Effekt av vaksinasjon på hønehøne på utvikling og levetid på immunitet del 1

Abstrakt:

Fuglenes luftveissykdom forårsaker betydelige økonomiske tap hos kommersielt fjørfe. På grunn av behovet for å beskytte langlivet fjærfe mot luftveispatogener fra en tidlig alder, involverer vaksinasjonsprogrammer for høner vanligvis serieadministrasjon av en rekke vaksiner, inkludert infeksiøs bronkittvirus (IBV), Newcastle disease-virus (NDV) og infeksiøs laryngotracheitt-virus (ILTV). Ofte er intervallet mellom vaksinasjoner bare et spørsmål om uker, men det er ukjent om utviklingen av immunitet og beskyttelse mot utfordring når vaksiner gis i kort rekkefølge skjer hos disse fuglene, noe som kalles viral interferens. Målet vårt var å finne ut om serieadministrerte, levende svekkede vaksiner mot IBV, NDV og ILTV påvirker utviklingen og levetiden til immunitet og beskyttelse mot utfordringer hos langlivede fugler.

Basert på et typisk hønsevaksinasjonsprogram, ble spesifikke patogenfrie hvite benhorn administrert flere levende svekkede vaksiner mot IBV, NDV og ILTV frem til 16 ukers alder (WOA), hvoretter visse grupper ble utfordret med IBV, NDV eller ILTV ved 20, 24, 28, 32 og 36 WOA. Fem dager etter utfordring ble viral belastning, kliniske tegn, kryostase, trakeal histopatologi og antistofftitere i serum og tårer evaluert. Vi demonstrerer at henner serieadministrerte levende svekkede vaksiner mot IBV, NDV og ILTV ble beskyttet mot homolog utfordring med IBV, NDV eller ILTV i minst 36 uker, og konkluderer med at intervallet mellom vaksinasjoner brukt i denne studien (minst 2 uker ) forstyrret ikke beskyttelsen. Denne informasjonen er viktig fordi den viser at et typisk hønsevaksinasjonsprogram bestående av serieadministrerte levende svekkede vaksiner mot flere respiratoriske patogener kan resultere i utvikling av beskyttende immunitet mot hvert sykdomsmiddel.

Apropos immunitet, så har menneskekroppen også mange ting som kan forbedre immuniteten, som Cistanche, som også er rik på biologisk aktive stoffer, som peptider, terpener, fenolsyrer osv., som kan stimulere aktivering av immunceller og forbedre immuncellene. funksjon, og styrke kroppens immunitet. Disse biologisk aktive stoffene kan også regulere og aktivere kroppens autoimmune funksjon, og forbedre menneskets immunitet ytterligere.

Klikk når du skal ta cistanche

Nøkkelord:

Infeksiøs bronkittvirus; Newcastle disease-virus; smittsomt laryngotracheitt-virus; vaksinasjonsprogram; immunitet; Luftveissykdom; kryostase; antistoffrespons.

1. Introduksjon

Vaksinasjon mot luftveisvirussykdom er standard praksis i kommersiell fjærfevirksomhet. Både levende og drepte vaksiner gis til fjørfe, og levende vaksiner brukes ofte for en rekke patogener fordi de er effektive når de påføres masse og er relativt økonomiske [1]. Generelt induserer levende vaksiner lokal og cellemediert immunitet og gir en bredere beskyttende respons enn drepte vaksiner, mens drepte vaksiner primært induserer humoral immunitet og har en tendens til å være antigenspesifikke. Varigheten av immunitet oppnådd etter administrering av levende vaksine avhenger av alder og type fugl, nivåer av mors immunitet, sykdom målrettet av vaksinen, immunogenisitet til vaksinen, metode for påføring av vaksine, antall og intervall mellom boostere, virulens og likhet. av feltutfordringsviruset, intervallet mellom vaksinasjon og utfordring, og immunkompetanse hos verten [1–3].

