Effekt av Cistanche Tubulosa-ekstrakter på mannlig reproduksjonsfunksjon hos streptozotocin-nikotinamid-induserte diabetesrotter-Ⅰ

1. Introduksjon

Diabetes mellitus (DM) er en tilstand der det er øktglukosenivåeri blodet på grunn av bukspyttkjertelens ineffektivitet i å produsere nok insulin, eller kroppens manglende evne til å bruke det effektivt. Ifølge WHO økte antallet personer med diabetes fra 108 millioner i 1980 til 422 millioner i 2014 [1]. Det er fire hovedkategorier: pre-diabetes (et stadium før diabetes), type 1 (hvor bukspyttkjertelen ikke klarer å produsere insulin), type 2 (kroppen ikke bruker insulin) og svangerskapsdiabetes (som oppstår under graviditet). Oksidativt stress oppstår på grunn av ubalansen mellom produksjonen av reaktive oksygenarter (ROS) og antioksidanter [2] som til slutt fører til diabetisk tilstand. Komplikasjonene til diabetes inkluderer nyresvikt, nerveskade, blindhet, hjerneslag, hjerteinfarkt, fosterdød og infertilitet. [1]. Studier viser at spermkjerner, deoksyribonukleinsyre (DNA) og mitokondrier ble betydelig skadet hos mannlige diabetespasienter [3]. Oksidativt stress under transport av sæd vil endre prosessen i det mannlige reproduktive systemet [4,5].

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBEDRING AV SEKSUELL FUNKSJON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Prosessen med spermatogenese kontrolleres av hypothalamus-hypofyse-gonadal (HPG) aksen. Det gonadotropinfrigjørende hormonet (GnRH) produsert av hypothalamus stimulerer produksjonen av luteiniserende hormon (LH) og follikkelstimulerende hormon (FSH). Leydig-celler finnes ved siden av sædrøret ogprodusere testosteronunder kontroll av LH. FSH utløser produksjonen av antigenbindende protein (ABP) som hjelper til med å passere det mannlige hormonet. Infertilitet og andre problemer oppstår således hovedsakelig på grunn av forstyrrelsene som oppstår i HPG-aksen. Administrering av kombinasjonen av streptozotocin-nikotinamid induserer diabetes hos eksperimentelle rotter. Streptozotocin er en kjemisk forbindelse som er giftig for insulinproduserende celler i bukspyttkjertelen og nikotinamid er et vannløselig vitamin som beskytter cellene mot fullstendig skade [6].

Cistanche tubulosa er en ørkenplanteart også kjent som "Rou Cong-Rong" [7]. Det er en ikke-klorofyllisk parasittisk plante som vokser hovedsakelig på roten til Calotropis procera-treet og er vidt distribuert i det tørre landet Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mongolia, Iran og India. Det vanlige navnet på Cistanche tubulosa er "Desert Hyacinth". Det er allment akseptert i kinesisk tradisjonell medisin og har fått navnet "ørkenens ginseng". Det er mye brukt i det medisinske feltet for å behandle sykelig leukoré, kraftig metroragi, kroniske nyresykdommer, forstoppelse, impotens og infertilitet. Kjemiske bestanddeler avCistanche tubulosa består av ikke-flyktige fenyletanoidglykosider(PHG), iridoider, lignaner, flyktige oljer, alditoler, oligosakkarider og polysakkarider [8]. Studier viser detechinacosidefra denne urten beskytter den skadede fibroblasten ved å regulere ROS-nivåer [9]. Denne forbindelsen produserer antioksidanter, vasorelaksasjon og antiinflammatoriske aktiviteter sammen med nevrobeskyttelse og osteoporoseforebygging [10,11].

Denne studien hadde som mål å undersøke effekten avCistanche tubulosa ekstraktsom inneholder ECH på reproduktiv dysfunksjon av streptozotocin-nikotinamid-indusert diabetisk rotte.

