DEL Ⅰ:SARS-CoV-2-infeksjon påvirker vev inkludert hjertet og nyrene
Mar 18, 2022
for mer informasjon:ali.ma@wecistanche.com
DEL Ⅰ:SARS-CoV-2-infeksjon i den syriske hamstermodellen forårsaker betennelse så vel som type I interferon dysregulering i både respiratorisk og ikke-respiratorisk vev, inkludert hjerte og nyre
Magen Ellen Francis, Una Goncin & et al.
Introduksjon
SARS-CoV-2(alvorlig akuttluftveienecoronavirus 2) som forårsaker COVID-19 (coronavirus 2019) dukket opp på slutten av 2019 med påfølgende massive folkehelse og økonomiske konsekvenser[1,2].SARS-CoV-2er et enkeltstrenget RNA-virus med positiv sans fra familien Coronoviridae, slekten Betacoronavirus[3], og har siden dets fremvekst ført til over 170 millioner bekreftede tilfeller og 3,5 millioner dødsfall på verdensbasis per 1. juni 2021 [4]. Selv om koronavirusinfeksjoner hos mennesker tidligere ble antatt å kun forårsake milde, forkjølelseslignende symptomer, er de nyere koronavirusene som dukket opp, SARS-CoV (alvorlig akuttluftveienekoronavirus) og MERS-CoV (Midtøstenluftveienesyndrom coronavirus), er assosiert med et bredt spekter avluftveieneog ikke-respiratoriske symptomer[5,6], som varierer fra milde til alvorlige, som fører til organsvikt og død [Z. Asymptomatiske tilfeller er også rapportert[8]. Gitt byrden på folkehelsen, så vel som omfanget av sykdommens alvorlighetsgrad, utvikle dyremodeller for å studereSARS-CoV-2patogenese og identifisere mottiltak er av stor betydning. In vivo vurdering av vertsrespons på virusinfeksjon er avgjørende for å identifisere vertsfaktorer som regulerer alvorlig sykdom, samt biomarkører som kan bidra til å informere pasientstøttende behandlingstiltak.
Vurdering av vertssvar tilSARS-CoV-2har ført til verdifull innsikt i sykdomsprogresjon og mulige immunmekanismer som fører til alvorlig sykdom. Det har nå blitt bredt vist at alvorlige tilfeller av covid-19 hos mennesker ofte er ledsaget av økt ekspresjon av inflammatoriske gener, inkludert Interleukin-6(IL-6), Interleukin-1 beta(IL-1beta) og tumornekrosefaktor (TNF) [9-11]. I forkant avSARS-CoV-2, var det kjent at koronavirus var i stand til å regulere type I interferonrespons [12,13]. Flere studier har funnet at type I interferonresponser er betydelig sløvet underSARS-CoV-2infeksjon som tyder på at dette også kan bidra til dårlige covid{0}}-utfall[14,15]. Disse kliniske dataene antyder potensielle markører for patogenese for videre eksperimentelle undersøkelser.
Syriske hamstere var en av en håndfull dyrearter som ble identifisert tidlig under pandemien for å være produktivt infisert medSARS-CoV-2og potensiell bruk for preklinisk utvikling og in vivo analyse[l6]. Hamstere ble opprinnelig bestemt til å være mottakelige for SARS-CoV [17] og har siden vist seg å være en modell forSARS-CoV-2[18]. Hamstere er i stand til å støtteSARS-CoV-2replikering innenfor den nedreluftveienekanalen[18-20] med noen likheter med infeksjonen og sykdomsdynamikken som hos mennesker, selv om infeksjonstidsforløpet ser ut til å være kortere hos hamstere[21]. Ildere har ikke vist seg å støtte infeksjon i lungen, da viruset kun har blitt oppdaget i øvre delluftveienekanal som antyder at denne modellen kan være nyttig for overføringsstudier [22]. I tillegg har mus ikke vist seg å være mottakelige for den opprinnelige WuhanSARS-CoV-2virus. Hamstere har også vist seg å gi en effektiv antistoffrespons og har blitt brukt til både COVID-19-vaksine- og behandlingsstudier[19,20,23]. Som med andre ikke-tradisjonelle dyremodeller, er det mangel på hamsterspesifikke biologiske reagenser for å karakterisere immunresponser og mekanismene for patogenese [24].