Fuglekoronavirus infeksiøs bronkittvirus (IBV) er et viralt patogen i øvre luftveier hos fjørfe og fører til redusert vektøkning og fôreffektivitet, fall i eggproduksjon og eggkvalitet, hemmet vekst og sekundær bakteriell infeksjon som resulterer i luftsakulitt [4]. Viruset formerer seg først i de øvre luftveiene, etterfulgt av systemisk replikasjon i forplantningskanalen, og noen stammer kan forårsake lesjoner i nyrene [4]. Infiserte fugler kan vise utflod fra nesen, hoste, nysing og luftrørsras [4]. Sykdommen forebygges ved vaksinasjon, og levende vaksiner brukes ofte for å indusere lokal immunitet og beskyttelse. Levende vaksiner gis vanligvis til ungfugler for å oppnå tidlig beskyttelse, og lag og oppdrettere blir også forsterket med enten levende eller inaktiverte vaksiner, som varierer basert på deres likhet med de sirkulerende feltvirusene [2].

Newcastle disease (ND) er forårsaket av virulente stammer av aviært paramyxovirus type 1, som nylig har blitt omklassifisert som aviært avulavirus 1 (AAvV-1) [5]. Avhengig av virusstammen, kan kliniske tegn på ND-infeksjon være fraværende eller kan innebære depresjon, manglende appetitt, luftveistegn (neseutslipp, nysing, hoste), redusert eggproduksjon og eggkvalitet, og nevrologiske tegn (torticollis, sirkling, lammelser) ) [3]. Stammer av Newcastle disease-virus (NDV) er karakterisert som lentogene, mesogene og velogene, i henhold til deres gjennomsnittlige dødstid i embryoer [6]. Lentogene stammer er av lav patogenisitet og forårsaker milde luftveis- eller enteriske infeksjoner, etterfulgt av mesogene stammer, mens velogene isolater er høypatogene og ofte forårsaker nevrologiske tegn og dødelighet [3]. Vaksinasjonsregimer mot NDV varierer og kan benytte en kombinasjon av levende, inaktiverte og virusvektorerte vaksiner [7]. I USA omfatter de mest brukte tradisjonelle vaksinestammene lentogen B1 (eller viruskloner av B1-stammen) og LaSota-stammer [3].

Infeksiøs laryngotracheitt (ILT) er en luftveissykdom hos fjørfe forårsaket av galled alphaherpesvirus I og er økonomisk viktig over hele verden [8]. Kliniske manifestasjoner av ILT inkluderer økt dødelighet, redusert eggproduksjon, redusert kroppsvektøkning, konjunktivitt, trakeitt med oppspytt av blodig slim i alvorlige tilfeller, depresjon, alvorlig dyspné og mottakelighet for andre respiratoriske patogener. Levende vaksiner mot ILT-viruset (ILTV) kan være av kyllingembryoopprinnelse (CEO) eller vevskulturopprinnelse (TCO), der de passeres flere ganger i henholdsvis egg eller vevskultur. Selv om rekombinante vaksiner for ILT er kommersielt tilgjengelige, er CEO-vaksinen den mest brukte vaksinen mot ILTV over hele verden.

På grunn av behovet for å beskytte kyllinger mot forskjellige viruspatogener fra en tidlig alder, inkluderer vaksinasjonsprogrammer vanligvis flere vaksiner mot en rekke patogener. Eksempler på vaksinasjonsregimer i ulike fjørfesektorer er gjennomgått i Merck Veterinary Manual, der intervallet mellom vaksinasjoner ofte bare er et spørsmål om uker.

Det er imidlertid lite informasjon som viser at intervallene mellom vaksinasjoner er tilstrekkelige til at fuglene kan utvikle tilstrekkelig immunbeskyttelse mot utfordringene fra hvert virus. Litteraturen viser at sekvensielle virusinfeksjoner kan resultere i viral interferens, der ett virus blokkerer den påfølgende infeksjonen og/eller replikasjonen av et annet virus i verten [9,10], men til nå er det ukjent om dette fenomenet resulterer i redusert beskyttelse fra serieadministrerte svekkede levende vaksiner hos kyllinger. Interessant nok har det blitt rapportert at samtidig administrering av virus til kyllinger eller kalkuner ikke resulterer i viral interferens [11]. I denne studien undersøker vi hvordan en typisk kommersiell vaksinasjonsplan bestående av en kombinasjon av serieadministrerte, levende svekkede virale luftveissykdomsvaksiner påvirker utviklingen og levetiden til immunitet og beskyttelse mot homologe utfordringer.