2. Materialer og metoder

2.1. Materialer

ECH og CTE ble kjøpt fra Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan). Avanserte glykeringssluttprodukter (AGEs) ble kjøpt fra Biovision (San Francisco, CA, USA). LC-540- og TM3-cellelinjer ble kjøpt fra Food Industry Research and Development Institute (Hsinchu, Taiwan). Fem uker gamle Sprague-Dawley (SD) hannrotter ble kjøpt fra National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Feed Lab Diet® ble kjøpt fra PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan). 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Metanol og 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) ble også kjøpt fra Sigma. Dulbeccos modifiserte Eagle medium/F12 og trypsin-EDTA ble oppnådd fra GIBCO (New York, NY, USA). 3-(4, 5-dimetyltiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), diklor-dihydro-fluoresceindiacetat (DCFH-DA), dimetylsulfoksid (DMSO) og nitroblått tetrazolium (NBT) ble kjøpt fra Sigma. Enzymatiske glukosesett ble oppnådd fra Kyokutoseiyaku, Tokyo, Japan. Insulin ELISA-sett ble kjøpt fra Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Sverige). T-PER vevsproteinekstraksjonsreagens ble anskaffet fra Thermo Scientific (Chicago, IL, USA). Anti-human/mus/rotte nukleær faktor-kappa B NF-KB polyklonale antistoffer ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA. Anti-mus/rotte-reseptor for avanserte glycation end products (RAGE) polyklonale antistoffer, anti-human/mus/rotte StAR polyklonale antistoffer og anti-human/mus/rotte cytokrom P450 17A1 monoklonale antistoffer ble kjøpt fra Gene Tex (Irvine, CA, USA). Anti-menneske/mus/rotte CYP11A1 polyklonale antistoffer ble oppnådd fra Cell Signaling Technology (Beverly, PA, USA). Easy-Blue reagens ble kjøpt fra Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA). Agarose og DNA-markør 100 bp ble oppnådd fra Promega, Corporation (Madison, WI, USA). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit ble kjøpt fra QIAGEN, Hilden, Tyskland.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBEDRING AV SEKSUELL FUNKSJON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. Metoder

2.2.1. In vitro analyse

LC{{0}} og TM3 cellekultur: LC-540 cellelinjene ble dyrket ved 37 ◦C i Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) medium supplert med natriumbikarbonat (1,5 g/L), L-glutamin (2 mM), ikke-essensielle aminosyrer (0,1 mM), natriumpyruvat (1,0 mM) og føtalt bovint serum (FBS) (10 %) i en 5 % CO2-inkubator (CO2-inkubator, Napco 5410, Taiwan). TM3-cellelinjen ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med glukose (4,5 g/l), natriumpyruvat (0,5 mM), L-glutamin (2,5 mM), natriumbikarbonat (1,2 g/l), {{ 28}}(2-hydroksyetyl)-1-piperazinetansulfonsyre (HEPES, 15 mM), og føtalt kalveserum (FCS, 10 %) eller hesteserum (5 %) ved 37 ◦C i en 5 % CO2 inkubator.

Bestemmelse av cellelevedyktigheten tilEchinacoside (ECH): 3-(4, 5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromid (MTT)-reagens ble brukt for cellelevedyktighetsanalyse. Cellekonsentrasjonen ble justert til 2 × 105 celler/ml i en 96-brønnplate. Deretter ble 20 µL ECH (fortynnet i 2 % medium) tilsatt og inkubert i 24 timer ved 37 ◦C i en 5 % CO2-inkubator. Senere ble 100 µL MTT-reagens tilsatt og inkubert i 4 timer ved 37 ◦C under mørke forhold. Absorbansen ble målt ved 570 nm (ELISA-leser, Dynatech MR5000, Kloten, Sveits).

Relativ cellelevedyktighet (%)=[(En prøve ved 570 nm − Ablank ved 570 nm)]/[(Akontroll ved 570 − Ablank ved 570)] × 100.

