Mørkgjøring av huden er et resultat av akkumulering av hudpigment melanin. For å bekjempe dette er amplituden til hudlysende midler kommersielt tilgjengelig, hvorav de fleste hemmer melaninsyntesen. Avfarging av melanin er en alternativ metode for å lysne huden. I denne studien viser vi at ligninperoksidase (LiP), et ekstracellulært enzym renset fra Phanerochaete chrysosporium NK-1 isolert fra skogsjord effektivt kan bryte ned og avfarge melanin in vitro. Avfargingsbetingelser inkludert pH, temperatur, inkubasjonstid, enzymkonsentrasjon og mediatortilsetning ble undersøkt for å optimalisere reaksjonsforholdene. Resultatene indikerer at pH 3, 40 grader, 15 IE/ml og 10 timers inkubering var de optimale betingelsene for avfarging av melaninet. Bruken av mediatoren, veratrylalkohol, ble også funnet effektiv for å øke effekten av melaninavkolonisering, med opptil 92 prosent avfarging. Scanningselektronmikroskopiresultatene viste tomrom på de behandlede melaningranulene sammenlignet med den ubehandlede prøven, noe som indikerer nedbrytning av melanin. Endringer i fingeravtrykkområdet til melaninet ble observert. Mellom bølgetall 1500–500 cm−1, for eksempel, representerte tilstedeværelsen av nye topper i det behandlede melaninet ved 1513, 1464 og 1139 cm−1 CH2, CH3-bøyning og C–O–C-strekk strukturelle endringer. En ny topp ved 2144 cm−1 (alkynyl C≡C strekning) ble også påvist i det avfargede melaninet. Cytotoksisitetsstudien har vist at behandlet melanin og LiP har lave cytotoksiske effekter; Imidlertid kan formidleren av veratrylalkohol resultere i høy dødelighet, noe som tyder på at bruken bør testes grundig ved formulering av helse- og hudpleieprodukter. Funnene i studien tyder på at LiP produsert av Phanerochaete chrysosporium har potensial til å brukes i medisinsk og kosmetisk industri, spesielt for utvikling av biobaserte kosmetiske blekemidler.

I følge relevante studier er cistanche en vanlig urt som er kjent som "mirakelurten som forlenger livet". Hovedkomponenten er cistanosid, som har forskjellige effekter som antioksidant, anti-inflammatorisk og immunfunksjon. Mekanismen mellom cistanche og hudbleking ligger i antioksidanteffekten av cistanche-glykosider. Melanin i menneskelig hud produseres ved oksidasjon av tyrosin katalysert av tyrosinase, og oksidasjonsreaksjonen krever deltakelse av oksygen, så oksygenfrie radikaler i kroppen blir en viktig faktor som påvirker melaninproduksjonen. Cistanche inneholder cistanosid, som er en antioksidant og kan redusere dannelsen av frie radikaler i kroppen, og dermed hemme melaninproduksjonen.

Klikk på Cistanches Herba For Whitening

For mer info:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Melanin er en gruppe komplekse, gjenstridige og gjennomgripende polysykliske biopolymere hudpigmenter produsert av spesialiserte hudceller kalt melanocytter 1,2. Dens primære funksjon er å beskytte huden mot skadelig UV-stråling fra sollys ved å danne supranukleære hetter rundt DNAet til hudcellene 3. Dessuten er den ansvarlig for forskjellige hudfarger ved å absorbere forskjellige frie radikaler i cytoplasmaet. De fleste av disse hudlysende midlene hentet fra naturressurser hemmer melaninproduksjonen i hudcellene ved å hemme tyrosinase-enzymer, undertrykke pigmentbiosyntesen og gjennom noen alternative veier. Ulike forbindelser som hydrokinon, mono-benzyletere av hydrokinon, kvikksølv, kortikosteroider og arbutin brukes i den kommersielle formuleringen for hudblekende kosmetikk, men deres anvendelser har vært assosiert med alvorlige bivirkninger. For eksempel er kvikksølv rapportert å forårsake skade på nyrene, og bly er rapportert å forårsake angst, depresjon og psykose 4,5. Bruk av kortikosteroider kan forårsake Cushings syndrom, diabetes, hypertensjon, binyrebarksvikt, immunsuppresjon, tynning av huden, akne, dermatitt og hypertrikose 6. Tain et al. (2009) rapporterte at bruken av arbutin i hudblekende kosmetikk var effektiv for konsentrasjoner opp til 3 prosent, men en ytterligere økning i konsentrasjonen forårsaket cytotoksiske effekter. Tatt i betraktning disse begrensningene, har anvendelser av disse hemmere i hudblekende kosmetikk blitt kritisert bredt av helse- og sikkerhetsmyndigheter. Det har blitt foreslått at hudblekende kosmetikk kan nå opp til 155,44 milliarder amerikanske dollar innen 2021 med en årlig vekst på 4,9 prosent. På grunn av den økende etterspørselen etter trygge og naturlige hudblekemidler over hele verden, har enzymatisk melaninavkolonisering fått betydelig interesse 7–9.

