Effekter av forskjellige ekstraherte deler av Cistanche Deserticola på hypoglykemiske effekter av Db/Db svarte mus Ⅱ

2 Eksperimentelle metoder

2.1 Tilberedning av Cistanche deserticola bearbeidede produkter Cistanche deserticola:

Ta Cistanche deserticola medisinske materialer, vask bort urenheter, damp i en kjele ved normalt trykk i 2 timer, kutt i 6 mm og tørk ved 70 grader. Cistanche deserticola: Ta Cistanche deserticola avkoksbiter, tilsett passende mengde risvin, bland godt, fukt i 8 timer (gul risvin: vann=1:1), damp under høyt trykk i 4 timer, og tørk kl. 70 grader. (Bruk 30 ml risvin for hver 100 g Cistanche deserticola).

NATURLIG ORGANISK CISTANCHE EKSTRAKT

Supportive Service Of Wecistanche - Den største cistanche-eksportøren i Kina:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tlf:+86 15292862950

Handle for flere spesifikasjoner:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

2.2 Anrikning av forskjellige utvunnede deler av Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

Ta 30 g Cistanche deserticola/Tamarococcus deserticola-pulver, tilsett 10 ganger mengden vann, varme og tilbakeløp for ekstraksjon to ganger, 2 timer hver gang, kombiner ekstraktene, konsentrer, tilsett etanol til alkoholinnholdet når 60 %, fell ut kl. lav temperatur i 12 timer, og filtrer med sug. bunnfallet er den urene polysakkariddelen. Konsentrer supernatanten til en passende konsentrasjon, påfør den på D101 makroporøs adsorpsjonsharpiks og eluer den med vann og etanol med forskjellige konsentrasjoner i rekkefølge. Samle opp vanneluatet og konsentrer under redusert trykk til en tykk pasta, som er den totale oligosakkaridfraksjonen; vask med 40 % etanol. Delikvider, konsentrer og tørk under redusert trykk, som er den totale glykosidfraksjonen av Cistanche deserticola.

2.3 Innholdsbestemmelse av forskjellige utvunnede deler av Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.1 Bestemmelse av totalt polysakkaridinnhold i Cistanche deserticola/Cistanche deserticola.

Vei glukoseprøven 20. 00 mg i en 50 mL målekolbe for å lage 0. For en 4 mg·mL-1 glukosestandardløsning, pipetterer du henholdsvis 3, 4, 5, 6 og 7mL i en 50 mL målekolbe, fortynnes til volum med vann og pipetterer 2,0 mL av hver konsentrasjonsgradient glukoseløsning i et reagensrør. Ta en annen lik mengde destillert vann som en blank kontroll, tilsett 1 ml 5 % fenol til hvert rør, rist godt, tilsett raskt 5 ml konsentrert svovelsyre, la det stå i 10 minutter, legg det i et 40 graders vannbad i 15 minutter, ta den ut, avkjøl raskt til romtemperatur, og mål absorbansverdien ved 490 nm, ta absorbansen (A) som ordinaten og glukosekonsentrasjonen (C) som abscissen, tegn en standardkurve, og få regresjonsligning Y=8.37X-0.162 8 (R2=0.994 6). Vei nøyaktig 1,0 g av det totale polysakkaridpulveret av råvarer og produkter, plasser dem i henholdsvis 50 ml målekolber, tilsett vann for å løse opp og juster volumet til merket, trekk nøyaktig 2,0 ml inn i et reagensglass, og mål i det samme. måte som standard kurveforberedelsesmetode. , det er det.

2.3.2 Bestemmelse av betaininnhold i Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.2.1 Tilberedning av referanseløsning:

Vei 1,17 mg av betainreferanseløsningen nøyaktig, legg den i en 5 mL målekolbe, tilsett 50 % metanol for å løse opp og fortynne til volum, og den er klar.

2.3. 2． 2 Kromatografiske forhold

Den kromatografiske kolonnen er Ecosil {{0}}AMINO kromatografikolonne (4,6 mm×250 mm, 5 μm), mobil fase: acetonitril-vann (99,5 ∶ 0,5) , kolonnetemperatur: 30 grader, deteksjonsbølgelengde: 194 nm, strømningshastighet: 0,6 mL·min-1, injeksjonsvolum 10 μL, kromatogram vist i figur 1. 2.3.2.3 Preparering av testløsning Nøyaktig vei pulveret av den totale oligosakkaridfraksjonen av rå og ferdige produkter, henholdsvis 1,0 g, plassert i 5 mL målekolbe, tilsett destillert vann for å løse opp og fortynne til volum, rist godt, pass gjennom 0,45 μL mikroporøs filtermembran, og det er klart.

