Echinacoside hemmer den ondartede progresjonen av brystkreft MCF-7-celler ved å modulere AKR1B10/ERK-signaltransduksjon

Sammendrag: Denne studien analyserer virkningen avechinacoside(ECH) i spredning, metastase og adriamycin (ADR) resistens avbrystkreft(BC) MCF{{0}}-celler via modulering av aldo-keto-reduktase familie 1 medlem 10 (AKR1B10)/ekstracellulær signalregulert kinase (ERK)-vei. Den kjemiske strukturen til ECH ble først bekreftet. MCF-7-celler ble behandlet med forskjellig konsentrasjon (0, 10, 20, 40 ug·mL-1) av ECH i 48 timer. Western blotting ble brukt til å analysere ekspresjon av AKR1B10/ERK-vei-assosierte proteiner og celletellesett-8 (CCK-8)-analyse for å bestemme cellelevedyktighet. MCF-7-celler ble samlet inn og klassifisert i kontrollgruppe, ECH-gruppe, ECH pluss Ov-NC-gruppe og ECH pluss OvAKR1B10-gruppe. Deretter ble Western blotting brukt for å analysere uttrykket av AKR1B10/ERK-vei-assosierte proteiner. CCK-8 og 5-ethynyl-2'-deoksyuridin (EdU)-analyse ble brukt for å undersøke celleproliferasjon. Cellemigrasjon ble vurdert med scratch-analyse, transwell-analyse og Western blotting. Til slutt ble MCF-7-celler behandlet med ADR i 48 timer for å indusere ADR-resistens. Cellelevedyktighet ble testet ved CCK-8-analyse og celleapoptose ble estimert basert på terminaldeoksynukleoitidyltransferase-mediert nick end-merking (TUNEL)-analyse og Western blotting. Basert på Protein Data Bank (PDB) og molekylær dokking, ble bindingsaffiniteten til ECH til AKR1B10 vurdert. Ulike doser ECH reduserte ekspresjonen av AKR1B10/ERK-vei-assosierte proteiner på en doseavhengig måte og reduserte cellelevedyktighet sammenlignet med kontrollgruppen. Sammenlignet med kontrollgruppen blokkerte 40 ug·mL-1 ECH AKR1B10/ERK-veien i MCF-7-celler og hemmet spredningen, metastasen og ADR-resistensen til cellene. Sammenlignet med ECH pluss Ov -NC-gruppen, viste ECH pluss Ov-AKR1B10-gruppen gjenoppretting av noen biologiske atferder til MCF-7-celler. ECH målrettet også AKR1B10. ECH kan hemme spredningen, metastasen og ADR-resistensen til BC-celler ved å blokkere AKR1B10/ERK-veien.

Nøkkelord:echinacoside; AKR1B10/ERK signalering; brystkreft; adriamycinresistens

Brystkreft (BC) er den desidert vanligste maligne sykdommen hos kvinner, med en median alder for diagnose på rundt 60 år [1]. Andelen nye tilfeller av BC i Kina utgjør 12,2 prosent av den globale andelen, og andelen BC-dødsfall i verden utgjør 9,6 prosent [2]. Genetiske og miljømessige faktorer som kosthold med høyt fettinnhold, alkoholinntak og utilstrekkelig fysisk aktivitet er risikofaktorer for brystkreft [3-4]. Moderne behandlinger inkluderer fortsatt kirurgi, strålebehandling og medikamentell behandling [1]. Vanlige kliniske legemidler inkluderer cyklofosfamid, 5-fluorouracil, pirarubicin, tamoxifencitrat, etc. [5], og eksistensen av medikamentresistens i BC-celler fører også til behandling av BC til en viss grad. stor utfordring [6]. Samtidig, som en heterogen svulst, er BC mer sannsynlig å metastasere til organer som bein, lunge, lever og hjerne, noe som gjør metastatisk brystkreft stort sett uhelbredelig [7]. Cistanche er et tradisjonelt medisinsk materiale i mitt land. Den tilhører plantefamilien og er kjent som "ørkenginseng"[8].Echinacoside(ECH) er et fenyletanoidglykosid ekstrahert fra Cistanche deserticola. Nyere studier har understreket detechinacosidehar sterke antioksidant-, anti-inflammatoriske og krefthemmende egenskaper. For eksempel, ved å hemme mTOR/STAT3-banen, kan ECH lindre den inflammatoriske responsen og oksidativt stress ved paracetamol-indusert leverskade [9]. Flere bevis har bekreftet at ECH hovedsakelig spiller en tumorundertrykkende rolle i BC, og dens mekanisme kan være relatert til nedregulering av uttrykket av miR-4306 og miR-4508 [10] eller blokkering av Wnt/-catenin signalering [11].