Nitroblue Tetrazolium (NBT) reduksjonsanalyse og 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) analyse: Antall celler ble justert til 1× 1{{10}}6 celler/ ml. Deretter ble 50 mg/ml ECH, resveratrol (RES) og avanserte glykeringssluttprodukter (AGEs) (kontroll) tilsatt og samdyrket i 18 timer ved 37 ◦C. Deretter ble 0,3 mL NBT-løsning (0,1 mg/ml NBT, 5 % FBS og 3 % dimetylsulfoksid (DMSO) oppløst i 10 mL DMEM) tilsatt og inkubert ved 37 ◦C i 5 % CO2 i 1 time. Etter sentrifugering (ved 800 x g i 3 minutter) ble supernatanten fjernet og 200 µL DMSO ble tilsatt og ristet i 5 minutter i en ultralydsoscillator (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taiwan). Absorbansen ble målt ved 630 nm. For DPPH radikalanalyse ble Trolox (i 95 % alkohol) tatt som standard. Deretter ble 75 µL 0,5 mM DPPH-løsning blandet med 25 µL prøver og fikk reagere ved romtemperatur på et mørkt sted i 30 minutter. Blandingen ble ristet og absorbansen ble målt ved 517 nm.

Innholdsanalyse av reaktive oksygenarter (ROS): Celletallet ble justert til 2 × 105 celler/ml i en 12-brønnplate som inneholdt 2 % FBS. Deretter ble 50 µL/mL ECH, RES og AGEs tilsatt til platen og inkubert ved 37 ◦C i 24 timer. Etter 24 timer ble 20,70 -diklorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) tilsatt og inkubert ved 37 ◦C i 30 minutter. Etter sentrifugering (400 x g, 5 min) ble supernatanten fjernet og cellene ble vasket to ganger med fosfatbufret saltvann (PBS). Deretter ble cellene suspendert i 1 mL PBS og nivåene av ROS ble bestemt ved å bruke et flowcytometer (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, USA).

Identifikasjon og kvantitativ analyse av protein: Proteiner ble ekstrahert ved å bruke et proteinekstraksjonsreagens (T-PER). Celletettheten ble justert til 2 × 105 celler/ml i en 12-brønnplate og 50 µL/mL ECH, RES og en reseptor for den avanserte glykeringssluttprodukt-antagonisten (RAGE), og AGE ble tilsatt og inkubert ved 37 ◦C i en 5 % CO2-inkubator i 24 timer. Deretter ble 400 µL T-PER tilsatt, skrapet av cellene og sentrifugert ved 125,000× g i 20 minutter (4 ◦C). Supernatanten ble samlet og lagret ved -80 ◦C (-80 ◦C fryser, Nuaire, Plymouth, MN, USA) for videre analyse. Et bicinchoninsyre (BCA)-sett ble brukt for proteinkvantifisering. Deretter ble 10 µL standard celleløsning og 200 µL BCA-reagens tilsatt 8-brønnplater og inkubert ved 37 ◦C i en 5 % CO2-inkubator i 30 minutter. Absorbansen ble målt ved 562 nm. Proteinidentifikasjonsanalyse ble utført ved natriumdodecylsulfat (SDS)-polyakrylamidgel (SDS-PAGE) elektroforese. Prøver ble fremstilt ved å tilsette proteinlysat til en proteinbelastningsbuffer og western blot-analyse ble utført for å påvise de spesifikke proteinene.