Her undersøkte vi immunresponsen og patogenesen tilSARS-CoV-2infeksjon hos hamstere for å bestemme sykdomsmekanismer og involvering av spesifikke organer som lungene,hjerte, ognyresiden COVID-19 er en multisystemsykdom.SARS-CoV-2inokulerte syriske hamstere ble tatt over et 15-dagkurs for virologisk og immunologisk analyse ved qRT-PCR, transkriptomanalyse, virustitreringsanalyser og immunhistokjemi (IHC). Deluftveienekanalen hadde en høy byrde med å replikere viruset i både øvre og nedre regioner med spesifikk avstumpning av type I interferonrespons. Mens vi fant lite bevis på smittsomt virus utenforluftveienevirus-RNA var tilstede i flere organer inkludertnyrer, hjerte, lymfeknute og lever med samtidig ekspresjon av inflammatoriske mediatorer som IL-6, TNF og IL-1beta. Lungene, så vel som ekstrapulmonale organer, viste tegn på inflammatorisk celleinfiltrasjon som førte til vevsskade. Sammen har vi definert hamstermodellen for immunopatogenese i sammenheng med COVID-19 som kan brukes til å identifisere korrelater av beskyttelse og sykdom, for evaluering av medisinske mottiltak.
Klikk for å få cistanche-effekter for nyresykdom
Resultater
SARS-CoV-2-inokulerte hamstere har vekttap som korrelerte med viral belastning, smittsomt virus iluftveienetarmkanalen og viralt RNA i ikke-respiratorisk vev
Syriske hamstere er mottakelige for infeksjon medSARS-CoV-2antyder at de kan være verdifulle for undersøkelse av immunopatologi og sykdomsmekanismer [20]. Hamstere er i alderen 6-8 uker ble inokulert intranasalt medSARS-CoV-2 at 10° TCIDs0. The animals were monitored for temperature and weight throughout the course of the infection. As typical during viral infection in small animals, hamsters began showing a decrease in temperature by day 1 post-inoculation(pi)(S1A Fig)which returned to baseline between day 3 and 7 (S1B Fig). Inoculated hamsters began losing weight on day 2 pi, with weights being significantly different from baseline on days 3 to 7. Weight loss was most severe on day 6 pi where the average body weight of the inoculated animals was 88.26% of the original weight (Fig 1A). After day 6, there was a steady increase in weight over the remaining time course on average recovering to baseline by day 12. Individual animals showed two different trajectories of weight loss: mild (~4%weight loss) and severe(>15 prosent vekttap)(Fig1B). Ingen dyr mistet mer enn 20 prosent av sin opprinnelige vekt og nådde også andre kriterier for det humane endepunktet som definert i metodene under studien. Dyr ble fjernet fra studien på forhåndsbestemte sluttdager for prøvetaking, derfor vises ikke individuelle vekter for alle dyr.