Aldo-keto-reduktase 1B10 (AKR1B10), et medlem av aldo-keto-reduktase-superfamilien, kan omdanne giftige stoffer til ikke-toksiske stoffer gjennom redoksreaksjoner og produsere tilsvarende alkoholer, og dermed utøve en beskyttende effekt på vertsceller [12]. Studier tyder på at AKR1B10 hovedsakelig kommer til uttrykk i normalt humant vev som tykktarm og tynntarm [13]. Flere studier viste at AKR1B10 hovedsakelig virker som et onkogen i brystkreft og kan bli en potensiell biomarkør for brystkreft [14-16]. Som et nøkkelmedlem i MAPK-familien kontrollerer ekstracellulære regulerte proteinkinaser (ERK) ulike evolusjonært konserverte cellulære prosesser i metazoer, og ERK-dysregulering kan føre til ulike sykdommer [17]. LI J et al [18] avslørte at AKR1B10 kan fremme brystkreftprogresjon ved å aktivere ERK-signalering. Mer interessant, SwissTargetPrediction-nettstedet spådde AKR1B10 som et potensielt mål for echinacea. Imidlertid er det ukjent om ECH er involvert i brystkreftprogresjon ved å formidle AKR1B10/ERK-signalering.

Denne studien fokuserte på å utforske de spesifikke effektene av ECH på fenotypen til BC-maligne celler og belyse forholdet mellom ECH og AKR1B10/ERK-veien i BC-celler.

1 materiale

Human normal brystepitelcellelinje MCF-10A og human brystkreftcellelinje MCF-7 ble levert av Cell Resource Center ved Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences; MCF-7 ADR-resistente celler ble kjøpt fra Shanghai Huzhen Industrial Co., Ltd. DMEM/F1-medium (batchnummer PM150310), hesteserum (batchnummer 164215) og føtalt bovint serum (batchnummer 164210) ble kjøpt fra Wuhan Proceeds Life Technology Co., Ltd.; ECH (batchnummer 07668) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich, USA; ADR (partinummer KGA8181) ble kjøpt fra Jiangsu Kaiji Biotechnology Co., Ltd.; RIPA lyseringsløsning (partinummer R0020) ble kjøpt fra Beijing Soleibao Technology Co., Ltd.; BCA-protein kvantitativt reagens (partinummer CX0013S) ble kjøpt fra Kangwei Century Biotechnology Co., Ltd.; CCK-8-reagens (batchnummer C0037) ble kjøpt fra Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.; Lipofectamine 2000 transfeksjonsreagens (batchnummer 11668019) ble kjøpt fra Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.