2. Materialer og metoder

2.1. Virus

En kommersiell IBV-vaksine MILDVAC-GA-98® (Merck Animal Health, Summit, NJ, USA) ble brukt i denne studien. Vaksinen ble fortynnet i henhold til produsentens anbefalinger. Utfordringsviruset som ble brukt var IBV GA98/CWL0474/98 og ble tilberedt ved en median embryoinfeksiøs dose (EID50) på 103,19. Virustitere ble beregnet ved hjelp av Reed and Muench-metoden [12]. En kommersiell NDV-vaksine B1 (NEWHATCH-C2, Merck Animal Health, Summit, NJ, USA) ble brukt til både vaksinasjon og utfordring og ble rekonstituert etter produsentens instruksjoner.

Siden mesogene og velogene stammer av NDV krever et biosikkerhetsnivå over BSL2, som ikke er tilgjengelig i laboratoriet vårt, involverer vår eksperimentelle modell for beskyttelse mot NDV betydelig reduserte virustitere eller steril immunitet mot en andre eksponering (utfordring) med vaksineviruset. En ILTV kommersiell CEO-vaksine (Trachivax® Merck Animal Health, Summit, NJ, USA) og patogen ILTV Georgia slaktekyllingstamme 63140 [13] ble brukt til henholdsvis vaksinasjon og utfordring. Stamme 63140 ble forplantet i kyllingnyreceller oppnådd fra 3- til 4-uke gamle spesifikke patogenfrie (SPF) kyllinger [14]. CEO-vaksinen ble utarbeidet etter produsentens anbefalinger. Etter inokulering ble median vevskulturinfeksiøs dose (TCID50) bekreftet ved titrering av begge virusene i kyllingnyreceller som tidligere beskrevet [14].

2.2. Eksperimentelt design

Spesifikt patogenfrie egg ble oppnådd ved 18 dagers inkubasjon og klekket ved Poultry Diagnostic and Research Center, Athen, GA. Kyllinger ble plassert på fersk furuspon i kolonihus og binger. Kyllinger ble vaksinert med produsentens anbefalte dose i 100 µL via oculonasal rute i henhold til følgende tidsplan; IBV ved 1 DOA, NDV ved 2 ukers alder (WOA), IBV ved 4 WOA, ILTV ved 8 WOA, NDV ved 12 WOA og ILTV ved 16 WOA.

I tillegg ble en kontrollgruppe ikke vaksinert. Homologe utfordringer ble utført ved 20, 24, 28, 32 og 36 WOA, og obduksjon ble utført fem dager etter utfordring (dpc). Ved utfordringen fikk fuglene én av fire behandlinger: IBV GA98, NDV B1, ILTV 63140, eller ingen utfordring. Behandlingsgruppene for hvert smittevirus per tidspunkt var som følger: ikke-vaksinert, ikke-utfordret (n=9–10); vaksinert, ikke-utfordret (n=9–10); vaksinert, utfordret (n=17–19); ikke-vaksinert, utfordret (n=9–10). Alle IBV-utfordrte fugler fikk en EID50 på 1 × 103,2 per fugl i 100 µL intranasalt. Alle NDV-utfordrte fugler mottok NDV B1-vaksinen i 100 µL intranasalt, rekonstituert i henhold til produsentens protokoll. Alle ILTV-utfordrede fugler mottok den patogene stammen 63140 i en dose på 1 × 103,5 TCID50 per fugl i 100 µL delt likt mellom øyedråper og intranasale ruter. For IBV- og NDV-utfordringer ble fugler observert ved 5 dpc for respiratoriske tegn, som tidligere beskrevet [15]: 0=fraværende; 1=mild; 2=moderat; 3=alvorlig. For ILTV-utfordringer ble fugler observert ved 3 og 5 dpc for dyspné, konjunktivitt, depresjon og dødelighet, som beskrevet tidligere [16].

Choanal-spalten (IBV- og NDV-utfordret og kontrollfugler ved 5 dpc) eller luftrøret (ILTV-utfordrte og kontrollfugler ved 3 og 5 dpc) ble vasket for virusdeteksjon, og vattpinner ble lagret i PBS ved -80 ◦C. Ved 28, 32 og 36 WOA ble 50 µL tårer samlet ved å tilsette granulert NaCl til øyet. Blod ble samlet ved vinge- eller hjertepunktur og tilsatt et mikrosentrifugerør for å samle serum for antistoffdeteksjon. Fugler ble avlivet humant, og øyelokket, Harderian gland (HG), thymus, lever, milt, cecal mandler og bursa av Fabricius ble samlet og lagret ved -80 ◦C for virusdeteksjon og i 10 prosent nøytralt bufret formalin. Luftrøret ble fjernet, en seksjon ble plassert i 10 prosent nøytral bufret formalin, og den gjenværende delen av luftrøret ble nedsenket i vevskulturmedier for ikonostasetesten beskrevet nedenfor. Prosedyrene ble godkjent av University of Georgia Institutional Animal Care and Use Committee (AUP-nummer: A2015 05-001-R2).

