Effektivitet og mekanisme for cistanches Herba-ekstrakt ved behandling av reproduktiv dysfunksjon hos rotter med nyre-yang mangel basert på metabolomics

AbstraktDenne studien undersøkerReproduktiv beskyttende effektogPotensiell mekanisme for Cistanches Herba Extract(Che) på en rotte modell avnyre-yang mangelindusert av adenin. Rotter ble tilfeldig delt inn i fem grupper: normal, modell, lav dose CHE (0. 6 g · kg -1 · d -1), høy dose CHE (1,2 g · kg -1 ({{{9}) og l. mg · kg -1 · d -1). Rottene ble administrert adenin (200 mg · kg -1 · d -1) ved sonde de første 14 dagene for å indusere nyre yang -mangel, samtidig som de fikk medikamentell behandling. Etter 14 dager ble modelleringen avbrutt, men medikamentell behandling fortsatte i 49 dager. Innholdet av komponenter i CHE ble analysert ved høy ytelse flytende kromatografi (HPLC). Den adenininduserte nyre-yang-mangelmodellen ble vurdert gjennom symptomkarakterisering og måling av testosteron (T) nivåer ved bruk av et enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) -sett. Patologisk skade på testis og epididymis ble evaluert basert på våtvekten og utførte hematoksylin-eosin (HE) farging. Sædtetthet og bevegelighet ble målt ved bruk av datasuelt sædanalyse (CASA), og sædens levedyktighet ble vurdert ved bruk av levende/død sædfargingssett, og sædmorfologi ble evaluert ved bruk av Eosin-farging, og derved bestemme rotte sædkvalitet. Metabolomi CS ble brukt til å analysere endringer i serummetabolitter, berike relaterte metabolske veier og utforske mekanismen for CHE for å forbedre reproduksjonsfunksjonsskader hos rotter medKidney-yang mangelsyndrom. Sammenlignet med den normale gruppen, viste modellgruppen betydeligNyney-yang mangel symptomer, Reduserte T -nivåer, reduserte testikkel- og epididymale våtvekter og betydelig patologisk skade på testis og epididymis. Sædtettheten, bevegeligheten og levedyktigheten, med en økt frekvens av sædavvik. I kontrast viste rotter behandlet med CHE markerte forbedringer i nyresyke-mangelsymptomer, gjenopprettet T-nivåer, lindret patologisk skade på testis og epididymis og forbedret forskjellige sædparametere. Metabolomics -resultatene avdekket 286 differensielle metabolitter mellom normale og modellgrupper (191 oppregulert og 95 nedregulert). Syttifem differensielle metabolitter ble identifisert mellom modellen og lavdose CHE-gruppene (21 oppregulert og 54 nedregulert). Totalt 24 vanlige differensielle metabolitter ble identifisert på tvers av de tre gruppene, med 22 av disse metabolittene som viste motsatte reguleringstrender mellom de to sammenligningsgruppene. Disse metabolittene var først og fremst involvert i linolsyremetabolisme, eter lipidmetabolisme og pantotensyre og koenzym en biosyntese, så vel som metabolitter inkludert 13- hydroperoxylinolsyre (13- hpode), LysophosPhat ({}}} hpode). CHE kan forbedre nyre-yang-mangelsymptomer hos rotter, lindre reproduktiv organskade og forbedre sædkvaliteten. Regulering av lipidmetabolisme kan være en potensiell mekanisme som CHE forbedrer reproduktiv funksjon hos rotter mednyre-yang mangel. De potensielle bioaktive forbindelsene av CHE inkludererEchinacoside, verbascoside, salidrosid, betain og cistanoside A.

 

Nøkkelord Cistanches Herba Extract; nyre-yang mangel; Oligasthenospermia; adenin; metabolom; Lipidmetabolisme

 

 

Kunders reiseom cistanche for å forbedre reproduktiv funksjon

 

 

 

