Effekter av glyeosider av cistanche på læring av kognisjon og synaptisk plastisitet hos modellrotter med søvnmangel

ABSTRAKT

Objektiv:For å utforske om glykosidene til cistanche kan forbedre læringen og kognitiv funksjon av søvnmangelmodellrotter ved å regulere synaptisk plastisitet.

Metoder: Femti Wistar hannrotter ble tilfeldig delt inn i en tom kontrollgruppe (kontroll), plattformkontrollgruppe (PC), modellgruppe (modell),glykosider av cistanche gruppe (GCs), og estazolam gruppe ( Est ). Søvnmangelmodellen til rotter ble utarbeidet ved hjelp av en modifisert multi-plattform vannmiljømetode. Morris vannlabyrint og åpen felttest ble brukt for å oppdage den romlige kognitive funksjonen og følelsesmessige endringer hos rotter. Nissl-farging ble brukt til å observere endringene i morfologi og mengde nerveceller ihippocampus CAl-område hos rotter. Western blot og R'T - PCR ble brukt for å påvise ekspresjonsnivåene av synaptofysin (SY'N), postsynaptisk membrantett stoff 95 (PSD -95), oghjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF). 

Resultater;Morris vannlabyrint-resultater viste at sammenlignet med kontrollgruppenlæring og kognitive evner hos rotteri modellgruppen var signifikant redusert (P<0. 05 ), and the learning and memory function of rats wasforbedret GCs-behandling ( P <0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05 ), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05 ), the resting time increased ( P <0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T - PCR showed that the protein- og genekspresjonsnivåer av BDNF, SYN og PSD -95i Mlodel-gruppen ble betydelig redusert (P<0. 05 ), while after treatment with GCs, the expression levels ofBDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05). Conclusion: Glycosides of cistanche may af. feet synaptic plasticity by regulating the expression of synaptic-related markers, thereby improving the learning and cognitive function of sleep deprivation model rats.

URTE CISTANCHE FORMULERINGSTILLEGG FORFORBEDRING AV LÆRING OG KOGNITIV FUNKSJON

NØKKELORDGlykosider av cistanche; Hippocampus; Søvnmangel; Læring og hukommelse; Angst; Synaptisk plastisitet

Søvnforstyrrelse (SD)er enfunksjonell forstyrrelse av unormal søvnforårsaket av en rekke komplekse faktorer som f.ekssøvnløshet, drømmende, oglett oppvåkning. De siste årene harforekomsten av SDhar gradvis økt. Relaterte studier har rapportert at SD kan forårsakehjerte- og karsykdommer,metabolsk dysfunksjon,immunsykdommer, ogsentralnervesystemetdegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom [1]. SD kan forårsake oksidativ skade på hippocampale nevroner, forårsake kognitiv dysfunksjon og produsere humørsvingninger som angst og depresjon [2]. Cistanche deserticola er et verdifullt medisinsk materiale som kan brukes som både medisin og mat i Kina. Det har effekten av å tonifisere nyrene og fylle på qi, fukte tarmene, fremme tarmbevegelser og styrke yang. Hovedekstraktet av Cistanche deserticola, glykosider av cistanche (GC), har antioksidanter, anti-apoptotisk, leverbeskyttende og nevrobeskyttende effekter [3]. Vår tidligere forskning fant at GC-er kan forbedre læring og kognitiv funksjon til SAMP8-mus ved å spille en antioksidant og anti-apoptotisk rolle [4].

Relaterte studier har vist at kognitiv dysfunksjon forårsaket av SD er nært knyttet til synaptisk plastisitet [5]. Imidlertid er det få rapporter om mekanismen som GC-er regulerer synaptisk plastisitet og forbedrer lærings- og hukommelsessvikt og kognitiv nedgang hos rotter indusert av søvnmangel. Derfor har denne studien som mål å utforske om GC-er påvirker synaptisk plastisitet ved å regulere uttrykket av synaptisk-relaterte markører, og dermed forbedre læring og kognitiv funksjon til rotter med søvnmangelmodeller, og gi nye behandlingsideer og planer for GC for å behandle læring og kognitiv funksjon. svekkelse forårsaket av søvnforstyrrelser.

1 Materialer og metoder

1.1 Forsøksdyr

Wistar hannrotter i alderen 6 til 8 uker, som veier 280 til 300 g, ble kjøpt fra Beijing Sibeifu, med en dyreproduksjonslisens [SCXK (Beijing) 2019-0010]. Alle dyrene ble holdt i dyreforsøkssenteret ved Baotou Medical College under følgende forhold: temperatur (24 ± 1) grad, fuktighet 50 % til 55 %, 12 timer lyst og 12 timer mørkt, og ingen restriksjoner på mat og vann. Dette eksperimentet ble godkjent av skolens etiske komité [Baoyi Lunshen 2022 nr. (63)].