2.3. Ciliostase test

Ikonostasetesten ble utført på høstede luftrør samlet i cellekulturmedier (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) ved 37 ◦C. For hvert luftrør ble fem luftrørsringer med en tykkelse på omtrent 1 mm kuttet og representerte de proksimale, midtre og distale delene [17,18]. Cilia-aktivitet ble observert ved bruk av et invertert mikroskop (Olympus, Center Valley, PA, USA). Poengsystemet følger 0=alle flimmerhår som slår; 1=75 prosent av flimmerhår som slår; 2=50 prosent av flimmerhår som slår; 3=25 prosent av flimmerhår som slår; 4=ingen flimmerhår som slår som tidligere beskrevet [17]. Maksimalt mulig poengsum for hvert luftrør er 20. Hver luftrørsring ble skåret av tre individer, og gjennomsnittlig totalskåre for hvert luftrør ble beregnet. Ikonostasebeskyttelsespoeng for hver gruppe ble bestemt av følgende formel: 100 − [(totalt av individuelle skårer for gruppen)/(antall individer i gruppen × 20) × 100], og en poengsum større enn eller lik til 50 ble ansett som beskyttet.

2.4. Trakeal histopatologi

En seksjon av hvert luftrør ble fiksert i 10 prosent nøytralt bufret formalin, behandlet og innebygd i parafin, og 5-µm seksjoner ble kuttet for hematoksylin- og eosinfarging. For IBV-lesjoner ble epitelhyperplasi, lymfocyttinfiltrasjon og epitelial deciliasjon skåret for hvert luftrør. Poeng ble bestemt som følger: 1=normal, 2=fokal, 3=multifokal og 4=diffus, som beskrevet tidligere [19]. For NDV-lesjoner ble det utført en beskrivende analyse. For ILTV-lesjoner ble mikroskopiske lesjoner skåret på en skala fra 0–5 (normal til svært alvorlig), som beskrevet tidligere [20].

2.5. RNA-ekstraksjon og kvantitativ revers transkriptase-polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR)

For IBV- og NDV-deteksjon ble viral RNA-ekstraksjon fra 50 µL av PBS fra hver vattpinne utført ved bruk av et 5× MagMAX-96 viral isolasjonssett (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) på en MagMAX™ Express{{ 3}} Deep Well Magnetic Particle Processor (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), i henhold til produsentens instruksjoner. Den kvantitative revers transkripsjonspolymerasekjedereaksjonen (qRT-PCR) ble utført med AgPath-IDTM One-Step RT-PCR-settet (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), etter produsentens protokoll. Hver 25-µL reaksjonsblanding inneholdt 12,5 µL 2× RT-PCR-buffer, 10 µM av hver primer, 4 µM av proben, 1 µL 25× RT-PCR-enzymblanding og 5 µL viralt RNA. qRT-PCR-reaksjonene ble kjørt på Applied Biosystems® 7500 Fast Realtime PCR-systemet (Life Technologies Ltd., Carlsbad, CA, USA) under følgende forhold: én syklus på 50 ◦C i 30 min og 95 ◦C i 15 min. , etterfulgt av 40 sykluser på 94 ◦C i 1 s og 60 ◦C i 60 s. Primerne og proben for IBV qRT-PCR ble tidligere publisert [21], og består av en foroverprimer IBV50GU391 (50 -GCT TTT GAG CCT AGC GTT-30 ), en revers primer IBV50GL533 (50 - {38}}GCC ATG TTG TCA CTG TCT ATT G-30 ), og en Taqman® dobbeltmerket IBV50G-probe (50 -FAM-CAC CAC CAG AAC CTG TCA CCT C-BHQ{{45 }} ). Primere og probe for NDV qRT-PCR ble tidligere beskrevet [22] og består av en foroverprimer NDV M pluss 4100 (5'-AGT GAT GTG CTC GGA CCT TC-3'), en revers primer NDV M -4220 (5'-CCT GAG GAG AGG CAT TTG CTA-3'), og en Taqman® dobbeltmerket probe NDV M pluss 4169 (5'-FAM-TTC TCT AGC AGT GGG ACA GCC TGC -BHQ1-3').

