Distinkte tolllignende reseptorer genuttrykk og glialrespons i forskjellige hjerneregioner av naturlig skrantesjuke del 2

2.2. Nevropatologiske egenskaper i Hippocampus til sauer som er naturlig infisert med Serapie

Hos de scrapie-infiserte sauene og kontrollsauene ble de fire følgende hippocampale områdene undersøkt mer detaljert for alle patologiske markører: de pyramidale cellelagene CA1, CA3 og CA4, og SLM (figur 3).

Nyere studier har vist at det pyramidale cellelaget spiller en viktig rolle i hukommelsen. Det pyramidale cellelaget er nevronalt i hjernen, hovedsakelig ansvarlig for oppfatningen av det ytre miljøet og minnelagring.

Under læring og hukommelse frigjør det pyramideformede cellelaget noen nevrotransmittere, som kan stimulere kommunikasjon mellom nevroner, og dermed forbedre lagring og gjenfinning av minne. I tillegg kan det pyramideformede cellelaget også skjerme og integrere informasjon i lærings- og hukommelsesprosessen, og hjelpe oss til raskt å mestre ny kunnskap og ferdigheter.

Studier har også funnet at funksjonen og helsen til det pyramidale cellelaget har stor innvirkning på hukommelsens ytelse. Hvis det pyramidale cellelaget er skadet eller sterkt belastet, kan hukommelsen bli sterkt påvirket. Derfor må vi ta hensyn til helsen og vedlikeholdet av det pyramidale cellelaget for å opprettholde gode lærings- og hukommelsesevner.

Anbefalinger for helse og vedlikehold av det pyramidale cellelaget inkluderer kosthold, trening og søvn. For eksempel kan en diett rik på fettsyrer og antioksidanter bidra til å fremme helsen til det pyramidale cellelaget; regelmessig trening kan forbedre funksjonen og motstandskraften til nervesystemet; og gode søvnvaner kan bidra til å redusere belastningen på det pyramidale cellelaget og fremme hukommelseskonsolidering og gjenfinning.

Kort sagt, det pyramideformede cellelaget spiller en viktig rolle i læring og hukommelse. Vi bør ta hensyn til helsen og vedlikeholdet av det pyramidale cellelaget for å forbedre lærings- og hukommelsesevnene våre.

Klikk på Kjenn korttidsminne hvordan du kan forbedre

Samtidig bør vi unngå overdreven tretthet og stress, gi hjernen tilstrekkelig hvile- og restitusjonstid, og la hukommelsen vår kontinuerlig forbedres og perfeksjoneres.

Det kan sees at vi trenger å forbedre hukommelsen vår. Cistanche kan forbedre hukommelsen betydelig fordi den har antioksidant-, anti-inflammatoriske og anti-aldringseffekter, som kan bidra til å redusere oksidasjon og betennelsesreaksjoner i hjernen, og dermed beskytte helsen til nervesystemet. I tillegg kan Cistanche også fremme vekst og reparasjon av nerveceller, og dermed forbedre tilkoblingen og funksjonen til det nevrale nettverket.

Disse effektene kan bidra til å forbedre hukommelsen, læreevnen og tenkehastigheten, og kan også forhindre forekomsten av kognitiv dysfunksjon og nevrodegenerative sykdommer.

Figur 3. Fordeling av nevropatologiske lesjoner (HE), PrPSc-avsetning, astrogliose (GFAP) og mikrogliose (Iba1), i fire forskjellige hippocampale regioner i skrapesyke-infiserte og kontrollsau: pyramideformede cellelag CornuAmmonis (CA) 1, 3 og 4 og stratum lacunosum-moleculare (SLM).

Grafer viser semikvantitative vurderingsverdier for hver parameter som er analysert. (A) Milde spongiforme endringer ble observert i alle hippocampale regioner som ble analysert. (B) Intranevronalt PrPSc-mønster (L42) i CA1, CA3 og CA4 og utbredt fint granulært PrPSc-mønster i SLM. (C) Økt Iba1-farging hos skrantesyke-infiserte versus kontrollsau.

Forstørrede bilder viser noen av de morfologiske forskjellene som er observert. (D) Tegn på moderat reaktiv astrogliose hos skrantesyke-infiserte sauer sammenlignet med kontroller. Poeng varierer fra 0 (negativ) til 5 (maksimal intensitet).

Signifikante forskjeller ble bestemt ved å bruke studentens t-test eller Mann–Whitney U-test for henholdsvis normalt og ikke-normalfordelte data. * p < 0.05, ** p < 0,01. Målestokk=200 µm.

