Effekten av STAT6-hemmer AS1517499 i behandling av nyrefibrose
Mar 24, 2022
Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
DEL Ⅰ: Farmakologisk hemming av STAT6 forbedrer myeloid fibroblastaktivering og alternativ makrofagpolarisering ved nyrefibrose
Baihai Jiao, Changlong An, Melanie Tran, Hao Du, Penghua Wang, Dong Zhou og Yanlin Wang
INTRODUKSJON
Kronisk nyresykdom (CKD) har blitt en betydelig folkehelseutfordring(1). Fibrose er den ultimate vanlige veien for utvikling av CKD og regnes som en viktig faktor for utviklingen av alle former for CKD(2).Nyrefibroseer et patologisk trekk ved CKD, som fører til erstatning av normal nyrevevsstruktur med ekstracellulær matrise (ECM) med progressiv og irreversibel skade på nyrefunksjonen (3). Men til tross for økt forståelse av de molekylære mekanismene tilnyrefibrose, er det ingen spesifikk behandling for å kontrollere fibrose og gjenopprette nyrefunksjonen. Siden opprinnelsen og funksjonelle bidraget til fibroblaster ikke er fullstendig forstått, er det fortsatt en utfordring å effektivt målrette fibroblaster i organfibrose.
Akkumulerende bevis indikerer at myeloide myofibroblaster kalt fibrocytter spiller en avgjørende rolle i prosessen med fibrose (4-7). Vi og andre har tidligere vist at rekruttering av benmargsavledede fibroblaster øker progresjonen og utviklingen avnyrefibrose(8-12). Derfor kan målretting av disse cellene tjene som en effektiv terapeutisk strategi for å behandle kronisk nyresykdom. Benmargsavledede fibroblaster deler egenskapene til mesenkymale celler så vel som hematopoietiske celler(13,14). Imidlertid bestemmer forskjellige cytokiner produsert i det lokale mikromiljøet differensieringen av benmargsavledede fibroblaster. Vi har tidligere vist at Th2-cytokiner(I-4 og IL-13), som regnes som profibrotiske cytokiner, forsterker uttrykket av type I-kollagen, fibronektin og -SMA i benmargsavledede monocytter (15 , 16).
STAT6signalering aktiveres primært av Th2-cytokiner som IL-4 og IL-13 og er assosiert med patogenesen til lunge (17,18), lever(19) ognyrefibrose(15, 20). Vi har nylig vist at JAK3/STAT6spiller en avgjørende rolle i aktiveringen av benmargsavledede fibroblaster og utviklingen avnyrefibroseved obstruktiv nefropati(15). Videre har vi vist at knockout av IL-4Ro hemmerSTAT6aktivering, myeloid fibroblastakkumulering og transformasjon til myofibroblaster, M2 makrofagpolarisering og utvikling avnyrefibroseetter obstruktiv skade eller administrering av folsyre(16). Disse funnene tyder på atSTAT6signalvei kan tjene som et nytt terapeutisk mål fornyrefibrose.
I denne studien evaluerte vi den potensielle terapeutiske rollen tilAS1517499, en potent og selektivSTAT6inhibitor(21), i myeloid fibroblastaktivering og utvikling avnyrefibrosei to eksperimentelle murine modeller. Resultatene våre viser detAS1517499avskaffetSTAT6aktivering i de interstitielle cellene i nyren med obstruktiv skade eller folsyrenefropati. Videre administrasjon avAS1517499undertrykker aktiveringen av myeloid fibroblaster, reduserer M2 makrofagpolarisering og dempernyrefibrose. Disse funnene tyder på at hemming avSTAT6medAS1517499har potensial for behandling av fibrotisk nyresykdom.