Ov-AKR1B10 og Ov-NC plasmider ble levert av Chongqing Youbao Biotechnology Co., Ltd.; EdU-reagens (partinummer C00003) og TUNEL-sett (partinummer C11026-1) ble kjøpt fra Guangzhou Ribo Biotechnology Co., Ltd.; DAPI (partinummer 40727ES10) ble kjøpt fra Guangzhou Ribo Biotechnology Co., Ltd. fra Shanghai Yisheng Biotechnology Co., Ltd.; Matrigel (parti nr. 354230) og transbrønnkammer (parti nr. 3450) ble kjøpt fra Corning Company, USA; Paraformaldehyd (Lot No. 158127), Crystal Violet (Lot No. C0775) og Triton X-100 løsning (Lot No. T8787) ble levert av Sigma Company i USA; kanin AKR1B10 (batchnummer ab192865), fosforylert ERK1/2 (p-ERK1/2, batchnummer ab278538), ERK1/2 (batchnummer ab184699), E-cadherin (E-cadherin, Lot ab212059), (N-cadherin), (N-cadherin) -cadherin, parti ab76011), snegl (parti ab216347), B-cellelymfom-2 (Bcl-2, parti ab182858), Bcl-2-relatert X-protein (Bcl-2- assosiert X, Bax, batchnummer ab182733) antistoff og HPR-merket geit-anti-kanin sekundært antistoff (batchnummer ab6702) ble kjøpt fra Abcam, USA; ECL luminescenssett (batchnummer SL1350) ble kjøpt fra Beijing Cool Lamb Technology Co., Ltd. Image-Pro Plus-programvare ble kjøpt fra Media Cybernetics, USA; Leica DM1000 fluorescensmikroskop og Leica DM ILLED invertert mikroskop ble kjøpt fra Leica Microsystems, Tyskland; SPSS 22.0-programvare ble kjøpt fra IBM, USA.

2 metoder

2.1 Cellekultur og håndtering

MCF{{0}}A-celler ble dyrket i DMEM/F12 som inneholdt 5 prosent hesteserum, 20 ng·mL-1 epidermal vekstfaktor, 0,5 ug·mL-1 kortisol, 10 ng ·mL-1 insulin, 100 ng·mL-1 koleratoksinkulturmedium; MCF-7 og MCF-7/ADR-celler var

Dyrket i DMEM/F12-medium med 10 prosent FBS. Alle medier ble supplert med 1 prosent dobbelt antistoff og lagret ved 37 grader i en fuktet atmosfære med 5 prosent CO2. Deretter ble MCF-7-celler intervenert med ECH ved forskjellige konsentrasjoner (0, 10, 20, 40 ug·mL-1) i 48 timer; og 1,0 mg·L-1 ADR ble brukt for å opprettholde legemiddelresistensen til MCF-7/ADR-celler. kjønn. 2.2 Western blot-metode Proteinet i MCF-7-celler ble ekstrahert med RIPA-lysat, og proteinkonsentrasjonen ble bestemt med BCA-reagens. Proteiner separert med 10 prosent SDS-PAGE ble overført ved bruk av PVDF-membran; etter blokkering med 5 prosent skummet melk i 2 timer ved romtemperatur, var membranen /10 000), E-cadherin (1/10 000), N-cadherin (1/5 000) , Snegl (1/1 000), Bcl-2 (1/1 000), Bax (1/1 000) Det primære antistoffet ble inkubert over natten ved 4 grader, etterfulgt av tilsetning av HPR-merket geit-anti-kanin sekundært antistoff (1/2 000) i 1 time ved romtemperatur. Målproteinet ble oppdaget ved å legge til ECL-luminescenssett, og proteinoverfloden ble analysert med Image-Pro Plus-programvare.

Rik på Echinacoside Cistanche Coffee for behandling av brystkreft

2.3 CCK-8-analyse for cellelevedyktighet

MCF{{0}}A- og MCF-7-celler ble sådd i 96-brønnplater for dyrking (5×103 celler/brønn), og etter 24 timer , ble forskjellige konsentrasjoner (0, 10, 20, 40 ug·mL-1) av ECH påført. Etter intervensjon, 48 timer senere, ble de behandlet med 10 prosent volumfraksjon av CCK-8-reagens og celle levedyktighet ble oppdaget 2 timer senere. For ytterligere å utforske effekten av ECH på levedyktigheten til MCF-7-celler, ble transfekterte eller utransfekterte MCF-7-celler dyrket i 24 timer, og forskjellige konsentrasjoner (0, 10, 20, 40 ug· mL-1) av ECH ble brukt til intervensjon. 10 prosent volumfraksjon av CCK-8-reagens ble tilsatt ved henholdsvis 24, 48 og 72 timer, og celleviabilitetsdeteksjonsmetoden var den samme som ovenfor. For å utforske effekten av ECH på doksorubicinresistens til MCF-7-celler, ble MCF-7/ADR-resistente celler dyrket sammen med ECH i 48 timer, og deretter ble CCK-8-arbeidsløsningen lagt til for å oppdage cellelevedyktighet.