Spongiose i hippocampus var veldig mild, og sporadiske vakuoler ble observert i CA1, CA3 og CA4 og SLM (Figur 3A). Dette begrensede nevrontapet sto i kontrast til sparsom, men fokalt intens PrPSc-avsetning i CA1 og CA3 (figur 3B).

Verymild PrPSc-farging ble observert i CA4 og SLM. Distinkte PrPSc-mønstre ble observert i disse hjerneområdene (figur S2). Mens intraneuronale og neuropil-assosierte PrPSc-mønstre dominerte i CA1 og CA3, var intraglial avsetning det hovedmorfologiske mønsteret som ble observert i SLM.

Milde intraneuronale og neuropil-assosierte PrPSc-mønstre ble konsekvent observert i CA4, selv om intensiteten var lavere enn den som ble observert i CA1 og CA3. Iba1 ble konstitutivt uttrykt og sparsomt fordelt i kontrollprøvene. I motsetning til dette ble markert mikrogliose observert i CA1, CA3 og CA4 og SLM hos skrantesyke-infiserte sauer.

Imidlertid skilte de mikrogliale morfologiske egenskapene seg betydelig mellom disse hjerneområdene. I CA1-pyramidelaget viste de fleste mikrogliaceller korte prosesser med forstørrede cellelegemer, karakteristisk for den hypertrofiske morfologien.

I CA4 var mikroglialcellene også hypertrofiske, men viste lengre og tynnere grener enn CA1 mikroglialcellene. I mellomtiden viste de hypertrofiske mikroglia i SLM korte og tynne prosesser med hovne cellelegemer. Derimot, i CA3, observerte vi den nevnte stav-mikroglia-morfologien [42].

Disse mikrogliacellene hadde forlengede cellelegemer, med en lang parallell primærprosess orientert vinkelrett på CA3-pyramidecellelaget, og undergrener som var kortere enn de lange primærprosessene.

GFAP-immunfarging ble betydelig økt i CA1- og CA3-pyramidecellelagene fra de skrapesyke-infiserte versus kontrollsauene. Interessant nok var PrPSc-skårene høyest i CA1 og CA3. Ingen forskjeller ble observert i CA4 pyramidale cellelag eller SLM.

2.3. Nevropatologi av skrapie-infiserte tg338-mus

De samme nevropatologiske markørene for spongiose, PrPSc-avsetning, mikrogliose og astrogliose analysert hos sauer ble undersøkt i thalamus til klinisk affiserte tg338-mus som hadde blitt intracerebralt infisert med skrantesjuke (Figur 4).

Sammenlignet med kontrollene, ble det observert signifikante forskjeller (p < 0.05) i spongiose i thalamusof scrapie-infiserte mus, der vakuolene var begrenset til neuropilen.

PrPSc-avsetninger var vidt distribuert på nivå med cytoplasma og neuropil. Vurderingen av gliose avslørte signifikante forskjeller i Iba1- og GFAP-immunfarging mellom scrapie-infiserte og kontrollmusene, med både astrocytter og mikroglia som viser hypertrofiske morfologier.

PrPres-akkumuleringen ble også vurdert av WB i alle scrapie-infiserte mus, og avslørte et konstant 19 kDa båndmønster (figur 5). Intensiteten til PrPres-signalet i tg338-mus var mer homogen blant individer enn hos sau, som forventet for eksperimentell infeksjon der dosen, inokulasjonsalderen og avlivingstidspunktet ble kontrollert.

Det ble ikke påvist noe signal i kontrollmusene inokulert med normalt hjernehomogenat, uenig med de negative IHC-resultatene.

Figur 4. Thalamussnitt fra skrapesyke-infiserte (intracerebral inokulering) og alderstilpasset tg338 kontrollmus immunfarget for å vurdere spongiose (hematoxylin-eosin), PrPSc-avsetning (R486antistoff), astrocytter (glialfibrillært surt protein; GFAP) og mikroglia -bindingsadaptermolekyl-1; Iba1). (A, E) Alvorlige spongiforme lesjoner lokalisert hovedsakelig i neuropilen til scrapie-infiserte versus kontrollmus. (B, F) Flere PrPSc-positive nevroner er tydelige i scrapie-infiserte mus, men fraværende fra kontrollene. (C, G) Aktiverte mikroglia som viser mer intens immunfarging og tykke prosesser i skrapesyke-infiserte mus kontra kontroller. (D, H) Økt astrogliose med hypertrofiske cellelegemer og prosesser i skrapesyke-infiserte mus versus kontroller. Poengsummen varierer fra 0(negativ) til 5 (maksimal intensitet).