COVID-19 påvirker flere organsystemer hos mennesker, inkluderthjerte, nyrer, lever, milt og tykktarm[25,26]. Derfor var vi interessert i å bestemme tropismen til viruset og tilhørende immunopatologi i hele kroppen til infiserte hamstere for å få innsikt i sykdommen. Dyr ble fjernet fra studien på dagene 0,2,5,8,12 og 15pi for å vurdere vevsspesifikke responser for obduksjon og analyse av immunopatologien. Blod, neseskyllinger og vev (luftveieneog ikke-respiratoriske) ble samlet inn. Viral tropisme ble vurdert ved qRT-PCR forSARS-CoV-2konvoluttgen(E) og virustitrering med vevskulturinfeksjonsdose 50(TCIDs0)-analyser (fig2). E-genekspresjonsanalyse er representert av brune sirkler på grafene. Analyse avluftveienekanalen avslørte vRNA tilstede i neseturbinatene, luftrøret og alle fire testede lungelappene (høyre kraniale, høyre midtre, høyre kaudal og tilbehør) på dag 2, 5 og 8 pi. Viralt RNA ble fortsatt påvist i den høyre midterste lungelappen og den ekstra lungelappen til ett dyr på dag 12 pi. Levende viral titeranalyse, representert ved de grå sirklene, indikerte at infeksiøst virus var tilstede i neseturbinater på dag 2 (7,5 TCID0/ml(Logl0)) og 5 (6 TCIDer{{ 11}}/mL(Logl0))pi. Infeksiøst virus nådde en topp i lungene på dag 2, ved ~9 TCIDs/ml(Log10) i høyre midtlunge og var tilstede til dag 5. Luftrøret hadde de laveste virusnivåene av alleluftveienevev som bare var til stede på dag 2 (~3 TCIDso/mL(Logl0)).vRNA ble også påvist i ikke-respiratorisk vev inkluderthjerte, nyre, tykktarm og mediastinal lymfeknute ved lave til moderate nivåer. Den mediastinale lymfeknuten hadde det høyeste nivået av vRNA, ~5 TCIDer (Log10), og var det eneste ikke-respiratoriske vevet som var positivt for infeksiøst virus.
Fig 1. Intranasal SARS-CoV-2-infeksjon hos hamstere fører til betydelig vekttap.Syriske hamstere ble inokulert intranasalt med det alvorlige akutteluftveienesyndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ved 105 TCID50. Vekt (A og B) ble registrert i 15 dager etter inokulering. Gjennomsnittlige resultater (A) viser gjennomsnittet. Individuelle resultater representerer hvert dyr (B). indikerer en p-verdi<0.05 determined="" by="" anova="" comparing="" hamsters="" on="" the="" day's="" post-inoculation="" to="" baseline="" (day="" 0).="" error="" bars="" indicate="" +/-="" standard="" error="">
For å bestemme om virusoppløsningen skyldtes fremkalling av nøytraliserende antistoffer, kvantifiserte vi deretter de nøytraliserende antistofftitrene i infiserte hamstere gjennom hele tidsforløpet (Eig 3A). Plasma ble isolert fra blod samlet ved obduksjon for å brukes til nøytraliseringsanalyser ved 100 TCIDs per reaksjon avSARS-CoV-2. Nøytraliserende antistoffer ble påvist så tidlig som dag 8 pi, ved en endepunkttiter på omtrent 63 (geometrisk gjennomsnitt). Dette økte til et geometrisk gjennomsnitt på 160 på dag 12 og toppet seg på dag 15 med et geometrisk gjennomsnitt på 587. Disse observasjonene antydet at hamstere er i stand til å fremkalle høye titere av nøytraliserende antistoffer etterSARS-CoV-2infeksjon. Neseskyll ble samlet gjennom hele studien for å bestemme viral utskillelse fra den øvre delenluftveienetract.vRNA ble påvist i nesevaskingene opptil 12 dager etter inokulering med levende virus observert på dag 2 og 5, med en topp på dag 2 med litt over 6 TCID5o/ml (Log10). Vi sammenlignet den levende virale titeren som ble funnet i nesevaskene til alle dyr på dag 5 med deres respektive vekttap den dagen (fig 3B). En Pearson-korrelasjon for normalfordelte data ble brukt for denne analysen for å bestemme om det eksisterer et lineært forhold mellom vekten av infiserte dyr og virustiter i nesevaskene på dag 5 etter inokulering, med dag 5 som en dag hvor noen dyr begynner å fjerne virus. Vi fant en Pear-son-korrelasjon på -0.68, slik at etter hvert som virustiteren i nesevaskene økte, hadde dyrene økt sannsynlighet for mer alvorlig vekttap (p-verdi =0.00242). I tillegg vurderte vi forholdet mellom lungevirustiter og vekttap på dag 5 pi. Siden bare 3 dyr ble samlet inn hver dag, er datasettene for å vurdere for en korrelasjon begrenset av prøvestørrelsen vår. Selv om dette antallet datasett ikke oppfyller ønsket antall målinger, utførte vi en Pearson-korrelasjon og fant en negativ, selv om den ikke-signifikante, korrelasjonen mellom lungevirustiter og vekttap på dag 5 etter inokulering. Basert på virustiteren fra de respektive lungelappene vurdert sammenlignet med dyrevekten, hadde høyre kraniale lunge en R-verdi på -0.91(p-verdi=0.27), høyre midtlunge hadde en R-verdi på -0.92(p-verdi=0.25) og høyre kaudallunge hadde en R-verdi på -0.58 (p-verdi{{39 }}.61)(S2 Fig.). Ytterligere vurdering på flere dyr bør gjøres for å få tillit til forholdet mellomSARS-CoV-2lungevirustiter og vekttap for hele dyr.