Mikrobielle ekstracellulære enzymer som lakkase, manganperoksidase og ligninperoksidase (LiP) har tidligere blitt testet for melaninavfarging og anses som et potensielt miljøvennlig alternativ til de giftige kjemikaliene 1. Blant disse ble LiP funnet svært effektiv for avfarging. av melanin på grunn av dets høye redokspotensial til å oksidere veratrylalkohol (VA) enn de andre relaterte enzymene. Til tross for høyt oksidasjonspotensial og effektiv katalyse av melanin, er volumetrisk produksjon og vanskeligheter med rensing de største begrensningene for kommersiell bruk av LiP i hudblekingsmidler. I tillegg mister LiP sin enzymatiske aktivitet for melanin dekolonisering under overflødig hydrogenperoksid, som anses som kritisk for oksidasjon av melanin. Foruten sin viktige rolle, inaktiverer H2O2 LiP og reduserer dermed den katalytiske ytelsen til enzymet.

Resultater

Avfarging av melanin av Phanerochaete chrysosporium NK-1.Soppstammene ble testet for melaninavfarging. Soppene ble punkt-inokulert på det faste mediet inneholdende melanin og VA som LiP-induktor. Etter syv dager med inkubasjon viste Phanerochaete chrysosporium NK-1 evnen til å avfarge melanin, som vist i fig. 1.

Forutsetninger for optimal melaninavfarging.pH. Det rensede enzymet ble brukt for avfarging av det syntetiske melanin in vitro. Effekten av forskjellige forhold på melaninavfarging ble observert 10. Effektene av pH på melaninavfarging ved LiP ble undersøkt først. For dette ble melaninavfarging utført ved forskjellige pH-forhold varierende fra 2.0 til 6.0 ved en temperatur på 30 grader både i nærvær og fravær av VA i en inkubasjonsperiode på 6 timer. Resultatene i fig. 2 viser at generelt var avfarging av melanin i nærvær av VA høyere under alle pH-forhold. Spesielt er det mer fremtredende i forhold med høyere pH. VA kan hjelpe til med dannelsen av kationradikaler 11. Disse radikalene har mye høyere redokspotensial til å angripe C–C-bindinger ikke-spesifikt i melanin og resultere i avfarging 12. I nærvær av VA ble den høyeste melaninavfargingen på 88 prosent oppnådd ved pH 3 etterfulgt av 71 prosent ved pH 2, mens den laveste melaninavfargingen på 39 prosent ble observert ved pH 6. I fravær av VA ble den høyeste melaninavfargingen på 86 prosent observert ved pH 3, mens den laveste melaninavfarging på 35 prosent og 36 prosent ble observert ved henholdsvis pH 5 og 6. Melaninavfarging av LiP i denne studien var svært effektiv ved lavere pH-forhold, dvs. 2 og 3 (fig. 2), selv om andre studier viste en optimal pH-tilstand ved 4 1.