2.4 Plasmidtransfeksjon

MCF-7-celler ble sådd og dyrket i 6-brønnplater (5×104/brønn). Da cellene nådde 60 prosent ~70 prosent konfluens, ble Ov-AKR1B10 og Ov-NC transient transfektert i streng overensstemmelse med instruksjonene til Lipofectamine 2000 transfeksjonsreagens. Cellene i hver gruppe ble transfektert, og transfeksjonen ble fullført etter 48 timer.

2.5 EdU-farging for å oppdage celleproliferasjon

Etter at MCF{0}}-celler ble behandlet med ECH og transfektert med plasmider, ble 20 µmol·L-1 EdU tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 grader i 2 timer. Deretter ble celler fiksert og permeabilisert med henholdsvis 4 prosent paraformaldehyd og 0,5 prosent Triton X-100. Til slutt ble de EdU-positive cellene farget med DAPI påvist under et fluorescensmikroskop.

2.6 Sårhelingsanalyse for å oppdage cellemigrasjon

MCF{{0}}-celler i log-fase av vekst ble lagt til 6-brønnplater, og når cellene nådde 90 prosent sammenløp, bruk en 200 µL steril pipettespiss for å lage en strek og vask 3 ganger med PBS. Sårbredden ble målt ved 0 og 48 timer under et invertert mikroskop, og antall overførte celler ble bestemt.

2.7 Transwell-analyse for å oppdage celleinvasjon

De ECH-behandlede og plasmid-transfekterte MCF-7-cellene ble sådd i det øvre kammeret i en transbrønn inneholdende Matrigel, og 500 µL DMEM-medium inneholdende 10 prosent FBS ble tilsatt til det nedre kammeret i transbrønnen. Etter 24 timer ble overflatecellene tørket av med bomullspinner, og cellene ble fikset og farget med henholdsvis paraformaldehyd og krystallfiolett, og de invasive cellene ble talt under et mikroskop.

2.8 TUNEL-farging for å oppdage apoptose

Etter intervensjon med 15 µmol L-1 ADR, ble ECH-behandlede og plasmidtransfekterte MCF-7/ADR-resistente celler sådd i 96-brønnplater og fiksert med 4 prosent paraformaldehyd og {{ 8}},5 prosent Triton X-100 Etter permeabiliseringsbehandlingen ble TUNEL-deteksjonsløsningen tilsatt, og reaksjonen ble utført ved 37 grader i 45 minutter under veiledning av setteinstruksjonene, og DAPI-cellekjerner ble farget . Fem synsfelt ble tilfeldig valgt for å observere celleapoptose under et fluorescensmikroskop.

2.9 Molekylær dokking

Den tredimensjonale strukturen til AKR1B10-protein (PDB ID: 1ZUA) ble hentet fra PDB-databasen (https://www.rcsb.org/). Bruk PyMOL 2.2.0-programvare for å fjerne vann fra aktive ingredienser og fjerne irrelevante originale ligander, konverter deretter den kjemiske strukturen til ECH til mol2-format med OpenBabel 2.2.1-programvare (http://openbabel.org/wiki), og bruk til slutt Autodock 4.2 utfører molekylær dokking og velger posituren med lavest fri energi (-10.8 kcal·mol-1) for visualisering.

2.10 Statistisk analyse

I denne studien ble SPSS 22.0-programvare brukt til å analysere og behandle eksperimentelle data og uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (x ± s). Enveis variansanalyse ble brukt for sammenligning mellom grupper. Når P<0.05, the difference was statistically significant.

3 resultater

3.1 ECH hemmer AKR1B10/ERK-signalering i MCF-7-celler. For det første viste resultatene av Western blotting at med økningen av ECH-eksponeringsdosen, proteinnivåene til AKR1B10 og pERK1/2/ERK1/2 i MCF{{11 }} celler redusert, og den nedadgående trenden var doseavhengig P<0.001) (Fig. 1). It can be speculated that ECH may participate in the malignant progression of BC by regulating AKR1B10/ERK signaling.