Cistanche-ekstrakt:utdrag fraurt cistanchefor behandling av nyresykdom
RESULTATER
AS1517499 hemmer STAT6-aktivering i nyrene med obstruktiv skade
Vi har rapportert at JAK3/STAT6signalering aktiveres i interstitielle celler i fibrotiske nyrer etter obstruktiv skade eller administrering av folsyre (15,16). For å vurdere omSTAT6kan tjene som et terapeutisk mål for behandling avnyrefibrose, ble villtype mus utsatt for obstruktiv skade og deretter behandlet med bærer ellerAS1517499, a STAT6-spesifikk inhibitor, annenhver dag i 10 dager. Immunhistokjemisk farging og Western blot-analyse ble utført for å undersøkeSTAT6aktivering i nyrene. Immunhistokjemisk farging avslørte at positiv fosfor-STAT6farging ble hovedsakelig påvist i de interstitielle cellene i nyren med obstruktiv nefropati, som ble redusert medAS1517499behandling (figur 1A, B). I samsvar med disse funnene viste Western blot-analyse nivå av fosfo-STAT6ble hemmet i nyrene med obstruktiv nefropati som følgeAS1517499behandling (figur 1C, D). Disse dataene indikerer at hemming avSTAT6medAS1517499hindrerSTAT6aktivering i nyrene med obstruktiv nefropati.AS1517499Forringer akkumulering av myeloide fibroblaster ved obstruktiv nefropati Akkumulerende bevis indikerer at rekruttering av myeloide fibroblaster bidrar betydelig til patogenesen avnyrefibrose. For å undersøke omAS1517499påvirker akkumulering av myeloide fibroblaster, nyresnitt ble farget for den hematopoietiske markøren CD45 og mesenkymal markør PDGFR-.
FIGUR 1|AS1517499 hemmer STAT6-aktivering i nyren med obstruktiv skade.(A) Representative mikrofotografier av nyreseksjoner på dag 10 av UUO farget for fosforylertSTAT6(brun) og motfarget med hematoxylin (blå). Målestokk, 50um. (B) Kvantitativ analyse av fosforylertSTAT6-positive celler i nyren.***P<0.001 vs.=""><0.01 vs=""><0.01 vs="" as-uuo.n="6" per="" group.="" (c)="" representative="" western="" blots="" show="" protein="" levels="" of="">STAT6ogSTAT6i nyren på dag 10 av UUO.(D) Kvantitativ analyse p-STAT6proteinnivåer i nyrene,***P<0.001 vs=""><0.05 vs="" vehicle-uuo;="">< 0.05="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="">
Antallet CD45 og PDGFR-dobbelt positive celler ble betydelig forbedret i de obstruerte nyrene, mensAS1517499behandling reduserte CD45 og PDGFR-doble positive celler markant (figur 2A, B). Disse dataene tyder på detSTAT6inhibitorAS1517499forbedrer akkumulering av myeloide fibroblaster i nyrene etter obstruktiv skade.AS1517499Demper M2 makrofagpolarisering ved obstruktiv nefropati Transformasjonen av monocytter til benmargsavledede fibroblaster medieres av M2 makrofagpolarisering.STAT6spiller en nøkkelrolle i M2 makrofagpolarisering. Derfor undersøkte vi om hemming avSTAT6medAS1517499medierer makrofagpolarisering. Nyreseksjoner ble farget for CD206 (M2 makrofagmarkør) og PDGFR-.CD206 og PDGFR-dobbelt positive celler ble markert økt i nyrene til mus med obstruktiv skade. I motsetning,AS1517499reduserte antallet CD206 pluss og PDGFR-pluss celler signifikant i nyrer med obstruktiv nefropati (figur 2C, D). Disse dataene indikerer detAS1517499demper overgangen av monocytter til myeloide fibroblaster betydelig og reduserer M2 makrofagpolarisering.