Primerne ble oppnådd fra Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, USA), og Taqman-proben ble syntetisert av BioSearch Technologies (Novato, CA, USA). Sanntids RT-PCR-komponenter og termosyklerparametere ble tidligere beskrevet [21]. Dataene er uttrykt som gjennomsnittlig syklusterskelverdi (CT) for alle prøver i hver gruppe, med positive CT-verdier basert på deteksjonsgrensen for denne testen assosiert med virusdeteksjon i egg [23].

Hver qRT-PCR-reaksjonsplate inkluderte en standardkurve som en RNA-ekstraksjonskontroll og som en positiv kontroll. GA98 IBV isolert fra allantoisvæske ble brukt som mal for standardkurven. Negative kontroller ble også inkludert i hver plate og besto av PCR-reagenser uten RNA.

2.6. DNA-ekstraksjon

For ILTV ble totalt DNA ekstrahert fra trakealprøvene ved å bruke MegaZorb® DNA-ekstraksjon miniprep 96-brønnsettet (Promega, Madison, WI, USA), som beskrevet tidligere [24].

2.7. qPCR

En dupleks sanntids PCR-analyse som forsterker et fragment av UL44-virusgenet i ILTV og et fragment av kylling alfa 2-kollagengenet ble utført, som tidligere beskrevet [25].

2.8. Serum Infeksiøs Bronkitt Virus (IBV)-spesifikke IgG-antistofftitere

IBV-spesifikke IgG-titere ble påvist ved bruk av en kommersiell IgG-enzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA) IBV-antistofftestsett (IDEXX, Westbrook, ME, USA). Kort fortalt ble serumprøver (lagret ved -20 ◦C) fortynnet 1:500, og prosedyren ble utført i henhold til produsentens protokoll.

2.9. Tåreutskilte IBV-spesifikke IgA-antistofftitere

Tåre-IBV-spesifikk IgA ble påvist ved bruk av et kommersielt IgG ELISA IBV-antistofftestsett (IDEXX, Westbrook, ME, USA). Kort fortalt ble tårer seriefortynnet to ganger i PBS og inkubert i duplikatbrønner over natten ved 4 ◦C. Alle vasketrinn ble utført ved bruk av PBS-Tween 20 (0,05 prosent Tween 20). Platene ble inkubert ved 23 ◦C i 2 timer i monoklonalt muse-antikylling-IgA-BIOT (1:1000, klon A-1, Southern Biotech, Birmingham, AL, USA), etterfulgt av 1 time i Streptavidin-HRP ( 1:4000, Southern Biotech, Birmingham, AL, USA). De endelige antistoffdeteksjonstrinn ble fullført i henhold til produsentens instruksjoner. Endepunktstitre ble bestemt ved å rapportere den laveste fortynningen der den optiske tettheten (OD), registrert ved 650 nm bølgelengde, var minst tre standardavvik over gjennomsnittet av 12 kontrollbrønner inkubert uten tåreprøver. Data fra brønner med en presis fargeendring på grunn av gjenværende substrat eller luftbobler ble ekskludert fra analysen, og resultatene ble rapportert som log2 av endepunktstiteren.

2.10. Statistisk analyse

Dataene ble analysert ved å bruke Prism v.6.0 programvare (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). For viral belastningsdata ble en enveis variansanalyse (ANOVA) med Dunnets posttest brukt for å sammenligne behandlingsgrupper innenfor hver innsamlingsperiode. Alle andre data ble analysert ved å bruke en Kruskal–Wallis-test med Dunns posttest for å sammenligne behandlingsgrupper innenfor hver innsamlingsperiode. Signifikante forskjeller ble bestemt ved p < 0.05.

3. Resultater

3.1. Infeksiøs bronkittvirus

5 dager etter utfordringen med IBV GA98 hadde vaksinerte/utfordrte fugler signifikant lavere RNA-belastning sammenlignet med positive kontroller ved alle innsamlingstider og i alle vevsprøver, bortsett fra cecal-mandelen ved 24 WOA (tabell 1). I vaksinerte kontroller er det ikke påvist IBV-RNA på alle innsamlingstidspunkter bortsett fra i cecal-mandlene ved 20 og 24 WOA og choanal-spalten ved 20 WOA. IBV-belastninger i negative kontroller i alle vev var under deteksjonsgrensen ved å bruke CT-verdien på større enn eller lik 36,17 som tidligere rapportert [23], ved alle innsamlingstider unntatt de 24 WOA HG negative kontrollene.