Kidney Yang -mangelsyndromer en type mangel-kald syndrom forårsaket av nyre yang-mangel, svikt i oppvarmingsfunksjonen og svikt i QI-transformasjon. Moderne medisin mener at det er en metabolsk sykdom forårsaket av nevroendokrine lidelser inkludert hypothalamic-hypofyse-gonadal (HPG) -aksen. Kliniske mannlige pasienter viser vanligvis symptomer som redusert libido, lavt sædvolum, lav sædmotilitet og korsryggsmerter. Alvorlige symptomer kan føre til infertilitet og fødselsdefekter [1]. Oppvarming av nyren Yang er kjernebehandlingsmetoden for tradisjonell kinesisk medisin for mannlig infertilitet forårsaket av nyre yang -mangel [2]. Cistanche Deserticola er den tørkede kjøttfulle stilken med skjellete blader av planten Cistanche Deserticola YCMA fra Orobanchaceae -familien. Det har effekten av å tonifisere nyre yang og dra nytte av essens og blod. Det brukes ofte til å behandle nyre -yang -mangel, impotens og infertilitet [3]. I følge statistikk er Cistanche Deserticola også det mest brukte medikamentet i nyresonifiserende og Yang-styrkende resepter gjennom tidene [4]. Moderne farmakologiske studier har bekreftet at ekstrakter som totale glykosider og oligosakkarider av Cistanche Deserticola kan regulere homeostasen til HPG-aksen og hypothalamus-pitofysen-adrenal aksen hos rotter med nyre Yang-mangel [5]. Cistanche Deserticola -ekstrakt kan også forbedre spermatogenesen og seksuell dysfunksjon hos rotter med nyre yang -mangel [6-7]. Imidlertid har de potensielle mekanismene for disse terapeutiske effektene ikke blitt undersøkt i dybden. Metabolomics kombinerer dynamisk metabolittendringer med biologiske prosesser på en generell måte, og avslører den metabolske naturen til fysiologiske og sykdomsprosesser og de farmakodynamiske mekanismene til medisiner. Denne helhetlige og dynamiske egenskapen stemmer overens med begrepet tradisjonell kinesisk medisin [8]. Derfor brukte denne studien metabolomisk teknologi for å utforske effektiviteten og mekanismen til Cistanche Deserticola -ekstrakt på reproduksjonsfunksjonsskader hos rotter med nyre yang -mangel forårsaket av adenin, og for å forklare den moderne vitenskapelige konnotasjonen av cistanche ørkenkola i tonifisering av nyrene.

1 materialer

1.1 dyr

50 SPF-klasse 9- Uk gamle mannlige SD-rotter, som veier 330-340 g, ble kjøpt fra Beijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd., lisensnummer SCXK (Beijing) 2019-0008. Dyrene ble holdt i SPF -dyrerommet til det eksperimentelle dyresenteret til Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, med naturlig døgnbelysning, konstant fuktighet og temperatur, og fritt kosthold og aktivitet. Dyreeksperimentet passerte den etiske gjennomgangen av eksperimentell dyrevelferd ved Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences (etisk godkjenningsnummer 2021B166).

 

1.2 medikamenter

Cistanche Deserticola -skiver ble kjøpt fra Beijing Tongrentang (Chongwenmen Store), batchnummer 1806016, og ble identifisert av Zhu Jingjing, en forsker ved Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, som den tørkede FLESHY STEMS MED SCALE BREES OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF OF CHASEY. Veie 500 g cistanche ørkenicola og legge til
10 ganger mengden 70% etanol til refluksekstrakt i 2,5 timer, filter, tilsett 8 ganger mengden 70% etanol til resten og refluksekstraktet i 2,5 timer, filtrer, kombiner de to filtratene og reduser trykket for å tørke det kombinerte ekstraktet til pulver. Det tørre pulverutbyttet er 47%, og lagrer det i tørr tilstand.

1.3 Reagenser

Echinacoside, verbascoside, salidroside, betaine, cistancheside A, tubuloside A, and caffeic acid were purchased from Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd., with batch numbers JOT-10172, JOT-10007, JOT-10012, JOT-10165, Jot -11356, Jot11627 og jot -10196, henholdsvis; Kromatografisk karakter acetonitril, metanol av kromatografisk kvalitet og fosforsyre ble kjøpt fra Chengdu Zhongjinlong Technology Development Co., Ltd., med batchnumre Sigma-WXBF1922V, Sigma-WXBF2452V og 202022222222220 dollar, respektive Adenine ble kjøpt fra Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., med batchnummer S18009; L-Carnitine (LC) ble kjøpt fra Shenyang nr. 1 Pharmaceutical Co., Ltd., med batchnummer 210372;
Calcein/PI celleaktivitet og cytotoksisitetsdeteksjonssett ble kjøpt fra Beijing Biolab Technology Co., Ltd., batchnummer HR0444; Testosteron (T) enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) sett ble kjøpt fra Wuhan Elaruite Biotechnology Co., Ltd., batchnummer e-EL -0155 C; Ammoniakkvann ble kjøpt fra Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., batchnummer 10002108; Hematoxylin-eosin (HE) fargeløsning ble kjøpt fra Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd., Batch Number Bsba -4025.