Signifikante forskjeller ble bestemt ved å bruke studentens t-testor Mann–Whitney U-test for henholdsvis normalt og ikke-normalfordelte data. * p < 0.05,** p < 0,01. Målestokk=200 µm.

Figur 5. Western blot-deteksjon av PrPres-akkumulering i CNS av klinisk affiserte tg338-mus intracerebralt inokulert med skrantesjuke sammenlignet med matchede kontroller.

Ekvivalente proteinmengder ble lastet for adekvat sammenligning og immunoblots ble kjørt ved bruk av SHA31 monoklonalantistoff. Molekylvektsmarkører (kDa) er indikert på venstre side av immunblotten.

Oppreguleringen av TLR-ekspresjon som respons på Prpsc har tidligere blitt rapportert i eksperimentelle in vivo og in vitro-forhold. Derfor, etter å ha karakterisert tilstedeværelsen av de viktigste prion-induserte nevropatologiske endringene i CNS i sammenheng med naturlig og eksperimentell sykdom, undersøkte vi om disse endringene korrelerte med endringer i TLR-genuttrykk.

For dette formål utførte vi qPCR ved å bruke prøver fra de fire hjerneregionene til sauer for å vurdere uttrykket av MyD8g og Trif, de to viktigste adapterproteinene som er involvert i TLR-signalering; CD36, en scavenger-reseptor som samarbeider med TLR-er; og TLR mRNA.

I tillegg målte vi nivåene til fire pro- og anti-. inflammatoriske cytokiner i thalamus og hippocampus hos sau for å vurdere den inflammatoriske responsen ytterligere. I tg338-mus målte vi mRNA-nivåene til MyD88 og TLR1-9 i thalamus.

Gener for hvilke det ble observert signifikante forskjeller angående kontroller, og de tilsvarende foldendringene, er vist i tabell $l, og ACt-verdiene fra kontroll- og skrantesyke-infiserte sauer er representert i figur $3.

Antallet endrede gener sank i kaudal-rostral retning. Medulla oblongata av skrantesyke-infiserte sauer var regionen der de største endringene i TLR-genuttrykk ble observert (figur 6). I denne regionen var uttrykket av TLR2, 3, 4, 6,7, 8, 9 og CD36 signifikant høyere (p < 0.01) hos de scrapie-infiserte versus kontrolldyrene.
I thalamus var TLR6, MyD88 og CD36 signifikant oppregulert i den skrapie-infiserte gruppen (p < 0.05), mens TLR2 og TLR3 viste en tendens til oppregulering (p < {{12} }.1). I frontal cortex (det mest rostrale området) var TLR4 og CD36 de eneste overuttrykte genene (p < 0,05).

Bemerkelsesverdig nok ble det funnet kontrasterende uttrykksmønstre i hippocampus til den skrapesyke-infiserte sauen, der TLR2 og MyD88 ble nedregulert (p < 0.01) og TLR1 viste en tendens til nedregulering (p < 0,1) .

I tillegg var hippocampus det eneste området der CD36-ekspresjonen ikke ble økt. Totalt sett var TLR4 det genet som var mest oppregulert hos skrapesyke-infisert kontra kontrollsau i alle fire hjerneregioner, selv om ingen signifikante forskjeller ble observert i thalamus eller hippocampus på grunn av intra-individuell variasjon.

Analysen av cytokinnivåer avslørte overekspresjonen av TGF-, IL-10 og IL-6 i thalamus til den skrantesjuke-infiserte versus kontrollsauen, men ingen endringer i hippocampus (figur 7).

Figur 6. Genekspresjon av TLR 1-10, MyD88, Trif og CD36 i medulla oblongata (A), thalamus (B), frontal cortex (C) og hippocampus (D) hos kontroll- og skrapesyke-infiserte sauer .

Data er representert som gjennomsnittlig fold ± SEM-økning for kontrollsau (uttrykt som en score på 1). Gjennomsnittlig poengsum ble sammenlignet ved å bruke studentens t-test eller Mann–Whitney U-test for henholdsvis normalt og ikke-normalfordelte data. # p < 0.1, * p < 0.05, ** p < 0,01.

Figur 7. Genekspresjon av de antiinflammatoriske cytokinene TGF- og IL-10, og de proinflammatoriske cytokinene TNF- og IL-6, i thalamus (A) og hippocampus (B) i kontroll og naturlig skrantesjuke -infiserte sauer.

Data er representert som gjennomsnitt ± SEM-fold endring for kontroller (uttrykt som en score på 1). Gjennomsnittlig poengsum ble sammenlignet ved å bruke studentens t-test eller Mann–Whitney U-test for henholdsvis normalt og ikke-normalfordelte data. * p < 0.