Temperatur. Melaninavfarging av LiP ble studert ved forskjellige temperaturer fra 20–60 grader både i nærvær og fravær av VA ved en inkubasjonsperiode på 6 timer. I fravær av VA ble tilsvarende prosentandeler (19 prosent) av melaninavfarging observert ved temperaturer 20 og 30 grader (fig. 3). Den høyeste og laveste melaninavfargingen i fravær av VA ble observert ved henholdsvis 40 og 50 grader. Med VA i løsningen økte imidlertid melaninavfargingen fra 20 til 40 grader og reduserte opp til 60 grader. I nærvær av VA er den høyeste melaninavfargingen omtrent 60 prosent ved 40 grader. Avfargingen er generelt lavere fordi forsøket ble utført i en mildere pH-tilstand.

LiP-konsentrasjon. Avfargingen av melanin ble også undersøkt med variasjoner i enzymkonsentrasjoner. Fem forskjellige konsentrasjoner, dvs. 5, 10, 15, 20 og 25 IE/mL LiP ble undersøkt for melaninavfarging i nærvær og fravær av VA, som vist i fig. 4. Overraskende nok var den mest effektive enzymkonsentrasjonen 15 IE/ml for både løsninger med og uten VA. Etter en inkubasjonsperiode på 6 timer var den høyeste melaninavfargingen 92 prosent i nærvær av VA og 70 prosent i fravær av mediatoren ved bruk av en enzymkonsentrasjon på 15 IE/ml, mens den laveste melaninavfargingen på 23 prosent ble observert i fravær av VA ved bruk av 5 IE/ml LiP. Det er uklart at avfargingen er mindre effektiv ved høye enzymkonsentrasjoner, dvs. 20 og 25 IE/ml (fig. 4).

Inkubasjonstid. Avfargingsforsøkene ble utført etter 2, 4, 6, 8 og 10 timers inkubering. Disse reaksjonene ble også utført i nærvær og fravær av VA. Resultatene viste at avfargingseffekten er positivt korrelert til inkubasjonstiden, som forventet (fig. 5). Økningen i omfanget av delokalisering var mer fremtredende i den første inkubasjonen. Den høyeste melaninavfargingen (68 prosent) ble observert etter en inkubasjonsperiode på 10 timer i nærvær av VA og 59 prosent i fravær av VA. Melaninavfargingen var så lav som 15 prosent etter 2 timers inkubering uten VA. Basert på testresultatene har vi derfor konkludert med at de optimale forholdene er pH 3, 40 grader, 15 IE/ml og 10 timers inkubasjon.

SEM (Scanning elektronmikroskop) og FTIR (Fourier-transform infrarød spektroskopi) analyser.Morfologiske og strukturelle endringer i melanin ble karakterisert av henholdsvis SEM og FTIR. Det avfargede melaninet ble analysert av SEM for å observere eventuelle overflateendringer morfologisk. Syntetisk melanin uten noen enzymbehandling ble brukt som kontroll. Som vist i fig. 6 var det tomrom på de behandlede melaningranulene sammenlignet med den ubehandlede prøven, noe som tyder på at melaninpartikler ble angrepet av enzymet.

Avfarget melanin ble også analysert med FTIR med ubehandlet melanin som kontroll (fig. 7). De molekylære fingeravtrykkene til både avfarget og ubehandlet melanin ble oppnådd og sammenlignet for å bekrefte eventuelle strukturelle endringer i det behandlede melanin 13. FTIR-spektra av melaninet (C18H10N2O4) viste et bredt absorpsjonsspektrum ved 3272 cm−1 som kan tilskrives den karakteristiske O –H-strekking eller N–H-strekkvibrasjoner av karboksylsyren, og fenolgrupper. Endringene i FTIR-spekteret til det behandlede melaninet var merkbare. Bredbånd ved bølgetall 3000–3500 cm−1 indikerer tilstedeværelsen av -NH- og -OH-grupper i både kontrollprøver og behandlede prøver. Imidlertid er intensiteten til den behandlede prøven betydelig høyere enn kontrollprøven, noe som tyder på at behandlingen hadde tilsetninger av disse funksjonelle gruppene til strukturen ved enzymatiske angrep. Toppene ved 2884,4 cm−1 og 2822 cm−1 indikerte tilstedeværelsen av alkylgrupper i kontrollen, mens toppen ved bølgetall 2884,4 cm−1 var fraværende i det avfargede melaninet. Toppen ved 2822 cm−1 avvek til bølgelengden 2835,92 cm−1 som representerte de strukturelle endringene i det behandlede melaninet også i denne regionen. Toppen ved bølgetallet 1710 cm−1 i kontrollen ble tilskrevet tilstedeværelsen av karboksylsyre. Denne toppen var også fraværende eller redusert i stor grad i avfarget melanin, noe som igjen bekrefter de strukturelle endringene i det behandlede melaninet. Det var også noen endringer i fingeravtrykksregionen. Mellom bølgetall 1500–500 cm−1, for eksempel, representerte tilstedeværelsen av nye topper i det behandlede melaninet ved 1513, 1464 og 1139 cm−1 strukturelle endringer. En ny topp på 2144 cm−1 ble også påvist i det avfargede melaninet.