FIGUR 2 |AS1517499 demper myeloide fibroblastakkumulering og makrofagpolarisering i nyren med obstruktiv skade.(A) Representative mikrofotografier av kidhey-seksjoner på dag 10 av UUO farget for CD45 (rød), PDGFR- (grønn) og DAPI (blå) Skala bar, 50 μm. B） Kvantitativ analyse av CD45* og PDGFR- * fibroblaster i nyrene.**P<0.001 vs=""><0.01 vs=""><0.01 vs="" as-uuo.n="6" per="" group.="" (c)representative="" photomicroaraphs="" of="" the="" kidney="" at="" day="" 10ofuuo="" stained="" for="" cd206="" (red).pdgfr-b="" (green).and="" dapiblue).scale="" bar.,50um.(d)="" quantitative="" analysis="" of="" cd206t="" and="" pdgfr-b+="" fibroblasts="" in=""><0.01 ys=""><0.01 vs=""><0.01 vs="" as-uuo.n="6" per="" group.="" (e)quantitative="" analysis="" of="" mrnaexpression="" of="" m2="" macrophage="" markers="" (mrc.fzz1.arg1.ccl17="" in="" the="" kidney="" of="" vehide="" or="">AS1517499behandlede mus.*P<><><0.05 vs=""><><0.05 vs=""><><0.05vs as-uuo.n="6" per="">
For ytterligere å vurdere effekten avSTAT6inhibitorAS1517499på M2 makrofagpolarisering ble sanntids RT-PCR utført for å oppdage mRNA-uttrykk av M2 makrofagmarkører.AS1517499behandling undertrykte mRNA-ekspresjonsoverflod av Argl, MRCl, Fizzl og CCL17 i obstruerte nyrer (Figur 2E). Disse dataene indikererSTAT6signalisering av immunfluorescensfarging og Western blot-analyse. Immunfluorescensfarging og Western blot-analyse avslørte at nivåene av fibronektin og kollagen I var markant økt i den obstruerte nyren, mensAS1517499behandling svekket proteinnivåene av kollagen I og fibronektin i den obstruerte nyren betydelig (figur 4C-H).
FIGUR 3|AS1517499 reduserer myofibroblastdannelse i nyrene med obstruktiv skade.(A) Representative mikrofotografier av UUO-behandlede nyreseksjoner farget for a-SMA (grønn) og motfarget med DAPI (blå). Målestokk, 50mm. (B) Kvantitativ analyse av a-SMA-positivt område i nyren. ***P < 0.001="" vs="" vehicle-con,="" #="" p="">< 0.05="" vs="" vehicle-uuo,="" pluss="" pluss="" p="">< 0,01="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="" gruppe.="" (c)="" representative="" western="" blots="" viser="" a-sma-proteinnivåer="" i="" nyrene.="" (d)="" kvantitativ="" analyse="" av="" a-sma-proteinuttrykk="" i="" nyrene.="" ***p="">< 0,001="" vs="" vehicle-con,="" ##p="">< 0,01="" vs="" vehicle-uuo,="" pluss="" pluss="" p="">< 0,01="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="">
FIGUR 4|AS1517499 demper nyrefifibrose og ECM-proteinproduksjon i nyrene med obstruktiv skade.(A) Representative mikrofotografier av nyreseksjoner farget med Sirius rødt for evaluering av total kollagenavsetning i nyren. Skalastang, 50 mm. (B) Kvantitativ analyse av interstitiell kollagenavsetning i nyrene. ***P<0.001 vs="" vehicle-con.="" ##p="" <="" 0.01="" vs="" vehicle-uuo,="" ++p="" <="" 0.01="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="" group.="" (c)="" representative="" photomicrographs="" of="" the="" kidney="" sections="" stained="" for="" fibronectin="" (green)="" and="" counterstained="" with="" dapi="" (blue).="" scale="" bar,="" 50mm.="" (d)="" quantitative="" analysis="" of="" the="" fibronectin-positive="" area="" in="" the="" kidney.="" ***p="" <="" 0.001="" vs="" vehicle-con.="" ##p="" <="" 0.01="" vs="" vehicle-uuo,="" +="" p="" <="" 0.05="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="" group.