1. 2 Hovedreagenser og instrumenter

Totalt antall glykosider av Cistanche deserticola ble kjøpt fra Chengdu Xiyu Cistanche Biotechnology Co., Ltd. (batchnummer: KSM20220609011); Estazolam-tabletter ble kjøpt fra CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (batchnummer: 044220343); proteinbelastningsbuffer (P1015), RIPA lyseringsbuffer (R0010), kjemiluminescerende løsning (PE0010), etc. ble alle kjøpt fra Beijing Solebao; postsynaptisk tetthetssubstans i 95 (PSD-95) antistoff (AB192757) og synaptophysin (SYN) antistoff (ab32127) ble kjøpt fra Abcam, USA Company; hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF) (48503-2) og -aktin (52901) ble kjøpt fra SAB Company, USA; geit-anti-kanin IgG sekundært antistoff (SA00001-20) ble kjøpt fra Proteintech Company, USA; rottemelatonin (MT) og ELISA Scientific Research Kit (MM-0657R1) ble kjøpt fra Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry Co., Ltd. Parafinskjærer (Leica, Tyskland); optisk mikroskop (Leica, Tyskland);

Morris vannlabyrint, åpne felt testboks (Shanghai Xinruan); vertikale elektroforese apparater (Beijing Liuyi Company); decolorization shaker (Beijing Liuyi Company); protein bildebehandling analyse system (Shanghai Tanon Technology); fluorescens kvantitativ PCR-instrument (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1.3 Eksperimentelle metoder

1.3.1 Dyregruppering og legemiddeladministrasjon

50 Wistar-hannrotter ble tilfeldig delt inn i blank kontrollgruppe (kontrollgruppe), plattformkontrollgruppe (plattformkontroll, PC-gruppe), modellgruppe (modellgruppe), totale glykosider av Cistanche deserticola-gruppe (GCs-gruppe). , 50 mg/kg) og estazolingruppe (Est-gruppe, 0,54 mg/kg), med 10 rotter i hver gruppe. Kontrollgruppen og PC-gruppen ble gitt 0,9 % saltvann ved sonde. Alle gruppene ble sonet kl. 07.00 hver dag etter at modelleringen startet, og sonden varte i 21 dager.

1.3. 2. Utarbeidelse av søvnmangel dyremodell

Søvnmangelmodellen ble etablert ved bruk av den modifiserte multi-plattform vannmiljømetoden [6]. Det eksperimentelle utstyret var en 130 cm × 50 cm × 45 cm rektangulær vanntank av polyetylenharpiks. En liten plattform med en diameter på 5 cm og en høyde på 20 cm ble plassert i vanntanken. Plattformen til PC-gruppen hadde en diameter på 10 cm og en høyde på 20 cm. Vanntanken ble fylt med vann til en dybde på ca. 18 cm og vanntemperaturen ble holdt på (20 ± 1) grad. En uke før starten av eksperimentet ble rottene plassert i søvnmangelboksen hver dag i 60 minutter for å gjøre seg kjent med miljøet. Etter at modellen ble etablert, bortsett fra kontrollgruppen, ble rottene i hver gruppe plassert på den lille plattformen i tide fra kl. 08.00 til 20.00 hver dag for søvnmangel i 21 påfølgende dager.

Alle rottene hadde fri tilgang til mat og vann og beveget seg fritt på plattformen. Den lyse og mørke syklusen var på 12 timer hver dag.

1. 3. 3 Morris vannlabyrinteksperiment

Morris vannlabyrint ble delt inn i 4 områder, fylt med vann, og plattformen ble plassert i 4. kvadrant. Vannoverflaten var ca 2 cm over plattformen. Matkvalitets spiselig melanin ble tilsatt til vannet, og vanntemperaturen ble holdt på (25 ± 1) grad. (1) Posisjoneringsnavigasjonseksperiment: Sentrum av hvert område ble valgt og rottene ble forsiktig plassert i vannet. De fikk utforske fritt. Tiden det tok for rottene å finne målplattformen innen 60 sekunder ble registrert. Rotter som ikke fant plattformen ble ført til plattformen og ble værende i 20 sekunder. Treningen ble fortsatt i 5 dager. (2) Romlig utforskningstest: På 6. dag ble plattformen fjernet og rottene ble plassert i vannet fra midten av 2. kvadrant mot veggen. Antall ganger rottene passerte plattformen innen 120 s og tiden de oppholdt seg i 4. kvadrant ble registrert.