Fig.1 Effekt avechinacosidepå AKR1B10/ERK-signaltransduksjon i MCF-7-celler (x̄  s, n=3)

3.2 Overekspresjon av AKR1B10 reverserte den hemmende effekten av ECH på MCF-7 celleproliferasjon

De eksperimentelle dataene til CCK{{0}} viste at, sammenlignet med MCF-10A normale celler, eksponering for forskjellige konsentrasjoner av ECH (0, 10, 20, 40 ug·mL{{6} }) resulterte i en konsentrasjonsavhengig reduksjon i aktiviteten til MCF-7 kreftceller (P< 0.05), and when the mass concentration of ECH was 40 μg·mL-1, the cell activity decreased most significantly, so 40 μg·mL-1 ECH was used for subsequent experiments. To further verify whether ECH regulates BC development by regulating AKR1B10/ERK signaling, MCF-7 cells were first transfected with the Ov-AKR1B10 plasmid. After transfection of Ov-AKR1B10, the expression level of AKR1B10 was significantly increased (P<0.001). Western blotting results showed that transfection of Ov-AKR1B10 plasmid induced ECH exposure-induced reduced AKR1B10 and p-ERK1/2 protein levels again increased (P<0.001). In addition, the experimental data of CCK-8 and EdU demonstrated that the inhibitory effect of ECH treatment on the proliferation of MCF-7 cells could be alleviated by the up-regulation of AKR1B10 (P<0.05) (Fig. 2). Thus, overexpression of AKR1B10 rescued the inhibitory effect of ECH on the proliferative capacity of BC cells.

Fig.2 Effekt av echinosid på proliferasjonen av MCF-7-celler ved å regulere AKR1B10-ekspresjon (fluorescensfarging, ×200; x̄  s, n=3)

3.3 Overekspresjon av AKR1B10 reverserte den hemmende effekten av ECH på MCF-7-cellemigrasjon. På samme måte, sammenlignet med kontrollgruppen, resulterte ECH-administrasjon i en signifikant reduksjon i antall cellemigrasjon og invasjon (P<0.001); In contrast, increased expression of AKR1B10 resulted in enhanced cell migration and invasion (P<0.05). In addition, compared with the control group, the protein levels of N-cadherin and Snail were significantly decreased after ECH treatment, while the level of E-cadherin was significantly increased (P<0.001); The protein levels of cadherin and Snail increased, while the level of E-cadherin decreased (P<0.001) (Fig. 3). In conclusion, up-regulation of AKR1B10 expression rescued the inhibitory effect of ECH administration on BC cell migration and invasion.

Fig.4 Effekt av echinosid på ADR-resistens av MCF-7-celler ved å regulere AKR1B10-ekspresjon (fluorescensfarging, ×200; x̄  s, n=3)

4. Diskusjon

Brystkreft refererer til ukontrollert spredning av brystepitelceller under påvirkning av ulike kreftfremkallende faktorer, og det er også hovedårsaken til kreftdød hos kvinner [1]. Tumormetastaser er en av de mest truende egenskapene til svulster, og det er også grunnårsaken til langsiktig helbredelse av svulster [19]. Kjemoterapi er en vanlig metode for klinisk behandling av brystkreft [20]. Med kontinuerlig fremgang og oppdatering av brystkreftbehandlingsmetoder og konsepter, har prognosen for brystkreft blitt betydelig forbedret [20]. Imidlertid begrenser fremveksten av medikamentresistens i stor grad den kliniske effektiviteten til legemidler [21]. Studier har funnet at rundt 90 prosent av metastaserende brystkreftpasienter og 50 prosent av avanserte brystkreftpasienter vil utvikle medikamentresistens [22]. ADR er et antracyklinantibiotikum som er mye brukt i klinisk behandling av metastatisk eller tilbakevendende brystkreft ved å virke på den kjemiske strukturen til DNA, og som effektivt kan redusere tilbakefallsfrekvensen og dødeligheten hos brystkreftpasienter [23]. Derfor fokuserte denne studien på spredning, metastase og ADR-resistens til BC-celler, for å avdekke den regulatoriske mekanismen for BC-progresjon og søke etter potensielle molekylære mål for intervensjon.