2.2.2. In vivo analyse

Dyremodelldesign: Seksti {{0}}uker gamle Sprague–Dawley (SD) hannrotter ble kjøpt fra National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Hver rotte ble plassert individuelt i desinfiserende bur av rustfritt stål under kontrollert temperatur (23 ± 1 ◦C) og fuktighet (40–60 %) med en 12 timers lys/12 timers mørk syklus. Mat og vann ble gitt ad libitum. Hver rotte ble domestisert den første uken og gitt laboratoriegnagerdiett 5001 som hoveddiett. Alle prosedyrer fulgte standarden til Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-godkjenning nr. 101026) ved National Taiwan Ocean University, Taiwan. Etter domestisering ble rottene delt inn i to grupper: kontrollgruppen (Con) som ble matet med laboratoriediett 5001, og diabetikergruppen som ble matet med fettrik diett (HFD, 40%) for hele forsøket. Etter å ha blitt fôret med HFD i 4 uker, ble rottene i diabetikergruppen injisert med streptozotocin (65 mg/kg) (STZ) for å indusere diabetes mellitus (DM). Innen 15 minutter etter injeksjon av STZ ble nikotinamid (230 mg/kg kroppsvekt) injisert. En uke etter injeksjon ble det utført en oral glukosetoleransetest (OGTT) for å bestemme vellykket induksjon av diabetisk mellitus (DM). Deretter ble dyrene delt inn i seks grupper: kontrollen (matet med laboratoriediett 5001); DM-gruppe (DM + 45 % HFD); DMR-gruppe (DM + rosiglitazon: 0,571 mg/kg kroppsvekt) + 45% HFD; DME1-gruppe (DM + CTE: 80 mg/kg kroppsvekt) + 45% HFD; DME2-gruppe (DM + CTE: 160 mg/kg kroppsvekt) + 45 % HFD; og DME4-gruppe (DM + CTE: 320 mg/kg kroppsvekt) + 45 % HFD. Rosiglitazon (RSG) ble tatt som positiv kontroll. Tre doser CTE (80, 160 og 320 mg/kg) ble brukt i henhold til anbefalingen fra Taiwan Food and Drug Administration (TFDA) retningslinjer for funksjonell evaluering av helsekost. Behandlinger ble gitt til slutten av eksperimentet. Alle forsøksrottene ble avlivet etter 6 uker. Blodet samlet fra rottene ble sentrifugert ved 3000 rpm i 15 minutter ved 4 ◦C. Supernatanten ble undersøkt for følgende analyse:

Bestemmelse av total glukose, triglyserid og kolesterol: Glukosebestemmelsen ble utført ved hjelp av enzymsett for glukose. Deretter ble 20 µL blodplasmaprøver tilsatt til reagensene og holdt ved 37 ◦C i 5 minutter. De totale triglyseridene og den totale kolesterolkonsentrasjonen ble bestemt ved å bruke triglyserid- og kolesterolenzymatiske sett. Deretter ble 10 µL blodplasma tilsatt til reagensene og eksperimentet ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Absorbansen ble målt ved 510 nm.

Totalt plasmaglukose/triglyserid/kolesterol (mg/dL)=(Aprøve − ABlank)/(Astandard − ABlank) × 200.

Eksempel: Absorbans av blodprøver, ABlank: Absorbansverdi for sett uten prøve, Astandard: Absorbansverdi for standardreagens, 200: standardreagenser ved en konsentrasjon på 200 mg/dL.

Bestemmelse av insulin, leptin og homeostatisk modell – insulinresistens (HOMA-IR):Insulinnivået ble bestemt av insulin ELISA-sett. Her, 25µL blodplasma ble tilsattreagenser, og absorbansen ble målt ved 450 nm. Totalt leptininnhold ble bestemt ved å bruke enleptin enzym immunometrisk analysesett.Så 100µL plasma ble analysert og absorbansenble målt ved 450 nm ved bruk av en ELISA-leser. Hele forsøket ble utført ihtprodusentens instruksjoner. HOMA-IR-verdien ble bestemt fra homeostase-modellenvurderingsligning=Fastende plasmainsulinkonsentrasjon (mg/ml)× fastende plasmaglukosekonsentrasjoner (mmol/L)/22,5.

Plasmalipidperoksidasjon: Her ble {{0}},5 mL blodplasma blandet med 1 mL reagens (15 %, w/v trikloreddiksyre i 0,25 N saltsyre (HCl) ) og 0,375 %, w/v tiobarbitursyre i 0,25 N HCl) og plassert i et vannbad (Water Bath, BUCHI 461, Zürich, Sveits) ved 100 ◦C i 15 min. Etter avkjøling ble 1 ml n-butanol tilsatt, ristet kraftig og sentrifugert ved 1500 x g i 10 minutter. Supernatanten ble samlet og absorbansen ble målt ved 532 nm [12].