Kliniske tegn på IBV-infeksjon målt 5 dager etter utfordring var signifikant redusert hos vaksinerte/utfordrede fugler sammenlignet med positive kontroller i alle uker unntatt 28 WOA, men trender i kliniske tegnskåre var numerisk lavere blant vaksinerte/utfordrede fugler (tabell 2) . Kliniske tegn var fraværende hos ikke-utfordrede negative og vaksinerte kontrollfugler, og tegn hos vaksinerte/utfordrede fugler var ikke signifikant forskjellige fra tegn hos ikke-utfordrede kontroller.

Tabell 1. Gjennomsnittlig kvantitativ revers transkripsjonspolymerasekjedereaksjon (qRT-PCR) syklusterskelverdier (CT) for infeksiøs bronkittvirus (IBV) RNA samlet inn fra choanal kløften, Harderian kjertel, konjunktiva og cecal mandel 5 dager etter utfordring med IBV GA98 ved 20, 24, 28, 32 og 36 ukers alder. Bokstaver (a–d) indikerer signifikante forskjeller mellom vaksine- og utfordringsgrupper for hver uke (p < 0,05).

Tabell 2. Kliniske tegn og mikroskopiske lesjoner ble målt 5 dager etter IBV GA98-utfordringen. Bokstavene (a–b) indikerer signifikante forskjeller mellom vaksine- og utfordringsgrupper for hver uke (p < 0.05).

Histopatologisk undersøkelse av luftrør fra alle grupper varierte fra innenfor normale grenser til fokal til multifokal minimal til moderat lymfocytisk trakeitt; moderat lymfatisk infiltrasjon ble imidlertid sett hyppigere hos positive kontroller. I alle ukene var andelen vaksinerte/utfordrede fugler med deciliasjon eller akutt trakealnekrose signifikant redusert sammenlignet med positive kontroller og var ikke forskjellig fra negative og vaksinerte kontroller (tabell 2).

Ciliostasis, defined as the cessation of tracheal ciliary movement, was measured at 5 DPC, and the number of birds positive for cryostasis and cryostasis protection scores was calculated for each group (Figure 1). At all collection times, vaccinated/challenged birds were protected from cryostasis (scores were >50), og positive kontroller ble ikke beskyttet (poeng var<50). The non-challenged negative controls and vaccinated controls were protected (scores were >50) til alle hentetider.

Figure 1. Ciliostasis protection scores among tracheas were collected 5 days post-challenge with IBV GA98 for different groups of birds challenged at 20, 24, 28, 32, and 36 weeks of age (WOA). Groups with a protection score >50 (horisontal linje) er beskyttet, og grupper med beskyttelsespoeng<50 are not protected. Fractions above each bar represent the proportion of birds positive for cryostasis for the respective group. −/− = non-vaccinated/non-challenged, +/− = vaccinated/non-challenged, +/+ = vaccinated/challenged, −/+ = non-vaccinated/challenged.

IBV-spesifikke IgG-titere ble målt i serum samlet ved 5 DPC. Til alle tider unntatt ved 32 WOA, viste vaksinerte fugler fra både ikke-utfordrede og utfordrede grupper signifikant høyere titere sammenlignet med ikke-vaksinerte fugler fra både ikke-utfordrede og utfordrede grupper (Figur 2). Ved 32 WOA var titere hos vaksinerte fugler, uavhengig av utfordringsstatus, signifikant høyere sammenlignet med positive kontroller. Titere hos vaksinerte/utfordrte fugler skilte seg ikke signifikant fra titere i vaksinerte kontroller før 36 WOA, da vaksinerte/utfordrede fugler hadde signifikant høyere titere. Sammenlignet med negative kontroller hadde vaksinerte/utfordrede fugler signifikant høyere titere til enhver tid.