Fig 2. Levende SARS-CoV-2-virus er begrenset til luftveisvev og mediastinale lymfeknuter mens viralt RNA er tilstede i ekstrapulmonale organer.Dyrene ble fjernet fra studien på dag 0 før infeksjon, samt dag 2, 5 8, 12 og 15 etter inokulering.luftveienevev som ble samlet inn inkluderte neseturbinat, luftrør og lunge (høyre kraniallapp, høyre midtlapp, høyre kaudallapp, tilbehørslapp). Ekstrapulmonale organer som ble analysert inkluderte den mediastinale lymfeknuten,hjerte, nyre, levermilt og tykktarm. Alt vev ble høstet for å kvantifisere virus ved qPCR-deteksjon avSARS-CoV-2E-genet i TCID50/mL-ekvivalenter basert på en standardkurve av viralt RNA ved bruk av RNA ekstrahert fra en bestand avSARS-CoV-2med kjent konsentrasjon (TCID50/mL) (Brun). Det smittsomme viruset ble kvantifisert ved en vevskulturinfeksjonsdoseanalyse og uttrykt i TCID50/ml (grå). TCID50/ml ble beregnet ved å bruke Reed and Muench-metoden. Den stiplede linjen representerer deteksjonsgrensen i analysen for levende viral belastning, basert på den laveste fortynningen av prøven. Deteksjonsgrensen for qPCR-deteksjon av E-genet var 101 TCID50/ml. Datapunkter representerer individuelle dyr og linjen representerer gjennomsnittet.
Lungebetennelse og lungepatologi er ofte det definerende trekk vedluftveienevirusinfeksjon, noe som resulterer i betydelig sykelighet og dødelighet. For å bestemme omfanget av skade på lungene iSARS-CoV-2infiserte hamstere, og hamsters evne til å rekapitulere det alvorligeluftveieneinvolvering i humane COVID-19-pasienter, undersøkte vi sykdomspatogenesen i venstre lunge hos hamstere gjennom hele infeksjonsforløpet (fig 4). Mikroskopisk analyse av H&E-farging indikerte en økning i skade i lungen i løpet av infeksjonen, med den mest alvorlige patologien notert på dag 8 pi som delvis løste seg på dag 15 (Eig 4A). Uinfiserte hamstere hadde klart alveolært rom uten tegn på inflammatorisk celleinfiltrasjon eller blødning. På dag 2 pi var mononukleær celleinfiltrasjon til stede i de alveolære og peribronkiale rommene (gul pil). Celleinfiltrering fortsatte på dag 5 med økt infiltrasjon. På dag 8 ble det peribronkiale rommet preget av tilstedeværelsen av inflammatoriske mononukleære celler. Det ble observert utsletting av epitelceller i bronkiolene (svart pil) og blødninger kunne observeres i hele vevet (rød pil). Blødning var løst på dag 12, selv om hyperplasi var tydelig (grønn pil). På dag 15 ble hyalinmembrandannelse (blå pil) observert med samtidig reduksjon av inflammatorisk celleinfiltrasjon.