="" (e)="" representative="" photomicrographs="" of="" the="" kidney="" sections="" stained="" for="" collagen="" i="" (green)="" and="" counterstained="" with="" dapi="" (blue).="" scale="" bar,="" 50mm.="" (f)="" quantitative="" analysis="" of="" collagen="" i="" positive="" area="" in="" the="" kidney.="" ***p="" <="" 0.001="" vs="" vehicle-con.="" #="" p="" <="" 0.05="" vs="" vehicle-uuo,="" ++p="" <="" 0.01="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="" group.="" (g)="" representative="" western="" blots="" show="" protein="" expression="" of="" fibronectin="" and="" collagen="" i="" in="" the="" kidney.="" (h)="" quantitative="" analysis="" of="" protein="" levels="" of="" fibronectin="" and="" collagen="" i="" in="" the="" kidney.="" ***p="" <="" 0.001="" vs="" veh-con;="" ##p="" <="" 0.01,="" #="" p="" <="" 0.05="" vs="" veh-uuo;="" ++p="" <="" 0.01="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="">
AS1517499 HemmerSTAT6Aktivering ved folsyrenefropati
Folsyrenefropati er en annen vanlig brukt murin modell avnyrefibrose. Derfor undersøkte vi omAS1517499kan hemmeSTAT6aktivering og patogenese avnyrefibroseved folsyrenefropati. Nyresnitt ble farget for fosfo-STAT6.STAT6fosforylering ble signifikant indusert i interstitielle celler i nyren med FA nefropati, mensAS1517499behandling hemmet uttrykket av fosfo-STAT6 markant (figur 5A, B). Disse funnene ble ytterligere bekreftet ved Western blot-analyse (figur 5C, D). Disse dataene indikerer detSTAT6aktiveres i interstitialcellene i den skadede nyren med folsyrenefropati, som hemmes betydelig etterAS1517499behandling.
FIGUR 5|AS1517499 hemmer STAT6-aktivering ved folsyrenefropati.(A) Representative bilder av immunhistokjemisk farging av fosforylertSTAT6i nyren 2 uker etter kjøretøy ellerAS1517499behandling. Skalastang, 50 mm. (B) Kvantitativ analyse av fosforylertSTAT6-positive celler i nyren 2 uker etter kjøretøy ellerAS1517499behandling. ***P < {{0}}.001="" vs.="" con;="" ##p="">< 0,01="" vs="" fa="" pluss="" veh.="" n="6" per="" gruppe.="" (c)="" representativ="" western="" blot="" av="">STAT6ogSTAT6i nyren. (D) Kvantitativ analyse p-STAT6proteinnivået i nyrene. ***P < {{0}}.001="" vs.="" con;="" ##p="">< 0,01="" vs="" fa="" pluss="" veh.="" n="6" per="">
AS1517499Undertrykker myeloide fibroblastakkumulering ved folsyrenefropati For å undersøke rollen tilAS1517499i myeloid fibroblastakkumulering i nyrene med folsyrenefropati utførte vi dobbel immunfluorescensfarging for CD45 og PDGFR-. Antallet CD45 og PDGFR-dobbelt positive celler økte i nyrene med folsyrenefropati.AS1517499undertrykket betraktelig antallet CD45- og PDGFR-dobbelt positive celler i nyrene med folsyrenefropati (figur 6A, B).
AS1517499Demper M2 makrofagpolarisering ved folsyrenefropati Vi undersøkte deretter om den farmakologiske hemming avSTAT6medAS1517499regulerer M2 makrofagpolarisering i FA nefropati. Som bekreftet av immunfluorescensfargingsanalyse, behandling avAS1517499signifikant hemmet antallet CD206 og PDGFR-dobbelt positive celler sammenlignet med vehikelbehandlede mus med FA-administrasjon (figur 6C, D). I tillegg ble M2 makrofagmarkører, Argl, MRC1, Fizzl og CCL17 indusert i folsyrenefropati. Disse M2 makrofagmarkørene ble redusert etter detteAS1517499behandling (Figur 6E). Disse dataene indikerer at den farmakologiske hemming avSTAT6medAS1517499demper M2 makrofagpolarisering i nyrene med FA nefropati.