Cytotoksisitetseffekter.Cytotoksisitet av nedbrutt melanin og LiP ble undersøkt ved bruk av saltlakereker cytotoksisitetsmetode 14,15. I denne studien var cytotoksiske effekter av behandlet melanin og LiP lave med levedyktige rater av rekelarver på over eller lik 90 prosent (tabell 1). Økningen i LiP-konsentrasjon hadde ingen innvirkning på levedyktigheten til rekelarvene for opptil 80 ul/ml (~80 IE/ml), noe som tyder på dens lave cytotoksiske aktivitet. I de positive kontrollene med VA var dødelighetsraten 100 prosent, noe som tyder på at det bør utvises forsiktighet under påføring av LiP i nærvær av VA som mediator innen det medisinske og kosmetiske området.

Diskusjon

Når det gjelder temperatur, ble den høyeste soppveksten og enzymproduksjonen oppnådd ved 40 grader , som tilsvarer det naturlige habitatet til P. chrysosporium. Evnen til LiP til å bryte ned melanin er basert på den strukturelle likheten mellom melanin og lignin 18. Effekten av nedbrytningen av melanin av LiP in vitro har blitt korrelert til flere faktorer som pH, temperatur, enzymkonsentrasjon og inkubasjonstid også som eksistensen av VA. En liP kan oksidere VA til sine kationradikaler (VA∙ pluss) og tjene som en redoksmediator som avfarger melanin ytterligere, som vist i fig. 8.

H2O2 er et essensielt substrat som en endelig elektronakseptor under melaninavfarging. LiP inaktiveres lett i deres overskuddskonsentrasjon som induserer brudd på hemstrukturen eller dannelse av den inaktive forbindelsen III. Det er rapportert at denne hemmende effekten kan dempes ved oksidasjon av VA til VA-kationradikal 1. LiP oksiderer VA til VA kationradikaler, som fungerer som en redoksmediator for å avfarge melanin. VA er en naturlig forbindelse produsert av hvitråtesopp som forventes å ha færre bivirkninger. Imidlertid har tilstedeværelsen av mediatoren VA resultert i høy dødelighet av de testede organismene, sammenlignet med de lave cytotoksiske effektene av behandlet melanin og LiP. Det bør testes nøye i formuleringen av helse- og hudpleieprodukter.

Materialer og metoder

Isolering og identifisering av soppstammer.Soppisoleringen ble gjort fra et forurenset område brukt som dumpeplass for trematerialer i lang tid. Prøven ble tatt i sterile flasker og overført til laboratoriet for rensing. Rensing ble utført på et kyst dekstrose-agarmedium. Fire forskjellige soppkolonier ble isolert og renset fra prøven. Screening for den beste stammen ble gjort basert på melaninavfarging og biomasseproduksjon i nærvær av melanin som eneste karbonkilde i mineralsaltmediet (MSM). Basert på screeningen ble den valgte organismen identifisert ved å sekvensere DNAet til 5.8S rRNA og 18S rRNA ved bruk av universelle primere ITS-1 og ITS-4 10. Deres genomiske DNA ble ekstrahert i henhold til metoden til Anderson et al. 19. Etter rensing ble sekvenseringen av PCR-produktene utført. Sekvensene ble justert ved bruk av BLAST-verktøyet ved NCBI og homologer ble analysert for fylogeni ved bruk av Molecular Evolutionary Genetic Analysis (MEGA). Basert på en maksimal sannsynlighet ble det konstruert et nabotre for identifikasjon av den isolerte soppstammen. Sekvensene ble sendt til NCBI GenBank med tilgangsnummeret KX064682.1. Fylogenetisk analyse viste at isolatet KX064682.1 var en stamme av Phanerochaete chrysosporium NK-1.