Fig 3. Viral utskillelse av SARS-CoV-2 øker med alvorlighetsgraden av kliniske utfall, men avtar ettersom nøytraliserende antistoffer kan påvises i dyreplasma.Nesevasker ble samlet for å kvantifisere viruset ved qPCR-deteksjon avSARS-CoV-2E-gen (brunt) og uttrykt i TCID50/ml ekvivalenter. Levende virusbelastningsanalyser (grå) ble utført for å kvantifisere smittsomme virus. Infeksiøse titere av nesevaskingene ble bestemt ved vevskultur infeksiøse dosetitreringsanalyser og den resulterende TCID50/ml ble beregnet ved å bruke Reed og Muench-metoden. LOD=grense for deteksjon for analyser av levende viral belastning. Virusnøytraliseringstitre ble bestemt ved standard nøytraliseringsanalyser ved bruk av plasma samlet gjennom tidsforløpet (svart) (A). Levende viraltiter i nesevaskene korrelerte negativt med vekttap på dag 5 etter infeksjon. R-verdi=-0.68 (p-verdi=0.00242) (B).
For å validere virusbelastningsresultater i lungen, samt visualisere plasseringen av viruset, utførte vi IHC-farging av venstre lungelapp for å oppdageSARS-CoV-2pigg protein. Ingen viralt protein ble påvist i uinfiserte hamstere, noe som tyder på spesifisiteten til antistoffet som ble brukt. På dag 2 pi hadde venstre lunge betydelig farging (svart pil) som tyder på akkumulering avSARS-CoV-2piggantigen (Eig 4B). Farging var mest fremtredende i epitelcellene i bronkiolen, med diffus farging gjennom epitelcellene i alveolveggen. På dag 5 var lys farging (blå piler) tilstede gjennom luftveiene og alveolære celler. Ingen farging ble påvist på dag 8 pi hvor bildene så ut som bilder av den uinfiserte bronkiolen.
Fig 4. Inokulerte hamstere har betydelig betennelse i lungen sammenfallende med SARS-CoV-2 Spike-antigenfarging.Den venstre lungen ble samlet fra hvert dyr ved obduksjon og perfusert med 10 prosent formalin før parafinblokkinnleiring og H&E-farging. Røde piler indikerer blødning; grønne piler indikerer hyperplasi; gule piler indikerer mononukleær celleinfiltrasjon; svarte piler representerer celle-sloughing; blå pil representerer hyalin membrandannelse (A). Lungen ble farget for tilstedeværelse avSARS-CoV-2piggprotein av IHC ved å bruke et monoklonalt anti-spike kanin antistoff. Svarte piler indikerer høye mengder viral antigenfarging og blå piler indikerer tilstedeværelse av lave mengder viral antigenfarging (B). Hele lungen ble veid ved obduksjon, og lungens bruttopatologi ble representert som en prosentandel av total dyrekroppsvekt (C). Minst 3 dyr per tidspunkt ble analysert. indikerer en p-verdi mindre<0.05 determined="" by="" anova="" comparing="" hamsters="" on="" the="" day's="" post-inoculation="" to="" baseline="" (day="" 0).="" error="" bars="" indicate="" +/-="" se.="" slides="" were="" visualized="" and="" imaged="" using="" the="" leica="" dmi100="" brightfield="" microscope="" and="" dmc5400="" 20="" mp="" color="" cmos="" camera.="" images="" were="" captured="" and="" 10x="" and="" 40x.="" the="" images="" shown="" are="" representative="" of="" 3="" animals="" per="" group,="" per="" time="">
For å kvantifisere betennelse og inflammatorisk celleinfiltrasjon samt ødem i lungen, ble vekten av lungene ved obduksjon analysert. Hele lungen ble veid ved obduksjon og et forhold til dyrets kroppsvekt ble beregnet og deretter uttrykt som en prosentandel (fig 4C). På dagene 0 og 2 pi var lungen mindre enn én prosent av hamsterens kroppsvekt . Dette økte til en betydelig topp på dag 5 med i underkant av 4 prosent av kroppsvekten i gjennomsnitt. Lungevekten gikk ned til 1 prosent og forble statistisk signifikant fra baseline gjennom det gjenværende tidsforløpet.
