere nyretumorer, kan være et resultat av VHL-mutasjoner i kimlinjemosaikk i stedet for metastaser. I dette tilfellet kan kimlinjemutasjonen bare være tilstede i nyreceller, eller til og med en brøkdel av nyrecellene, men ikke tilstede i de hvite blodcellene som er evaluert i en blodprøve eller de bukkale cellene fra en kinnpinne. Pasienten vil fremstå som kimlinjenegativ ved standardtesting, men kan ha den samme VHL-mutasjonen tilstede i flere uavhengige svulster. Dette prinsippet har nylig blitt demonstrert hos Wilms-svulstpasienter som hadde mutasjoner tidlig i utviklingen som resulterte i bilaterale multifokale svulster med en delt drivermutasjon. Viktigere, det ble også vist at i dette scenariet ville de uavhengige svulstene utvikle unike tilleggsmutasjoner etter hvert som svulsten utviklet seg. Generelt er mosaikk en sjelden hendelse og usannsynlig i denne studien da 3 pasienter viste svulster med delte ekstra somatiske genmutasjoner (MTOR og ARID1A for pasient 3; PBRM1, SETD2 og NFE2L2 for pasient 4; PBRM1 og KDM5C for pasient 5) som kunne bare deles på grunn av metastaser i stedet for mosaikk. I tillegg fikk 2 pasienter med delte VHL-mutasjoner (pasient 2 og 3) også sekvensering utført på det tilstøtende normale nyrevevet som ikke viste tegn på VHL-mutasjon. Til slutt utviklet 4 av 5 pasienter (pasient 1 til 4) metastaser utenfor nyrene

Det er verdt å merke seg at pasient 5 ennå ikke har vist tegn på fjernmetastaser. Mens hans største svulst var 4,8 cm og han kunne vurderes å ha høyere risiko for metastatisk spredning, øker observasjonen at alle de 7 av hans nylig resekerte svulstene deler VHL-mutasjoner og de fleste deler PBRM1- og KDM5C-mutasjoner mistanken om fjernmetastaser enda høyere. Som et resultat vil denne pasienten følges med spesielt nøye og tett observasjon fremover.

Cistanche piller og tørr Cistanche

Pasienter med uavhengig oppståtte nyretumorer viste berikelse for både en familiehistorie med nyrekreft og tidlig oppstått sykdom, som begge er indikatorer på arvelige endringer i kimlinje. Alle pasienter hadde screenet negative for kjente patogene variasjoner i nyrekreftgenet, noe som tyder på at alternative ukjente genetiske årsaker kan være til stede. Kimlinjetranslokasjon som involverer kromosom 3p har også vist seg å øke risikoen for ccRCC og er assosiert med bilateral multifokal sykdom. Translokasjoner kan ikke detekteres av målrettede genarrayer og krever karyotypeanalyse. Derfor bør pasienter med uavhengig oppståtte nyresvulster som presenteres uten mutasjoner i de kjente RCC-følsomhetsgenene også screenes for kromosom 3p-translokasjoner. Karyotypeanalyse var tilgjengelig for 12 av 14 av pasientene med uavhengig oppståtte nyresvulster i denne studien, men ingen relevante translokasjoner ble observert. Ytterligere evaluering av disse pasientene for ytterligere kimlinjeendringer kan identifisere nye RCC-følsomhetsgener, og VHL-mutasjonsspektrumanalysen gjør det mulig å velge disse pasientene.

Det blir stadig mer vanlig å utføre målrettet kreftgenmutasjonsanalyse på pasientsvulster eller biopsier, og disse analysene inkluderer ofte VHL-genet så vel som ytterligere ccRCC-assosierte gener som PBRM1, BAP1, SETD2 og ARID1A. Derfor kan rutinemessige bilaterale biopsier av bilaterale nyremasser gi en enkel og effektiv metode for å skille mellom kontralaterale metastaser og uavhengig oppståtte multifokale svulster, i motsetning til de kromosomale endringsbaserte analysene som tidligere er utført, noe som gir mulighet for ytterligere bekreftelse hos pasienter med metastatisk sykdom. Flere nyere studier har fremhevet den intratumorale heterogeniteten som er tilstede i ccRCC, og dette kan forvirre biopsianalyse ettersom prøveområdet kan mangle en mutasjon som bare er tilstede i noen områder av en svulst og gi unøyaktige resultater. Fordelen med å evaluere VHL-mutasjon er at den er tilstede i de fleste ccRCC-er og er en tidlig trunkal mutasjon som vil være tilstede gjennom hele svulsten, og derfor bør biopsier nesten alltid være informative.