Plateanalyse for melaninavfarging.Hvitråtesoppen, Phanerochaete chrysosporium NK-1, ble brukt til melaninavfarging. Phanerochaete chrysosporium er kjent for å produsere LiP. Syntetisk melanin (B049-97–6) ble brukt som modellmelanin i alle melaninavfargingsforsøkene. Et modifisert medium med VA2 som LiP-induktor ble brukt for å teste evnen til melaninavfarging av soppen. Petriskåler ble brukt til å dyrke Phanerochaete chrysosporium NK-1. Mediet ble fremstilt ved å løse opp 10 g glukose, 2 g maltekstrakt, 4 g MgSO4·7H2O, 1 g KH2PO4, 0.01 g FeSO4, 0,005 g ZnSO4, 0,2 g syntetisk melanin og 15 g agar i 1-L destillert vann. Inokulerte petri-plater ble inkubert ved romtemperatur i mørke. I hvilken grad melanin ble avfarget under og rundt soppens koloni ble observert. Det ble funnet at soppen er i stand til å avfarge melanin og brukes videre til å fremstille enzymatiske løsninger.

Fremstilling av enzym for melanin avfarging.Det flytende mediet i kulturen inneholdt 10 g glukose, 0,2 g gjærekstrakt, 0.07 g VA, 3.{{13 }} g vinsyre, 1 g tween 80, 0,2 g KH2PO4, 0,146 g CaCl2·2H2O, 0,157 g av K2HPO4, 0.05 g MgSO4·7H2O, 42,5 mg ZnSO4·7H2O, 7.0 mg CoCl2·6H2O, 7.0 mg av CuCl2·2H2O, 0,54 mg FeCl3, 0,9 mg NaCl og 0,2 mg syntetisk melanin per liter destillert vann 20. pH i mediet ble justert til 4,0 med NaOH og HCl-løsninger. 250 ml kolber inneholdende alikvoter på 100 ml kulturmedium ble autoklavert og inokulert med et 5 ml inokulum. Kolbene ble deretter inkubert på en roterende rister ved 30 grader i 15 dager. Duplikatprøver ble samlet for LiP-aktivitetsanalyser med et intervall på 24 timer.

Enzymanalyse.Reagenser for LiP-analysen inkluderte 250 mM natriumtartratbuffer pH 5,5, 10 mM VA og 4 mM H2O2 (30 prosent). Enzymanalysen ble utført i en silikakyvette, og absorbansen ble målt ved 310 nm med et UV-synlig spektrofotometer (Shimadzu, Kyoto, Japan). Absorbansen ble overvåket til tider 0–30 s under omgivelsesforhold. Aktiviteten til enzymet ble beregnet i henhold til Beer's Law, Eq. (1) 21.

hvor c, er konsentrasjonen av dempende artene; A er den optiske absorpsjonsevnen; ε er den molare dempningskoeffisienten; d er lengden på den optiske banen. Måling av enzymaktivitet innebærer bestemmelse av endringen i konsentrasjon over tid, lign. (2).

Optimalisering for økt produksjon av LiP og avfarging av melanin in vitro.Optimalisering for den forbedrede produksjonen av LiP fra Phanerochaete chrysosporium NK-1 ved bruk av melanin som substrat ble utført med en Placket Burman-design. En Placket i full lengde var basert på det faktum at den undergraver interaktive effekter mellom forskjellige variabler, mens den kun vurderer lineære trender, Eq. (3) 22.

hvor Y representerer responsen og symboler indikerer regresjonskoeffisienten og k er antall studerte faktorer. Totalt 9 faktorer ble studert for å oppnå den høyeste konsentrasjonen av LiP fra Phanerochaete chrysosporium NK-1 for avfarging av melanin tilstede i mediet. Placket–Burman-designet ble konstruert med totalt 12 eksperimentelle kjøringer, som vist i tabell 2. Eksperimenter ble utført i totalt 35 dager og responsen ble målt (LiP-aktivitet IU/ml). De eksperimentelle dataene ble analysert ved hjelp av den statistiske programvaren 'Design Expert 9'. Det optimaliserte mediet ble brukt for økt produksjon av LiP og renset ved ammoniumutfelling.