Malondialdehyd (MDA) konsentrasjon (nM/mL)=[(En prøve ved 532 nm − Ablank ved 532 nm)/ (En standard ved 532 nm − Ablank ved 532 nm)] × 5.

standard ved 532 nm − Ablank ved 532 nm)] × 5. Bestemmelse av plasmanivåer av testosteron og luteiniserende hormon (LH): Testosteron ELISA-settet ble brukt til å måle nivået av testosteron i blodplasmaet. RIA-sett ble brukt for å bestemme LH-konsentrasjonen. Deretter ble 50 µL plasma tilsatt og beregningene ble basert på konsentrasjonen av hormonet LH-RP-3 (standard). De videre trinnene ble utført i henhold til produsentens instruksjoner.

Bestemmelse av tumornekrosefaktor (TNF)- og interleukin-6 (IL-6) konsentrasjon: Det fangede antistoffet ble fortynnet 250 ganger i beleggbuffer, lagt til en 96- brønnplate (100 µL/brønn), og holdt ved 4 ◦C over natten. Supernatanten ble aspirert og vasket fem ganger med vaskebuffer (1 gang PBS, 0,05 % Tween 20). Etter inkubering (1 time) med 200 µg analysefortynningsmiddel, ble cellene vasket 5 ganger med vaskebuffer og 100 µL TNF-standardløsning eller testprøver ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 2 timer. Etter vasking ble 100 µL IL-6-detekterte antistoffer tilsatt og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Supernatanten ble aspirert og vasket 5 ganger. Deretter ble 480 µL enzym avidin-pepperrotperoksidase (HRP) tilsatt og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Supernatanten ble aspirert og vasket fem ganger med en vaskebuffer. Deretter ble 100 µL substratløsning tilsatt og inkubert i 15 minutter ved romtemperatur. Senere ble 50 µL stoppløsning (1 M fosforsyre) tilsatt til hver brønn og absorbansen ble målt ved 450 nm.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FOR REPARERING AV SEKSUELL FUNKSJON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analyse av sperm- og testisparametre

Spermprøvetaking: Spermprøvetakingen ble utført i henhold til metoden tidligere rapportert i [13]. Spermiene ble samlet fra supernatanten og brukt for videre analyse.

Antall sædceller, spermmotilitet og unormal sperm: Antall sædceller ble beregnet ved å bruke hemocytometeret og trypanblått løsning. Deretter ble 100 µL sædvæske blandet med trypanblått løsning og antall sædceller, bevegelighet og unormale sædceller ble beregnet ved hjelp av et hemocytometer og mikroskop [14].

Nitroblått Tetrazolium NBT-reduksjon og lipidperoksidasjon av sæd og testikler: Lipidperoksidasjonen og NBT-reduksjonen ble analysert i henhold til samme prosedyre for plasmaanalyse.

Bestemmelse av superoksiddismutase (SOD) og katalaseaktivitet: Superoksiddismutase (SOD) aktivitet ble analysert ved å bruke RANSEL-settet. Her, {{0}}.05 mL testikkelhomogenater ble tilsatt 1,7 mL reaksjonsløsning (0.05 mM xanthin, 0.025 mM 2-({ {9}}jodfenyl)- 3-(4-nitrofenol)-5-fenyltetrazoliumklorid (INT)). Etter blanding ble 0,25 ml xantinoksidase (80 U/L) tilsatt og reagert ved romtemperatur i 30 s. Absorbansen ble målt ved 505 nm. Proteinkonsentrasjonen til testikkelhomogenatet ble bestemt ved hjelp av Bio-Rad DC proteinanalysesett og dets spesifikke aktivitet (U/mg protein) ble beregnet. Katalase (CAT) aktiviteten ble bestemt i henhold til en tidligere rapportert metode [15].

H&E (Hematoxylin og Eosin)-farging

Testis ble dynket i 10 % formalin i 24 timer og lagret ved 4 ◦C. Vevet var i mikrostørrelse og festet til objektglasset. Etter fiksering (95 % metanol + 5 % eddiksyre), ble objektglassene nedsenket i hematoxylin i 3 minutter, vasket med rennende vann i 5 minutter og deretter bløtlagt dem med 50 %, 70 % og 90 % alkohol for ett minutt. Etter det ble objektglassene farget med eosin i 10 s og bløtlagt i 100 % alkohol i ett minutt til det bleknet. Til slutt ble objektglasset bløtlagt i xylen i ett minutt. Senere ble objektglasset lufttørket og forseglet. Det fargede røret ble plassert i et invertert fasekontrastmikroskop (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokyo, Japan) for å observere morfologien.