Echinacea er en fenyletanoidforbindelse avledet fra jordstengler av naturlige urter Cistanche deserticola og Echinacea purpurea. Den har forskjellige farmakologiske effekter som antioksidant, antidepressiv, antiinflammatorisk, antiviral, antitumor og antibakteriell [24-25]. Nyere studier har rapportert at ECH kan hemme spredning, metastase og angiogenese av eggstokkreftceller ved å regulere PI3K/Akt-veien [26]; ECH kan utøve sin antikreftaktivitet i leverkreft ved å aktivere TGF-1/Smad-banen [27]. ECH kan hindre BC-svulstvekst ved å inaktivere Wnt/-catenin-signalveien [11]. I denne studien ble AKR1B10 først spådd å være et potensielt mål for ECH av SwissTargetPrediction. Derfor spekulerer forfatterne i at ECH kan delta i BC sykdomsprogresjon ved å regulere AKR1B{11}}relaterte signalveier. Til nå har det blitt funnet at AKR1B10 er økt i uttrykk i ulike kreftformer og spiller en rolle i å fremme kreft [28]. I tillegg kan AKR1B10 forverre utviklingen av blærekreft, lungeadenokarsinom og BC ved å aktivere ERK-signalering [18, 29-30]. Ektopisk ekspresjon av AKR1B10 i brystkreftceller fremmer fosforyleringen av ERK 1/2 for å aktivere ERK-signalveien [18]. ERK-signalveien fremmer nedbrytningen av ekstracellulær matrise ved å aktivere MMP-er, spesielt MMP2, og fremmer derved tumorcelleinvasjon og tumormetastase [31-33]. Resultatene av dette eksperimentet viste også at ekspresjonen av AKR1B10/ERK-relaterte proteiner avtok på en doseavhengig måte etter behandling med forskjellige konsentrasjoner av ECH, noe som indikerer at ECH kan delta i reguleringsmekanismen til BC ved å hemme AKR1B10/ERK vei. I tillegg resulterte ECH-eksponering også i varierende grad av reduksjon i BC-cellenes levedyktighet. For ytterligere å bevise dette poenget transfekterte denne studien AKR1B10-overekspresjonsplasmid inn i MCF-7 BC-celler og fant at de hemmende effektene av ECH-behandling på AKR1B10/ERK-vei og celleproliferasjon, migrasjon og invasjon og epitel-mesenkymal overgang ble overuttrykt av AKR1B10 reddet. Videre, i MCF-7/ADR-resistente celler, resulterte ECH-eksponering i en reduksjon i IC50 og en økning i antall apoptotiske celler; mens overekspresjon av AKR1B10 i denne innstillingen igjen økte IC50 og reduserte apoptotisk celleproduksjon. På slutten av eksperimentet ble målrettingsforholdet mellom ECH og AKR1B10 også fullstendig verifisert. De eksperimentelle resultatene ovenfor viser at,

AKR1B10-overuttrykk oppnår en antagonistisk effekt på ECH-undertrykt BC-utvikling.

Som konklusjon kan ECH-administrasjon dempe spredningen, migrasjonen, invasjonen, EMT- og ADR-resistensen til BC-celler, og mekanismen kan være relatert til målretting av AKR1B10 og inhibering av AKR1B10/ERK-signalveien. Denne studien klargjorde først den potensielle mekanismen til ECH i BC, og ga verdifullt eksperimentelt grunnlag og teoretisk støtte for anvendelsen av ECH i anti-BC-medisiner. Det er imidlertid fortsatt noen mangler ved denne studien. For det første involverte ikke dette eksperimentet analysen av virkningen av ECH på overlevelsesraten og prognosen til BC-pasienter; for det andre manglet denne studien in vivo dyreforsøk for ytterligere å verifisere rollen til ECH i veksten av BC-svulster. I fremtidige studier vil den kliniske betydningen av ECH i brystkreftbehandling bli ytterligere utforsket.

Brukerstøtte:

wallence.suen@wecistanche.com 0015292862950