 

2.2 Analyse av kjemiske komponenter i Cistanche Deserticola -ekstrakt

2.2.1 Forberedelse av referanseoppløsning

Veie 10,41 mg salidroside, 11,19 mg ekkinakosid, 10. 86 mg Cistancheside A, 10,19 mg tubulosid A, 10,8 mg Verbascoside og 10,67 mg Caffe til 25 ml volumflasker Flaskers Flaskers Flaskers flasker og 10,6 mg skala, rist godt å få tak i.

 

2.2.2 Forberedelse av blandet referanseløsning

Nøyaktig pipette 1 ml referanse stamoppløsningsalidrosid, 5 ml ekkinakosid, 2 ml Cistanchesid A, 100 ul tubulosid A, 350 ul verbascosid og 100 ul koffeinsyre i den samme 25 ml volumkast. Vei nøyaktig 12,24 mg betain i en 10 ml volumetrisk kolbe, tilsett 50% metanol for å oppløse og fortynne til merket, rist godt og skaff deg betainreferanseløsningen.

2.2.3 Utarbeidelse av testløsning

Vei nøyaktig 310,14 mg av testprøven i en 25 ml volumetrisk kolbe, tilsett vann for å oppløse og fortynne til merket, rist godt og filtrere.

 

2.2.4 Kromatografiske forhold
Betaindeteksjonsmetode: xamidkolonne (4,6 mm × 250 mm, 5 μm); Mobilfase Acetonitril-vann (80:20); kolonnetemperatur 30 grader; strømningshastighet 1 ml · min -1; Injeksjonsvolum 10 μl.
Andre komponentdeteksjonsbetingelser: Kromasil 100-5- C18 kolonne (4,6 mm × 250 mm, 5 μm); Mobil fase acetonitril (a)

og {{0}}. 1% fosforsyreoppløsning (b); kolonnetemperatur 30 grader; strømningshastighet 1 ml · min -1; Injeksjonsvolum 10 μL, gradienteluering (0 ~ 10 min, 10%A; 10 ~ 20 minutter, 10%~ 15%A; 20 ~ 25 min, 15%A; 25 ~ 40 min, 15%~ 22%A).

 

2.3 Indeksdeteksjon

2.3.1 Epididymale sædceller dynamiske parametere

Rotte abdominalhulen ble dissekert for å avsløre sin venstre epididymis. Den venstre epididymale halen ble raskt avskåret og plassert i 2 ml fenol rødfri DMEM-kulturmedium forvarmet i et 37 graders vannbad. Den ble skåret i stykker med oftalmisk saks, rystet litt og plassert i et 37 graders vannbad for inkubasjon i 10 minutter for å la alt sæd svømme ut av epididymis og tilberede sædoppheng. 10 ul sædoppheng ble droppet på en sædtellende lysbilde, og CASA -teknikken ble brukt til å observere og registrere sædtetthet, gjennomsnittlig banehastighet (VAP), Curvilinear Velocity (VCL), Linearity (LIN), Wobble (WOB), Straightness (STR) og Beat Cross Frequency (BCF).

 

2.3.2 Sædmotilitet og deformitetsrate

Pipette 20 ul nylaget sædoppheng i et forhåndsforberedt propidiumjodid (PI) (fortynnet 3 000 ganger) og calcein-am (fortynnet 200 ganger) blandet fargeløsning, inkuber i et 37 graders vannbad i 30 minutter og observerer en fluorescence-mikroskop. Tell det totale antallet overlevende sæd og overgangssæd i hver 200 sæd i forskjellige synsfelt. Levende sæd: Sædhodet, kroppen og halen er alle grønt lysstoffrør, og sædaktiviteten kan sees under mikroskopet. Overgangssæd: Sædhodet er rødt lysstoffrør, og kroppen er åpenbart grønt lysstoffrør. På dette tidspunktet er sædcellene i overgangsperioden for død. Død sæd: Bare sædhodet er rødt lysstoffrør, og hele kroppen har ingen grønn fluorescens.
Ta 100 ul sædoppheng og legg den i et 60 graders vannbad for inaktivering i 10 minutter, trekk deretter 5 ul og slipp det på lysbildet, spred det jevnt og tørk den, fikser det med metanol, flekker den med eosinfargestoff, skyll det med rennende vann, la det stå og tørr det, gjør det gjennomgående med xylen, og tetning med nøytral. Tell antall unormale sæd i hver 200 sæd i forskjellige felt under et mikroskop og beregne forholdet.