FIGUR 6|AS1517499 demper myeloide fibroblastakkumulering og makrofagpolarisering ved folsyrenefropati.(A) Representative mikrofotografier av nyreseksjoner 2 uker etter kjøretøy ellerAS1517499behandling farget for CD45 (rød), PDGFR-b (grønn) og DAPI (blå). Målestokk, 50mm. (B) Kvantitativ analyse av CD45 pluss og PDGFR-b pluss fifibroblaster i nyrene. **P < 0.01="" vs="" con.="" #="" p="">< 0,05="" vs="" fa="" pluss="" veh.="" n="6" per="" gruppe.="" (c)="" representative="" mikrofotografier="" av="" nyreseksjoner="" 2="" uker="" etter="" kjøretøy="">AS1517499behandling farget for CD206 (rød), PDGFR-b (grønn) og DAPI (blå). Målestokk, 50mm. (D) Kvantitativ analyse av CD206 pluss og PDGFR-b pluss fifibroblaster i nyrene. ***P < 0,001="" vs.="" con.="" ##p="">< 0,01="" vs="" fa="" pluss="" veh.="" n="6" per="" gruppe.="" (e)="" kvantitativ="" analyse="" av="" mrna-ekspresjon="" av="" m2-makrofagmakere="" (mrc,="" fizz1,="" arg1,="" ccl17)="" i="" nyrene="" 2="" uker="" etter="" vehikel="">AS1517499behandling. ***P < {{0}}.001="" vs="" con;="" ###p="">< 0,001="" vs="" fa="" pluss="" veh;="" ##p="">< 0,01="" vs="" fa="" pluss="" veh.="" n="6" per="">
AS1517499Demper myofibroblastdannelse ved folsyrenefropati For å avgjøre omAS1517499påvirker myofibroblasttransformasjon, -SMA-ekspresjon ble undersøkt i nyreseksjoner og ved western blot-analyse. I samsvar med funnene våre i UUO-modellen ble -SMA-positive myofibroblaster og uttrykket av -SMA-protein forbedret i nyrene etter behandling med FA sammenlignet med vehikelbehandlede mus. Dessuten samadministrasjon av FA medAS1517499signifikant redusert -SMA-positive celler og -SMA-proteinnivå i nyrene sammenlignet med FA-samadministrert bærergruppe (figur 7A-D). Disse resultatene viser detAS1517499hemmer myofibroblastdannelse i nyrene med folsyrenefropati.
FIGUR 7|AS1517499 reduserer myofibroblastdannelse ved folsyrenefropati.(A) Representative mikrofotografier av nyreseksjoner 2 uker etter kjøretøy ellerAS1517499behandling farget for a-SMA (grønn) og motfarget med DAPI (blå). Målestokk, 50mm. (B) Kvantitativ analyse av a-SMA-positivt område i nyren. ***P < 0.001="" vs="" con;="" ###p="">< 0,001="" vs="" fa="" pluss="" veh.="" n="6" per="" gruppe.="" (c)="" representative="" western="" blots="" som="" viser="" a-sma-proteinnivåer="" i="" nyrene="" 2="" uker="" etter="" kjøretøy="">AS1517499behandling. (D) Kvantitativ analyse av a-SMA-proteinuttrykk i nyrene. ***P < 0.001="" vs="" con,="" ##p="">< 0,01="" vs="" fa="" pluss="" veh.="" n="6" per="">
maca ginseng cistanche
AS1517499 ForbedrerNyreFibroseog bevarer nyrefunksjonen ved folsyrenefropati
For å vurdere effekten avAS1517499onnyrefibrose, picrosiriusred farging ble utført på nyreseksjoner. FA-behandlede mus hadde markant forhøyede nivåer av kollagenavsetning, mens deAS1517499behandling reduserte mengdene av kollagenavsetning i nyrene betydelig (figur 8A, B). I tillegg demonstrerte immunfluorescensfarging og Western blot-analyse dette ytterligereAS1517499hemmer signifikant ekspresjonen av ECM-proteiner (fibronektin og kollagen I) i nyrene med folsyrenefropati (figur 8C-H). Disse dataene tyder på detAS1517499hemmer ECM-produksjonen i nyrene og utviklingen avnyrefibroseved folsyrenefropati.