Vertsgenuttrykk og immunopatologisk profilering indikerer en uttalt inflammatorisk respons med stump type I interferon-signalering iluftveienekanal
Siden menneskelige data undersøkte systemiske cytokinnivåer i blodet, var vi interessert i å bestemme immunresponsene på infeksjonsstedet så vel som andre berørte organer. Vi undersøkte nivåene av type I interferonresponsrelatert (IFN(Interferon)-beta, STAT(signaltransducer og transkripsjonsaktivator)2,IRF (interferonregulatorisk faktor)1, IRF3 og TLR(Toll-like reseptor)3) ,type II interferonresponsrelatert (IFN-gamma,IRF2, STAT1, CXCL10),og medfødte/adaptive markører og mediatorer (CD3, CD4,CD8A, CD19,IL-2, TGF (transformerende vekstfaktor)-beta ,IL-21,IL-10,IL-4,IL-5,IL-5R,IL-13,IL-12 ,CD14,PKR, CCR3, CCL20, CCL22,IL-1beta, IL-6, TNF).
Menneskelige kliniske rapporter har indikert detSARS-CoV-2infeksjon fører til en dysregulering av interferonresponsen[14]. Vi undersøkte type I og I IFN-responsene ved å evaluere uttrykket av IFN-beta, STAT2, IRF1, IRF3 og TLR3 for type I-responsen og IFN-gamma, IRF2, STAT1 og CXCL10 for type II-responsen (fig5) . IFN-beta ble signifikant nedregulert i både neseturbinater og høyre kranialunge med størst inhibering på dag 2. Nedstrømsregulatorer av type I IFN-respons ble også redusert, inkludert STAT2 og IRF1 som nådde maksimal hemming senere i tidsforløpet, som samt IRF3 og TLR3 som ikke viste noen økning i genuttrykk. Vi undersøkte også type II IFN-responsen, så vel som gener hvis tilsvarende proteiner virker i begge IFN-veier. IFN-gamma, type II IFN, viste oppregulering i neseturbinater, og mest fremtredende i lungene (fig 5). I begge vev var det en økning til en topp etterfulgt av oppløsning etter dag 15 pi. Nasale turbinatnivåer av IFN-gamma toppet seg på dag 8 ved en foldendring på 12, mens nivåene i lungene toppet seg på dag 5 ved en foldendring på 17. Iluftveienevev, viste type I IFN-antagonist IRF2 signifikante økninger, med en topp på dag 8 i neseturbinatet og dag 2 i høyre kraniale lunge, ved fold-endringer på henholdsvis 24 og 25. Generelle IFN-responsmolekyler viste også signifikante økninger.STAT1 viste sterk oppregulering i begge vev på dag 2 og 5, mens CXCL10 toppet seg på dag 2 i neseturbinatene ved en fold-endring på nær 70. I lungen nådde CXCL10 en topp på dag 2 i neseturbinatene. dag 8 ved en fold-endring på 30, men løste seg ikke tilbake til baseline og forble signifikant økt i forhold til naive dyr på dag 12 og 15 pi. Fra disse dataene ser det ut til at mens type II IFN-responsen forblir intakt, hamstere inokulert medSARS-CoV-2vis en dysregulert type IIFN-respons iluftveienevev.