 

2.3.3 Patologisk farging av epididymis og testis

Etter fiksering i 4% paraformaldehyd ved romtemperatur i 48 timer, ble epididymis og testisvev plassert i innebyggingsbokser, dehydrert med gradert etanol, innebygd i parafin og skåret. Etter dewaxing og hydrering ble han utført farging, og patologiske endringer av testis og epididymisvev ble observert under et optisk mikroskop for å bestemme graden av lesjoner i strukturen til testikkel seminiferøse tubuli, lesjoner i epididymal lumen og sædtetthet.

 

2.3.4 Serum T -innhold

Etter orbital blodinnsamling ble den liggende ved romtemperatur i 2,5 timer, sentrifugert ved 3 000 r · min -1 i 20 minutter, og supernatanten ble tatt for å oppdage serum T -nivå i henhold til instruksjonene til T -settet.

 

2.4 Metabolomics Analyse

2.4.1 serumprøveforberedelse

På prøvetakingsdagen ble rottene bedøvd og fullblod ble samlet gjennom abdominal aorta. Blodet ble holdt ved romtemperatur i 2,5 timer og sentrifugert ved 3 000 r · min -1 for 2 0 min. Supernatanten ble delt inn i 2 ml sentrifugerør med tilsvarende tall og lagret ved -80 grad. Tin ved 4 grader før testing, virvel bland prøvene, overfør 5 0 μl serumprøver til 0,5 ml EP-rør, tilsett 300 μl 20% acetonitril-metanol internt ekstrakt, Vortex-bland Supernatant og legg den i en annen ren 0,5 ml EP -rør, la det stå ved -20 grad i 30 minutter, deretter sentrifuge ved 4 grader, 12 000 R · min -1 i 3 minutter, ta 180 μl supernatant for injeksjon.

 

2.4.2 Kromatografiske forhold

Waters Acquity UPLC HSS T3 C18 -kolonne (2,1 mm × 1 0 0 mm, 1,8 μm). De mobile fasene var 0. 1% maursyre i vann (a) og 0,1% maursyre-acetonitril-løsning (b), med gradienteluering (0-11, 5% {{}}% b;}}}}} {{{} B; Kolonnemperaturen var 40 grader, og strømningshastigheten var 0,40 ml · min -1.

 

2.4.3 Massespektrometriforhold

Elektrosprayionkilden ble skannet i positive og negative ionemodus. Sprøytegassen var 50 psi (1 psi≈6,895 kPa), hjelpevaringsgassen var 60 psi, gardingassen var 35 psi, og ionekildetemperaturen var 550 grader. I positiv ionemodus var ioniseringsspenningen 5 500 V, den høye følsomhetsmodusen ble tatt i bruk, avklaringsspenningen var 60 V, og kollisjonsenergien var 30 V. I negativ ionemodus var ioniseringen {{{{{{{{{{{{{{{{{{ Følsomhetsskanningsmodus for semikvantitative data ble tatt i bruk.

 

2.4.4 Databehandling og analyse

Rå dataene for LC-MS-deteksjon ble konvertert til MZML-format av Proteowizard-programvare, og XCMS-programvarepakken ble brukt til toppekstraksjon, justering og korreksjon av oppbevaringstid. Støttevektorregresjonsanalyse (SVR) ble brukt for å korrigere toppområdet, og toppene med manglende hastighet over 5 0% ble filtrert. Toppene etter screening ble integrert i det offentlige biblioteket, databasen bygget av Wuhan Metwell Biotechnology Co., Ltd., og MetDNA -algoritmen for å identifisere strukturell informasjon om metabolitter. Deretter ble R-pakken brukt til å utføre univariat statistisk analyse og multivariat statistisk analyse ved bruk av studentens t-testmetode og henholdsvis ortogonal delvis minste kvadrater diskriminerende analyse (OPLS-DA). Differensielle metabolitt-screeningsbetingelser ble satt til variabel betydning i projeksjonen (VIP)> 1, tosidig test p <0. 05, og de differensielle metabolittene oppnådd under denne tilstanden ble kommentert ved bruk av Kyoto Likypedia av gener og genomes (kegg) compound datafatoClypedia av gener og genomer ( Den oppnådde CPD _ id ble lagt inn i Metabo Analyst 6.0 -nettstedet
(https://www.metaboanalyst.ca/) for anrikningsanalyse. P for den hypergeometriske testen ble brukt for å identifisere nøkkelveiene med betydelig berikelse.

 

2.5 Statistisk analyse

𝑥̅ ± s ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (𝑥̅ ± s), og enveis variansanalyse ble brukt for å sammenligne data blant flere grupper. P<0.05 was considered statistically significant.