Viktigheten av å kunne skille mellom pasienter med enten metastatisk sykdom eller lokaliserte, uavhengige nyresvulster er at de vil bli behandlet annerledes og potensielt ha distinkt forskjellige utfall. Mens bevis på metastaser utenfor nyrene er avgjørende, tillater ikke bildediagnostikk av pasienter som har BMF ccRCC en nøyaktig betegnelse. I denne studien er dette problemet best eksemplifisert av pasient 4, 9 og 19, da alle 3 presenterte med bilateral sykdom med en stor svulst i en nyre og en mindre svulst eller svulster i den kontralaterale nyren og ingen synkrone tegn på lesjoner utenfor nyre. Uten VHL-mutasjonsanalyse er det eneste merkbare trekk at pasient 19 hadde det yngste debut ved 36 år, og pasient 9 hadde det siste debut ved 62 år. Evaluering av VHL-mutasjonsspekteret viste at både pasient 9 og 19 hadde forskjellige VHL-endringer i forskjellige svulster, i samsvar med uavhengig oppståtte nyresvulster. Motsatt hadde pasient 3 den samme delte VHL-mutasjonen i alle svulster i samsvar med en felles opprinnelse og kontralateral metastase. Dette ble støttet av den delte tilstedeværelsen av delte ytterligere somatiske mutasjoner i MTOR og ARID1A i alle pasient 3s svulster. Dermed kan pasienter 9 og 19 behandles ved kirurgisk utskjæring av svulstene og rutinemessig overvåking, mens pasient 3 kan behandles med systemiske terapier som passer for en pasient med metastatisk sykdom.

Avslutningsvis kan analyse av VHL-endring i BMF ccRCC hjelpe til med å skille mellom kontralaterale metastatiske nyresvulster og lokaliserte, uavhengig oppståtte nyresvulster, og dette kan brukes til å påvirke pasientbehandling og resultat.

Referanser

1. Linehan WM, Walther MM, Zbar B. Det genetiske grunnlaget for kreft i nyrene. J Urol. 2003;170(6 Pt 1):2163–2172.

2. Chin AI, Lam JS, Figlin RA, Belldegrun AS. Overvåkingsstrategier for nyrecellekarsinompasienter etter nefrektomi. Rev Urol. 2006;8:1–7.

3. Shao N, Wan F, Abudurexiti M, Wang J, Zhu Y, Ye D. Dødsårsaker og betinget overlevelse av nyrecellekarsinom. Front Oncol. 2019; 9:591.

4. Gnarra JR, Tory K, Weng Y, et al. Mutasjoner av VHL-tumorsuppressorgenet i nyrekarsinom. Nat Genet. 1994;7:85–90.

5. Nickerson ML, Jaeger E, Shi Y, et al. Forbedret identifikasjon av von Hippel-Lindau-genendringer i klarcellede nyresvulster. Clin Cancer Res. 2008;14:4726–4734.

6. Kreftgenomatlasforskning n. omfattende molekylær karakterisering av klarcellet nyrecellekarsinom. Natur. 2013;499:43– 49.

7. Zbar B, Brauch H, Talmadge C, Linehan M. Tap av alleler av loci på den korte armen til kromosom 3 i nyrecellekarsinom. Natur. 1987;327:721-724.

8. Ricketts CJ, Linehan WM. Multiregional sekvensering belyser utviklingen av klarcellet nyrecellekarsinom. Celle. 2018;173:540–542.

9. Syed JS, Nguyen KA, Holford TR, Hofmann JN, Shuch B. Risikofaktorer for metakront bilateralt nyrecellekarsinom: En overvåking, epidemiologi og resultatanalyse. Kreft. 2019;125:232–238.