Analyse av hypothalamus

Mus KISS1, G-proteinkoblet reseptor (GPR) 54, suppressor av cytokinsignalering 3 (SOCS-3), og sirtuin 1(SIRT1) gensekvenser ble identifisert fra NCBI (National Center for Biotechnology Information) gendatabase og en spesifikk primer ble designet med Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.). Primerne som ble brukt i eksperimentet er oppført i tabell 1.

Ekstraksjon av ribonukleinsyre (RNA) fra hypothalamus. Ekstraksjonen av RNA fra hypothalamus i hjernen ble utført ved å bruke RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. De oppnådde mRNA-ene ble kvantitativt målt ved revers transkripsjon (RT) og polymerasekjedereaksjon (PCR). Kompliment-DNA oppnådd fra RT-analyse ble lagret ved -20 ◦C for senere bruk. Det ekstraherte DNA ble utsatt for polymerasekjedereaksjon (PCR) analyse ved bruk av Taq polymerase. Deretter ble 5~10 µL av PCR-produktet tatt og analysert ved elektroforese på et 1,5% agarkolloid. Bildet ble tatt i et UVP BioDoc-It bildesystem. Revers-transkribert komplementær deoksyribonukleinsyre (cDNA) ble tatt og PCR ble utført ved bruk av IQ SYBR Green Supermix Kit. Senere ble den analysert med iQTM 5 Optical System Software. Proteiner ble ekstrahert ved å bruke et proteinekstraksjonsreagens (T-PER). Deretter ble 20 mg testikkelhomogenat tilsatt 400 µL T-PER og sentrifugert (High-Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Tyskland) ved 4 ◦C (125,000× g ) i 20 min. Følgende metode var lik "identifikasjon og kvantifiseringsanalyse av protein" i in vitro-analyse.

2.3. Statistisk analyse

De eksperimentelle resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (gjennomsnitt ± SD), og dataene ble analysert ved hjelp av Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0 programvare, IBM, Armonk, New York, NY, USA. Forskjellene mellom gruppene ble analysert ved enveis variansanalyse (ANOVA). Flere sammenligninger av forskjellige grupper ble analysert ved Duncans test med verdien p < 0.05 som det signifikante nivået.

3. Resultater

3.1. In vitro analyse

3.1.1. Sammenligning av antioksidantaktiviteter til ECH, CTE og RES

Langsiktig hhøyt oksidativt stress og kronisk betennelse er hovedårsakene til diabetikerekomplikasjoner [16]. CTE inneholder forskjelligefenyletanoidglykosider som echinakosid(ECH) og akteosid, med potensial for antioksidantaktivitet [17]. DPPH radikal fjerninganalysen ble utført for å evaluere antioksidantaktiviteten til ECH. Trolox og resveratrol(3,5,4'-trihydroksystilben, RES) ble tatt som henholdsvis standard og positiv kontroll. Som visti figur1, ECH viste bedre radikal renseaktivitet og aktiviteten var betydelig høyereenn den positive kontrollen (RES).

3.1.2. Celleviabilitet til ECH på LC-540 og TM3 Leydig-celler

MTT-analyse ble utført for å evaluere cellelevedyktigheten til forskjellige konsentrasjoner av ECH. LC-540 Leydig-celler og TM3 Leydig-celler viste mer enn 80 % av levedyktigheten etter å ha blitt behandlet med ECH (Figur 2). Sammenlignet med de andre konsentrasjonene, viste en 100-µM konsentrasjon (fortynninger på 100 µM i 2 % FBS) av ECH bedre cellelevedyktighet i TM3 Leydig-celler. Resultatet indikerte at den økte konsentrasjonen av ECH ikke bidrar med noen signifikant toksisitet til cellene.