IBV-spesifikke IgA-titere ble målt i tårer samlet ved 5 DPC ved 28, 32 og 36 WOA. Ved 28 WOA var titere hos vaksinerte/utfordrede fugler signifikant høyere sammenlignet med titere i ikke-utfordrede negative kontroller (figur 3). Ved 32 WOA viste vaksinerte/utfordrede fugler signifikant lavere titere sammenlignet med positive kontroller. I tillegg hadde de vaksinerte/utfordrte fuglene signifikant høyere titere enn den vaksinerte/uutfordrede gruppen ved 28 WOA. Ingen andre signifikante forskjeller ble oppdaget. Virus 2019.

Figur 2. IBV-spesifikke IgG-titere i serum ble samlet 5 dager etter utfordring med IBV GA98 for forskjellige grupper av fugler utfordret ved 20, 24, 28, 32 og 36 WOA. Bokstavene (a–c) indikerer signifikante forskjeller mellom vaksine- og utfordringsgrupper for hver uke (p < 0,05). −/−=ikke-vaksinert/ikke-utfordret, pluss /−=vaksinert/ikke-utfordret, pluss / pluss=vaksinert/utfordret, −/ pluss=ikke-vaksinert/utfordret.

Figur 3. Riv-IBV-spesifikk IgA-titer i tårer samlet 5 dager etter utfordring med IBV GA98 for forskjellige grupper av fugler utfordret ved 20, 24, 28, 32 og 36 WOA. Bokstavene (a–c) indikerer signifikante forskjeller mellom vaksine- og utfordringsgrupper for hver uke (p < 0,05). −/−=ikke-vaksinert/ikke-utfordret, pluss /−=vaksinert/ikke-utfordret, pluss / pluss=vaksinert/utfordret, −/ pluss=ikke-vaksinert/utfordret.

3.2. Newcastle Disease Virus (NDV)

Ved 5 dpc med NDV B1 hadde vaksinerte/utfordrte fugler enten upåviselige RNA-belastninger eller signifikant lavere belastninger sammenlignet med positive kontrolltitere ved alle innsamlingstidspunkter og i alt vev som ble tatt ut (tabell 3). Ikke-utfordrede negative kontroller og vaksinerte kontroller var negative for RNA-virus ved å bruke CT-verdien på større enn eller lik 35.0 som tidligere rapportert [22].

Tabell 3. Gjennomsnittlige qRT-PCR CT-verdier for NDV-RNA samlet fra choanal-spalten, Harderian-kjertelen og konjunktiva 5 dager etter utfordring med NDV B1-vaksine. Bokstavene (a–c) indikerer signifikante forskjeller mellom vaksine- og utfordringsgrupper for hver uke (p < 0.05).

Kliniske tegn målt ved 5 dpc var signifikante ved 20 WOA i positive kontroller, hvoretter kliniske tegn i positive kontroller ikke var forskjellig fra noen av de andre behandlingsgruppene (tabell 4). Ingen signifikante forskjeller i kliniske tegn eksisterte mellom vaksinerte/utfordrede fugler og ikke-utfordrede kontroller på noe tidspunkt. I alle ukene var histopatologisk undersøkelse av luftrørene innenfor normale grenser eller avdekket fokal til multifokal minimal til mild lymfatisk trakeitt, og det var ingen grupperelaterte forskjeller.

Trakeas ble også evaluert for kryostase, og ingen grupper viste kryostase.

NDV-spesifikke serum-IgG-titere hos vaksinerte/utfordrede fugler og vaksinerte kontroller var signifikant høyere enn titere i både positive og negative kontroller ved alle innsamlingstidspunkter (figur 4). Det var ingen signifikant forskjell i titere mellom vaksinerte/utfordrede fugler og vaksinerte kontroller på noe tidspunkt. Tilsvarende ble det ikke påvist noen signifikant forskjell i titere mellom ikke-vaksinerte/utfordrede og negative kontroller, bortsett fra ved 28 WOA der titere fra ikke-vaksinerte/utfordrede kontroller var signifikant høyere.

Tabell 4. Kliniske tegn ble målt 5 dager etter NDV B1-utfordringen. Bokstavene (a–b) indikerer signifikante forskjeller mellom vaksine- og utfordringsgrupper for hver uke (p < 0.05).