10. Crispen PL, Lohse CM, Blute ML. Multifokal nyrecellekarsinom: klinikopatologiske egenskaper og utfall for svulster

11. Wiklund F, Tretli S, Choueiri TK, Signoretti S, Fall K, HO Adami. Risiko for bilateral nyrecellekreft. J Clin Oncol. 2009;27:3737–3741.

12. Ji Z, Zhao J, Zhao T, Han Y, Zhang Y, Ye H. Uavhengig tumoropprinnelse i to tilfeller av synkront bilateralt klarcellet nyrecellekarsinom. Sci Rep. 2016;6:29267.

13. Miyake H, Nakamura H, Hara I, et al. Multifokal nyrecellekarsinom: bevis for en vanlig klonal opprinnelse. Clin Cancer Res. 1998;4:2491-2494.

14. Junker K, Thrum K, Schlichter A, Muller G, Hindermann W, Schubert J. Klonalt opphav til multifokal nyrecellekarsinom bestemt ved mikrosatellittanalyse. Journal of Urology. 2002;168:2632–2636.

15. Wells GM, Schroth W, Brauch H, Ross EA. Bilateralt nyrecellekarsinom assosiert med en ervervet VHL-mutasjon og langvarig eksponering for trikloretylen. Clin Nephrol. 2009;71:708–713.

16. Linehan WM. Genetisk grunnlag for bilateral nyrekreft: implikasjoner for evaluering og ledelse. J Clin Oncol. 2009;27:3731–3733.

17. Linehan WM, Srinivasan R, Schmidt LS. Det genetiske grunnlaget for nyrekreft: en metabolsk sykdom. Nat Rev Urol. 2010;7:277–285.

18. Linehan WM, Ricketts CJ. Det metabolske grunnlaget for nyrekreft. Semin Cancer Biol. 2013;23:46–55.

19. Latif F, Tory K, Gnarra J, et al. Identifikasjon av von Hippel-Lindau sykdom tumor suppressor genet. Vitenskap. 1993;260:1317-1320.

20. Choyke PL, Glenn GM, Walther MM, Patronas NJ, Linehan WM, Zbar B. von Hippel-Lindau sykdom: genetiske, kliniske og bildedannende funksjoner. Radiologi. 1995;194:629-642.

21. Kechrid M, Malik GH, Al-Mohaya S, et al. Nyrecellekarsinom i kontralateral nyre med sekundært i galleblæren åtte år etter nefrektomi. Saudi J Kidney Dis Transpl. 2000;11:587–592.

22. Wang K, Wang J, Sun JI, et al. Nyrecellekarsinom med metakron metastase til kontralateral binyre og urinblæren: en saksrapport. Oncol Lett. 2015;10:2749–2752.

23. Ahmed HK, Bapir R, Abdula GF, Hassan KMS, Ali RM, Salih MA. Solitær kontralateral binyremetastase av nyrecellekarsinom 15 år etter radikal nefrektomi: en saksrapport og gjennomgang av litteraturen. Int J Surg Case Rep. 2019;58:33– 36.

24. Coorens THH, Treger TD, Al-Saadi R, et al. Embryonale forløpere til Wilms-svulst. Vitenskap. 2019;366:1247–1251.

25. Foulkes WD, Polak P. Bilaterale svulster - arvet eller ervervet? N Engl J Med. 2020;383:280–282.

26. Cohen AJ, Li FP, Berg S, et al. Arvelig nyrecellekarsinom assosiert med en kromosomal translokasjon. N Engl J Med. 1979;301:592-595.

27. Foster RE, Abdulrahman M, Morris MR, et al. Karakterisering av en 3;6 translokasjon assosiert med nyrecellekarsinom. Gener Kromosomer Kreft. 2007;46:311–317.

28. Gerlinger M, Horswell S, Larkin J, et al. Genomisk arkitektur og evolusjon av klare celle nyrecellekarsinomer definert av multiregion sekvensering. Nat Genet. 2014;46:225–233.

29. Turajlic S, Xu H, Litchfield K, et al. Deterministiske evolusjonsbaner Påvirker primærtumorvekst: TRACERx nyre. Celle. 2018;173:595–610. e511.

Cathy D. Vocke, Christopher J. Ricketts, Adam R. Metwalli, Peter A. Pinto, Rabindra Gautam, Mark Raffeld, Maria J. Merino, Mark W. Ball og W. Marston Linehan