For å undersøke om endringer i TLR-ekspresjon i CNS ved naturlig sykdom er sammenlignbare med de indusert i tg338-musemodellen etter intracerebral infeksjon med skrapesjuke, ble transkripsjonsnivåene til TLR og MyD88 evaluert i thalamus ofg338-musene (figur 8). TLR1- og TLR2-mRNA-nivåer ble signifikant økt (p < 0.01) sammenlignet med kontroller, og det var en tendens til oppregulering av TLR7 (p< 0.1). The levels of TLR8 expression were undetected.

Figur 8. Genekspresjon av TLR1-7, TLR9 og MyD88 i thalamus til klinisk affiserte tg338-mus intracerebralt inokulert med skrantesyke-positivt inokulum versus kontroller (skrapie-negativt inokulum). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM-fold endring angående kontroller (uttrykt som en poengsum på 1). Gjennomsnittlig poengsum ble sammenlignet ved å bruke studentens t-test eller Mann–Whitney U-test for henholdsvis normalt og ikke-normalfordelte data. # p < {{10}}.1, ** p < 0,01.

2.5. Vurdering av TLR4-proteinnivåer bekrefter oppregulering oppdaget av qPCR inScrapie-infiserte sauer

For å bekrefte at den observerte økningen i TLR4 mRNA oversettes til endringer i proteinnivåer, ble TLR4 evaluert av WB i medulla oblongata, thalamus, hippocampus og frontal cortex av fire skrantesyke-infiserte sauer og fire kontrollsauer (Figur 9).

I samsvar med qPCR-resultatene ble TLR4-proteinnivåene signifikant økt (p < 0.05) i alle fire hjerneregioner til den skrapesyke-infiserte sauen.

Figur 9. TLR4-proteinekspresjon i medulla oblongata (Mo), thalamus (Th), hippocampus (Hc) og frontal cortex (Fc) hos skrantesyke-infiserte sau versus kontrollsau (n=4 per gruppe). -aktin ble brukt som belastningskontroll.

Grafen viser densitometriverdier og indikerer en signifikant økning i TLR4-ekspresjon i alle regioner hos skrapesyke-infiserte versus kontrollsau. Data er uttrykt som tema ± SEM. Gjennomsnittlige skårer ble sammenlignet ved hjelp av studentens t-test. * p < 0.05.

3. Diskusjon

De siste årene har studiet av den nevroinflammatoriske responsen ved prionsykdommer ført til en bedre forståelse av de underliggende mekanismene og konsekvensene.

Nevroinflammasjon involverer reaktiv mikrogliose og astrogliose [43], som begge kan oppdages før utbruddet av kliniske tegn og går foran spongiose og nevronalt tap [7,8,18].

Hvorvidt mikroglial aktivering i prionsykdommer er gunstig eller skadelig, er fortsatt et spørsmål om debatt. Noen forfattere hevder at mikroglial aktivering og spredning bidrar til den nevroinflammatoriske prosessen og påfølgende nevrodegenerasjon [8,18,44].

Imidlertid peker andre på en generell beskyttende rolle til mikroglia, og in vitro viser studier at mikroglia kan internalisere og nedbryte PrPSc [27,45]. I tråd med disse funnene har in vivo-eksperimenter vist at mikroglial utarming reduserer overlevelsesperioden, sannsynligvis på grunn av redusert PrPSc-clearance [46,47].

Derfor er det sannsynlig at flere reaktive mikrogliale fenotyper eksisterer under sykdomsprosessen, som utøver en nevrobeskyttende effekt i tidlige sykdomsstadier og, etter hvert som sykdommen utvikler seg, gir plass til en proinflammatorisk fenotype som fremkaller skadelige effekter [9,10]. En hypotese foreslår at TLR-signalering medierer gliacelleaktivering ved prionsykdommer.

Mikroglia-opptaket av amyloidfibre i Alzheimers sykdom er kjent for å bli fremmet av TLR-aktivering [48,49]. Mens aktiveringen av TLR-er på gliaceller kan spille en rolle i fjerningen av aggregerte eller unormale proteiner (f.eks. prionprotein), kan således kronisk aktivering være skadelig for verten, noe som resulterer i nevrotoksisitet og nevronal celledød [50].

Til dags dato er data om rollen til TLR i prionpatogenese svært begrenset. Få studier har målt endringer i TLR-ekspresjon i CNS i musemodeller, og en har rapportert endringer i TLR-ekspresjon i blodet til lam, hvor alle tilfeller brukte dyr eksperimentelt infisert med prionsykdom [22,26,30].

For more information:1950477648nn@gmail.com