For å vurdere effekten avSTAT6mangel på nyrefunksjon ved folsyrenefropati, ble serumkreatinin målt. Folsyrebehandlede mus viste en betydelig økning av serumkreatinin (figur 8I). Derimot ble mus behandlet medAS1517499viste mye lavere serumkreatinin ved folsyrenefropati. Disse resultatene indikerer at hemming avSTAT6medAS1517499beskytter nyrene mot folsyrenefropati.
FIGUR 8|AS1517499 reduserer nyrefifibrose og bevarer nyrefunksjonen ved folsyrenefropati. (A) Representative mikrofotografier av nyreseksjoner 2 uker etter kjøretøy ellerAS1517499behandling farget med Sirius rødt for evaluering av total kollagenavsetning i nyrene. Målestokk, 50mm. (B) Kvantitativ analyse av interstitiell kollagenavsetning i nyrene. ***P < 0.0{{10}}1="" vs="" con,="" ##p="">< 0.01="" vs="" fa="" pluss="" veh="" .="" n="6" per="" gruppe.="" (c)="" representative="" mikrofotografier="" av="" nyreseksjoner="" farget="" for="" fibronektin="" (grønt)="" og="" motfarget="" med="" dapi="" (blått).="" målestokk,="" 50mm.="" (d)="" kvantitativ="" analyse="" av="" det="" fifibronektin-positive="" området="" i="" fa-behandlede="" nyrer.="" ***p="">< 0,001="" vs="" con,="" ##p="">< 0,01="" vs="" fa="" pluss="" veh.="" n="6" per="" gruppe.="" (e)="" representative="" mikrofotografier="" av="" nyreseksjoner="" farget="" for="" kollagen="" i="" (grønn)="" og="" motfarget="" med="" dapi="" (blå).="" skalastang,="" 50="" mm.="" (f)="" kvantitativ="" analyse="" av="" kollagen="" i="" positivt="" område="" i="" nyren.="" ***p="">< 0,001="" vs="" con,="" #="" p="">< 0,05="" vs="" fa="" pluss="" veh.="" n="6" per="" gruppe.="" (g)="" representative="" western="" blots="" som="" viser="" proteinuttrykk="" av="" fibronektin="" og="" kollagen="" i="" i="" nyrene.="" (h)="" kvantitativ="" analyse="" av="" proteinnivåer="" av="" fibronektin="" og="" kollagen="" i="" i="" nyrene.="" ***p="">< 0,001="" vs="" con;="" ##p="">< 0,01="" vs="" fa="" pluss="" veh.="" n="6" per="" gruppe.="" (i)="" effekt="">AS1517499på serumkreatinin. **P < {{0}}.001="" vs="" con;="" #="" p="">< 0,05="" vs="" fa="" pluss="" veh.="" n="6" per="">
Den tradisjonelle kinesiske medisinske urten:cistanche
Merk: Den tradisjonelle kinesiske medisinenurt cistanche(også kjent som "drageurten" og "ørkenginseng"), vokser bare i de tørre og varme ørkenene. Som en av de ni udødelige urter,Cistanche(cistanche tubulosa/cistanche deserticola/ørkenlevende cistanche/cistanche salsa)innhold med rike effektive ingredienser som echinakosid, akteosid, totale fenyletanoidglykosider, flavonoider, polysakkarider, etc. disse effektive ingrediensene gjorde cistanche til en verdifull nærende urt og matmateriale for menneskers immunitet, indre organer og hjerneceller og nevroner, etc. moderne farmakologiske studier har bekreftet følgendeeffekter av cistanche(fordelene med cistanche): forbedre immunitet; forbedre seksuell funksjon og nyrefunksjon; anti-tretthet; anti-aldring; forbedre hukommelsen; anti-Parkinsons sykdom; anti-Alzheimers sykdom; antioksidasjon; letthet-forstoppelse; anti-inflammatorisk; fremme beinvekst, bleking av hud; beskytte leveren; etc.
cistanche wirkung