Figur 4. NDV-spesifikke IgG-titere i serum ble samlet 5 dager etter utfordring med NDV B1-vaksine for forskjellige grupper av fugler utfordret ved 20, 24, 28, 32 og 36 WOA. Bokstavene (a–c) indikerer signifikante forskjeller mellom vaksine- og utfordringsgrupper for hver uke (p < 0,05). −/−=ikke-vaksinert/ikke-utfordret, pluss /−=vaksinert/ikke-utfordret, pluss / pluss=vaksinert/utfordret, −/ pluss=ikke-vaksinert/utfordret.

3.3. Infeksiøst laryngotracheittvirus (ILTV)

Ved 5 dpc med ILTV-stamme 63140 hadde vaksinerte/utfordrte fugler signifikant lavere viral DNA-belastning enn positive kontroller ved alle innsamlingstidspunkter og i alt vev (tabell 5). DNA-belastningene i luftrøret og HG var ikke-detekterbare eller lave og skilte seg ikke signifikant fra DNA-belastninger i ikke-utfordrede negative og vaksinerte kontroller, som var negative ved bruk av CT-verdien større enn eller lik 38,0 som tidligere rapportert [26]. I konjunktiva var DNA-belastninger i vaksinerte/utfordrte fugler signifikant høyere enn DNA-belastninger fra både ikke-utfordrede negative og vaksinerte kontroller, bortsett fra ved 28 WOA der det ikke ble påvist noen signifikant forskjell mellom vaksinerte/utfordrede fugler og vaksinerte kontroller.

Tabell 5. Gjennomsnittlige qPCR CT-verdier for ILTV DNA samlet inn fra luftrøret, Harderian kjertel og konjunktiva 5 dager etter utfordring med patogen ILTV-stamme 63140. Bokstavene (a–c) indikerer signifikante forskjeller mellom vaksine- og utfordringsgrupper for hver uke (p < 0,05).

Kliniske tegn og viralt DNA ble påvist hos utfordrede fugler ved 3 DPC, men tegn i positive kontroller hadde blitt mer alvorlige med 5 dpc ettersom trakeal viral belastning økte (tabell 6). Kliniske tegnskåre målt ved 5 dpc ble signifikant redusert hos vaksinerte/utfordrte fugler sammenlignet med positive kontroller, ved alle innsamlingspunkter bortsett fra 36 WOA når kliniske tegnskåre var numerisk redusert. Alle negative kontroller og vaksinerte kontroller hadde ingen kliniske tegn, og kliniske tegn hos vaksinerte/utfordrte fugler var ikke signifikant forskjellige sammenlignet med disse kontrollene, bortsett fra ved 36 WOA når kliniske tegnskåre var signifikant høyere.

Tabell 6. Kliniske tegn ble målt 5 dager etter ILTV 63140-utfordring. Bokstavene (a–b) indikerer signifikante forskjeller mellom vaksine- og utfordringsgrupper for hver uke (p < 0,05).

Trakeal histologisk undersøkelse var innenfor normale grenser eller avdekket fokal til diffus minimal til mild lymfatisk trakeitt i luftrør fra alle grupper. For de positive kontrollene hadde 3/9 og 1/10 i henholdsvis uke 20 og 28 akutt fokal nekrotiserende trakeitt med syncytia og intranukleære inneslutninger (Figur 5).

Figur 5. Trakeale mikroskopiske lesjoner stemmer overens med infeksiøs laryngotracheittinfeksjon ved 20 ukers alder. (A) Tallrike syncytia med intranukleære inneslutninger (pil). (B) En annen luftrør fra samme gruppe viste syncytia med intranukleære inneslutninger (pil).

Ingen ikonostase ble observert i luftrørene til fugler fra noen av gruppene.

ILTV-spesifikke IgG-titere i serum samlet 5 dager etter utfordring var signifikant høyere hos vaksinerte fugler fra både utfordrede og ikke-utfordrede grupper, sammenlignet med de positive og negative kontrollene (Figur 6).

Figur 6. ILTV-spesifikke IgG-titere i serum ble samlet 5 dager etter utfordring med ILTV-stamme 63140 for forskjellige grupper av fugler utfordret ved 20, 24, 28, 32 og 36 WOA. Bokstavene (a–b) indikerer signifikante forskjeller mellom vaksine- og utfordringsgrupper for hver uke (p < 0,05). −/−=ikke-vaksinert/ikke-utfordret, pluss /−=vaksinert/ikke-utfordret, pluss / pluss=vaksinert/utfordret, −/ pluss=ikke-vaksinert/utfordret.

For more information:1950477648nn@gmail.com