3.1.3. Effekt av ECH på AGE-indusert superoksidproduksjon ved NBT-analyse i LC-540 og TM3 Leydig-celler

AGE forårsaker oksidativ skade i kroppen på grunn av oksidasjon av glukose og dannelse av frie radikaler som O2-, hydroksylradikaler og karbonylgrupper [18]. Etter å ha blitt stimulert med 50 ug/mL AGE, ble LC -540 (Figur 3a) og TM3 (Figur 3b) celler behandlet med ECH og RES (5 μM og 10 μM hver). Resultatene viste at produksjonen av superoksidanion ble økt i kontrollgruppen (stimulerte AGEs), men produksjonen av superoksidanion ble redusert etter kontrollgruppen (stimulerte AGEs), men produksjonen av superoksidanion ble redusert etter superoksidproduksjonen og beskyttet cellene fra oksidativ skade. Når det gjelder LC-540-celler, viste 10 µM ECH nesten lik aktivitet med normalgruppen. Superoksidproduksjonen i begge cellene ble redusert med en økning i konsentrasjonen av både ECH og RES.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBEDRING AV SEKSUELL FUNKSJON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. Effekt av ECH på H2O2-produksjon i AGE-stimulerte LC-540 Leydig-celler

DCFH-DA-analyse ble utført for å påvise tilstedeværelsen av oksidative arter. Etter å ha kommet inn i cellene, blir det fluorescerende fargestoffet DCFH-DA oksidert av intracellulært H2O2 og danner diklorfluorescein (DCF). Som vist i figur 4 var det en signifikant økning i intracellulær H2O2-produksjon i den AGE-stimulerte gruppen (kontroll), mens tilsetningen av 10 µM ECH og RES reduserte H2O2-produksjonen i cellene betydelig. Administrering av 10 µM ECH resulterte i bare ca. 47,1 % av H2O2-produksjonen, betydelig lavere enn i kontrollgruppen.

3.1.5. Effekt av ECH på RAGE- og NF-KB-proteinekspresjonsnivåer i AGE-stimulerte LC-540 Leydig-celler

Western blot-analyse ble utført for å bekrefte tilstedeværelsen av RAGE i LC-540 Leydig-celler. Effekten av ECH på RAGE (Figur 5a) og NF-KB (Figur 5b) proteinekspresjonsnivåer i AGEs-stimulerte Leydig-celler ble vist i Figur 5. Resultatene viste at 50 µg/mL konsentrasjon av AGE induserte høyere RAGE og NF- κB-ekspresjon i LC-540 Leydig-celler og 10 µM konsentrasjon av ECH og RES reduserte uttrykket av RAGE og NF-KB signifikant. Ekspresjonen av NF-KB var signifikant lavere i RES og ECH enn i RAGE-antagonister. Så resultatene bekreftet at ECH reduserte nivået av betennelse ved å redusere nivået av RAGE og NF-KB.

3.1.6. Effekt av ECH på testosteronsynteseveien i AGE-stimulerte LC-540 Leydig-celler.

Prosessen med spermatogenese og mannlig infertilitet avhenger av tilstedeværelsen av testosteron. Som vist i figur 6, var uttrykkene av StAR (Figur 6a), CYP11A1 (Figur 6b), CYP17A1 (Figur 6c) og HSD17 3 (Figur 6d) proteiner signifikant redusert i AGE-stimulert LC{{11 }} Leydig-celler (kontrollgruppe). Uttrykkene av StAR-, CYP11A1-, CYP17A1- og HSD17 3-proteiner ble betydelig økt når RAGE-antagonisten, RES og ECH ble tilsatt. Det økte uttrykket av StAR- og CYP11A1-proteiner ble sett i både ECH- og RES-behandlede grupper. Ekspresjonsnivået til CYP17A1 var nesten likt i RES- og ECH-gruppene. Ekspresjonene av HSD17 3-proteinet i ECH-behandlede Leydig-celler var mye høyere enn de for RES- og RAGE-antagonist-behandlede celler. Økt ekspresjon av StAR-, CYP11A1-, CYP17A1- og HSD17 3-proteiner indikerte normal produksjon av testosteron.