Fig 5. Genekspresjonsanalyse i respirasjonsvevet til SARS-Cov-2-infiserte hamstere avslører signifikant interferon-dysregulering med samtidig økning i inflammatoriske og immunmediatorer.qRT-PCR ble utført på RNA ekstrahert fra nasal turbinat og høyre kranial lungevev avSARS-CoV-2inokulerte hamstere. Prøver ble vurdert for type I interferonresponsrelatert (IFN-beta, STAT2, IRF1, IRF3, TLR3), type II interferonresponsrelatert (IFN-gamma, IRF2, STAT1, CXCL10) og medfødt/ adaptive mediatorer (CD3, CD4, CD8, CD19, IL-2, TGF-beta, IL-21, IL- 10, IL-4, IL-5, IL-5R, IL-13, IL-12, CD14, CCR3, PKR, CCL20, CCL22, IL-1beta, IL-6, TNF) ved å bruke primere spesifikke for hamstergener (tabell 1). Foldendring ble beregnet via ΔΔCt mot baseline (dag 0) med BACT som husholdningsgenet. Minst tre dyr ble analysert for hvert tidspunkt.
I tillegg vurderte vi også medfødt og adaptiv genregulering. Totalt sett ble disse genene oppregulert i både neseturbinater og høyre kraniale lunge, med neseturbinater som typisk viser høyere uttrykk (fig 5). De nasale turbinatene hadde topp genuttrykk av IL-2, TGF-beta, IL-21, IL-4, IL-5R, IL-13 og CCR3 på dag 5 pi, med det høyeste uttrykket som kom fra TGF-betal ved en fold-endring på 97, og IL-13 ved 45.IL-10-uttrykket toppet seg på dag 2 ved en fold-endring på 38, men forble oppregulert gjennom hele tidsforløpet, signifikant på dag 5 og 10. IL-5-ekspresjonen toppet seg på dag 12 med en fold-endring på 21. Innenfor lungen varierte det høyeste uttrykket per gen: TGF-betal, IL{ {25}} og IL-13 viste den høyeste oppreguleringen på dag 5; IL-10, IL-4 og IL-5 på dag 8; og IL-2 på dag 12.IL-4 og IL-13 viste størst oppregulering, ved 25 og 18 på deres respektive toppdager. T-cellespesifikke markører var høyest i neseturbinatene, med topp genekspresjon på dag 12 og forble høy på dag 15. Dette antyder en involvert T-cellerespons som ble ytterligere støttet av oppreguleringen av Th2-cytokiner (IL-4 , IL-5 og IL-13), cytokinene (vist tidligere IL-12 og IFN-gamma), samt T-regulatoriske og Th17-cytokiner (IL-10 og TGF-betal), som peker på en generell T-cellerespons påSARS-CoV-2infeksjon. Derfor utførte vi IHC for å bestemme tilstedeværelsen av CD3 pluss og CD20 pluss celler iluftveieneCD3 pluss-farging ble konsentrert til blodkar (røde piler) i det uinfiserte lungevevet uten farging i de alveolære rom. Tilstedeværelsen av CD3 pluss-celler (S3A Fig, svarte piler) økte i det alveolære rommet gjennom hele tidsforløpet og nådde maksimal farging på dag 8 etter inokulering og avtok deretter i intensitet ut i dag 15. CD20-farging ble ikke påvist i uinfisert vev. Små antall CD20 pluss-celler ble påvist på dag 2, 5 og 8 etter inokulering (S3B Fig, angitt med svarte piler) som avtok på dag 12 og 15 som indikert med grå piler.
Analyse av de inflammatoriske markørene i neseturbinatene indikerte signifikante forbigående økninger av alle inflammatoriske mål som forsvant etter dag 12 og 15.IL-1beta nådde maksimale nivåer på dag 2 pi ved en fold-endring på 4{{7 }} slektninger i dag 0uinfiserte dyr(fig 5).IL-6, IL-12 og TNF nådde toppdag 5 pi (fold-endringer på henholdsvis 66,20 og 26). Tilsvarende betydning finner du i S1-tabellen. I kontrast nådde disse transkripsjonene apex mellom dag 2 og 5, men med en lavere fold-endring sammenlignet med lungen. Både i neseturbinater og i lungene forble flere inflammatoriske cytokiner forhøyede sammenlignet med baseline frem til dag 12 pi. Samlet viste infeksjonsstedene en klar økning i inflammatoriske markører, spesielt IL-6 i neseturbinater og TNF i lungene.