2.3.2.4 Eksempel på innholdsbestemmelse

Absorber den totale oligosakkarid-testløsningen nøyaktig i rå og tilberedt Cistanche deserticola, mål den i henhold til betingelsene under "2.3.2.2", og beregn betaininnholdet i prøven.

2.3.3 Bestemmelse av innholdet av echinacoside, verbascoside og heterocymicifugarin i Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.3.1 Tilberedning av referanseløsning

Vei nøyaktig 4,50 mg echinacosid, 4,80 mg verbascoside og 5,05 mg heterologt comimicin i 5 mL målekolber, tilsett 50 % metanol for å løse opp og fortynne til merket, og ta hver kontroll. Sett 200 μL av injeksjonsprøveløsningen hetteglasset, tilsett 400 μL 50 % metanol, og bland godt for å lage en blandet referanseløsning, rist godt, og den er klar.

2.3.3.2 Kromatografiske forhold

Den kromatografiske kolonnen er Ecosil C18 (4,6 mm×250 mm, 5 μm), metanol er den mobile fase A, 0.1 % maursyre er den mobile fase B, gradienteluering, {{ 12}}~45 min, 30 % A→ 70 % A, strømningshastigheten er 1,0mL·min-1, kolonnetemperaturen er 30 grader, deteksjonsbølgelengden er 330 nm, injeksjonsvolumet er 10μL, og kromatogrammet er vist i figur 2.

2.3.3.3 Klargjøring av testløsning

Vei nøyaktig 1,0 g av det totale glykosidpulveret av råvarer og produkter, plasser dem i 100 mL målekolber, tilsett 50 % metanol for å løse opp, juster volumet til merket, og rist vi vil. Trekk 5 mL av hver prøve nøyaktig inn i en 10 mL målekolbe, tilsett 50 % metanol for å fylle opp volumet, rist godt og pass gjennom en 0,45 μm mikroporøs filtermembran for å oppnå.

2.3.3.4 Eksempel på innholdsbestemmelse

Tegn nøyaktig Cistanche deserticola totalglykosideprøven og mål den i henhold til betingelsene under "2.3.3.2". Beregn innholdet av echinacoside, verbascoside og heterologe medskyldige i prøven.

2.4 Dyregruppering, modellering og legemiddeladministrasjon

Dyrerommet har 12 timer med lys og 12 timer med mørke, en relativ luftfuktighet på 50 % til 70 %, og en romtemperatur på 18 til 22 grader. db/db svarte mus og db/m svarte mus (normal kontrollgruppe) ble fôret normalt med ordinært fôr, og forsøket startet ved 9 ukers alder. Bortsett fra den normale kontrollgruppen, ble de resterende db/db svarte musene tilfeldig valgt i henhold til blodsukkernivåer og kroppsvekt. Delt inn i 8 grupper, nemlig modellgruppe, positiv kontrollgruppe, Cistanche deserticola total polysakkaridgruppe, Cistanche deserticola total oligosakkaridgruppe, Cistanche deserticola total glukosidergruppe, Tartschistanche deserticola total polysakkaridgruppe, Tarthouse deserticolagruppe totalgruppe de oligosaccharidgrupper, Tarthouse deserticolagruppe total glucosaccharidgruppe. Bortsett fra normal kontroll

Bortsett fra modellgruppen og modellgruppen, ble rottene i de andre gruppene administrert intragastrisk administrering i en dose på 2 ml/100 g i 4 påfølgende uker. Konsentrasjonen av væsken var 4,1 g·kg-1. Normalkontrollgruppen og modellgruppen ble behandlet på samme måte. Gi en viss mengde vanlig saltvann til magen.