1. 3. 4 Åpent felteksperiment

En 100 cm × 100 cm × 50 cm eksperimentell boks ble brukt, og bunnen av boksen ble delt inn i 9 rutenett. Hver gruppe rotter ble plassert i det åpne felteksperimentrommet på forhånd for å tilpasse seg innemiljøet i 60 min. Ved begynnelsen av eksperimentet ble testrottene plassert i faste hjørner av den åpne felteksperimentboksen etter tur, og antall ståtider, bevegelsesavstand og statisk tid til rottene innen 5 minutter ble registrert ved hjelp av programvare for atferdsanalyse. Miljøet ble pålagt å være stille under forsøket, og den eksperimentelle enheten ble tørket av med henholdsvis vann og alkohol mellom to eksperimenter for å forhindre at lukten av den første rotten påvirket atferdsvurderingen til den neste rotten.

1. 3. 5 Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA)

Påvisning av serum-MT-nivåer hos rotter Rotter ble bedøvet ved intraperitoneal injeksjon, og 5 ml blod ble samlet fra abdominal aorta. Etter å ha ventet i 30 minutter ved romtemperatur, ble blodet sentrifugert for å oppnå serum. 40 μL prøvefortynningsmiddel ble tilsatt til hver brønn, og deretter ble 10 μL av prøven som skulle testes tilsatt. Etter forsegling med en forseglingsfilm ble platen inkubert ved 37 grader i 30 minutter. Vasket 5 ganger, 50 μL enzymmerkingsløsning ble tilsatt, og platen ble forseglet med en forseglingsfilm og inkubert ved 37 grader i 30 minutter. Vasket 5 ganger, og deretter ble den fargeutviklende løsningen og reaksjonsavslutningsløsningen tilsatt etter tur. OD-verdien til hver brønn ble målt med en enzymmerker ved en bølgelengde på 450 nm.

1. 3. 6 Nissl-farging

Tre rotter ble valgt fra hver gruppe, og hjernevev ble fjernet ved halshugging og fiksert med en 4% polyoksyetylenløsning. Vevet ble dehydrert, nedsenket i voksløsning, innebygd og skåret i skiver ved konvensjonelle metoder. Skivene ble holdt med en tykkelse på 5 μm, skylt med PBS, farget med 0,1 % toluidinblått i 0,5 timer, differensiert med 95 % alkohol, dehydrert med 100 % alkohol, transparentisert med xylen, og forseglet med nøytral gummi. Endringene i morfologien og antall nevroner i CA1-regionen av rottehippocampus ble observert under et mikroskop og bilder ble samlet.

1. 3. 7 Western blot-eksperiment

Fire rotter ble valgt fra hver gruppe, og hippocampus ble isolert ved halshugging. Hippocampusvevet ble blandet med RIP A lysisbuffer i et isbadmiljø og vevet ble sentrifugert for å oppnå supernatanten. Proteinkonsentrasjonen ble påvist ved BCA-metoden. 20 ug protein ble tilsatt proteinfyllingsbuffer for elektroforese. Etter at proteinelektroforesen var fullført, ble membranen overført ved 300 mA konstant strømning, blokkert med 5 % skummetmelkpulver, det primære antistoffet ble inkubert ved 4 grader over natten, og det sekundære antistoffet ble inkubert ved romtemperatur i 2 timer. Etter at fargeutviklingsløsningen ble brukt, ble proteinbåndene statistisk analysert ved bruk av et kjemiluminescensavbildningsanalysesystem.

1. 3. 8 RT-PCR-eksperiment

Tre rotter ble valgt fra hver gruppe for å fremstille hippocampusvevshomogenat. Totalt RNA i vevsvæsken ble ekstrahert ved hjelp av Trizol-metoden og konsentrasjonen ble målt. Et fastking cDNA-syntesesett ble brukt for revers transkripsjon, og en fluorescens kvantitativ amplifikasjonsreaksjon ble utført ved bruk av et fluorescens kvantitativt sett for å oppdage det relative ekspresjonsnivået til synaptisk-relatert protein mRNA. Resultatene ble analysert ved å bruke 2-ΔΔCt. Primersekvensene er vist i tabell 1.

Tabell 1 RT-PCR-primersekvenser

1.4 Statistiske metoder

Dataresultatene som samsvarte med normalfordelingen ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (x ± s), og statistisk analyse ble utført ved bruk av GraphPad Prism 9.5-programvare. Enveis variansanalyse ble brukt for sammenligning mellom flere prøver, og P < 0.05 indikerte at forskjellen var statistisk signifikant.