2.5 Effekter av forskjellige ekstraherte deler av Cistanche deserticola på blodsukkernivået til db/db svarte mus

2.5.1 Test for oral glukosetoleranse (OGTT).

Etter 26 dagers administrering fastet de i 12 timer, og 60 minutter etter administrering neste dag, fikk de svarte musene i hver gruppe 2,0 g·kg-1 glukose ved henholdsvis 0, {{10}}.5, 1.0 og 2. .0 time blod fra halevene ble tatt for å måle blodsukkerverdien. Med blodsukkerverdien som ordinaten og tiden som abscissen ble det laget et blodsukkerendringsdiagram, og arealet under linjen til blodsukkerkurven til hver forsøksgruppe ble beregnet i henhold til formelen (AUC, hmmoL·L{ {13}}) [19]. AUC=A × {{20}}.25 + B × 0.50 + C × 0.75 + D. I formelen: A, B, C og D er blodsukkerverdiene ved henholdsvis 0, 0,5, 1,0 og 2,0 timer.

2.5.2 Beregning av insulinresistensindeks og arterioskleroseindeks

Insulinresistensindeksen ble beregnet i henhold til litteraturmetoden [20]: HOMA-IR=Glukose × Insulin / 22. 5. HOMA - =20 × Insulin / (Glukose - 3.5) × 100 %. IR er insulinresistens og (%) er -cellefunksjon. Den molare enheten for glukose er mmoL·L-1

. Insulin gis i mU·L-1. Glukose- og insulintall måles under faste. Arterioskleroseindeksen (Aterogen indeks) ble beregnet i henhold til metoden beskrevet av Zheng et al. [21]. Beregningsmetode: Aterogen indeks=(TC-HDL-C) / HDL-C.

2.5.3 Effekter av forskjellige ekstraherte deler av Cistanche deserticola/Cistanche deserticola på serum INS og HbA1c fra db/db svarte mus

Ta de frosne serumprøvene og få dem til romtemperatur før du bruker dem til testing med INS- og HbA1c-enzymkoblede immunoassay-sett. Følg nøye metodene og trinnene i settinstruksjonene.

2.6 Effekter av forskjellige ekstraherte deler av Cistanche deserticola/Cistanche deserticola på oksidativt stressnivå i leveren til db/db svarte mus

Ta de frosne serumprøvene og få dem til romtemperatur før du bruker dem til testing med MDA- og SOD-enzymkoblede immunoassay-sett. Følg nøye metodene og trinnene i settinstruksjonene.

2.7 Effekter av forskjellige ekstraherte deler av Cistanche deserticola/Cistanche deserticola på leverfettmetabolismen til db/db svarte mus

Rotteserum TG, TC, HDL-C og LDL-C nivåer ble målt ved bruk av relevante sett. For spesifikke måletrinn, se instruksjonene for settet.

2.8 Effekter av forskjellige ekstraherte deler av Cistanche deserticola/Ratiana kamfer på UA, Cr og mALB i plasma og urin fra db/db svarte mus

Ta frosne plasma- og urinprøver og bringe dem til romtemperatur før du bruker dem til testing av UA-, Cr- og mALB-enzymkoblede immunanalysesett. Følg nøye metodene og trinnene i settinstruksjonene.

2.9 Observasjon av pankreas- og nyrepatologiske snitt ved HE-farging

Bukspyttkjertelen og nyrevevet dynket i 10 % paraformaldehydfiksativ i 24 timer ble fjernet, vasket med destillert vann og lagret i 70 % etanol. Vevsprøver ble fjernet, dehydrert med gradert etanol, renset, innebygd i parafin, snittet og deretter farget med hematoksylin og eosin (H&E-farging). Etter at seksjonslimet har tørket, bruk et digitalt bildesystem med høy oppløsning for å observere og ta bilder av seksjonene.

2.10 Bestemmelse av nyrevev type IV kollagen ved immunhistokjemi

For ekspresjon ble nyreseksjoner avvokset til vann og deretter utsatt for antigeninnhenting. De ble blokkert med 10 % geiteserum og inkubert med det primære antistoffet ved 4 grader over natten. Etter vasking ble det sekundære antistoffet inkubert. Dagens løsning var DAB for fargeutvikling. Vasking, dehydrering og forsegling ble utført under et optisk mikroskop. Observer type-IV kollagenproteinuttrykket i nyrevev.

2.11 Statistiske metoder

Bruke GraphPad Prism versjon 5.01 (2007, GraphPad Software re inc) programvare for å analysere dataene og resultatene

Resultatet er gjennomsnitt±SEM Indikerer at forskjellen mellom de to gruppene er enveis

ＡＮＯＶＡ(ｏｌｌｏｅｄｅＢｏｎｅｒｒｎｎ′ ett par kolonnetest) metode, P<0.05 is a significant difference and has statistical significance.