Optimalisering av enzymproduksjon og rensing.Et nedsenket medium ble brukt for å bestemme den optimale inkubasjonstiden når det gjelder LiP-aktiviteter. Som vist i Supplementert Fig. 1, har kulturløsningen en maksimal enzymatisk aktivitet på den 8. dagen, som er 140 IU/ml. Derfor ble en inkubasjonstid på 8 dager brukt for å produsere enzymløsningen.

Totalt 12 eksperimentkjøringer ble utført for å bestemme faktorene (9) som har innvirkning på LiP-aktiviteter. Blant testene varierer responsverdiene for LiP-aktiviteten fra 171 IE/ml til 576 IE/ml, som vist i tilleggsfigur 2. Forsøkene med høyest LiP-aktivitet ble kjøring 3 (576 IE/ml) etterfulgt av kjøring 10 (547 IE/ml). I følge regresjonsanalyse har temperatur, tid, glukosekonsentrasjon, substratkonsentrasjon og mediatoren positive effekter på LiP-aktivitet. Effekten av gjærekstrakt ble funnet å være ubetydelig. Andre faktorer har negative effekter. De optimale betingelsene for LiP-produksjon er tid: 35 dager, temperatur: 40 grader, glukose (per liter): 20 g, fruktose: 10 g, gjærekstrakt: 2 g, pepton: 2 g, inokulum: 10 ml, substratmediator: 0,1 ml. Disse forholdene ble deretter brukt for økt produksjon av LiP som ble renset ved ammoniumutfelling og gelkromatografi (Sephadex G-75) metoder.

Enzymekstraksjon ved optimalisert pH, temperatur og inkubasjonstid ble utført. Sephadex G75 gelfiltreringskolonne ble brukt for å separere fraksjonen av proteininnholdet fra cellelysatet angående tetthetsgradienten i henhold til produsentens instruksjoner. Overfloden av proteiner i råekstraktet ble også indikert gjennom antall bånd som dukket opp på en natriumdodecyl polyakrylamidgel (SDS-PAGE) analyse. Molekylvekten til det rensede enzymet var 46,0 kDa som beregnet fra SDS-PAGE-analysen (supplert fig. 3). De enzymatiske aktivitetene etter ammoniumutfelling og rensing ved gelkromatografi er henholdsvis 684.0 og 957.6 IE/ml.

Det rensede enzymet ble brukt til avfarging av melanin ved forskjellige fysiokjemiske forhold, inkludert pH, temperatur, inkubasjonstid og enzymkonsentrasjon. Syntetisk melanin (B049-97-6) ble brukt som modellmelanin i alle melaninavfargingsforsøkene i henhold til 23.

Avfargingseksperimenter.Effekter av pH på melaninavfarging. For å observere effekten av pH på avfargingen av melanin med LiP, ble melaninavfargingsreaksjoner utført ved pH som strekker seg fra 2.0–6.0. Reaksjonsblandingen inneholdt 1 0 µl av det rå enzymet oppløst i en TE-buffer og 1990 µl 0,02 prosent vekt/volum melanin. Disse reaksjonene ble utført både i nærvær og fravær av VA. Reaksjonsblandingene ble inkubert ved en temperatur på 30 grader i 6 timer. Kontrolleksperimenter ble kjørt parallelt ved å erstatte aktivt LiP med det denaturerte enzymet som ble kokt ved 95 grader. Reaksjonsblandingene ble overvåket for melaninavfarging ved bruk av et spektrofotometer ved en bølgelengde på 540 nm før og etter inkubering. Avfargingseffektiviteten til enzymet ble uttrykt i prosent (prosent). Melaninavfarging ble beregnet ved Eq. (4) 11.

Effekter av inkubasjonstid på melaninavfarging. For å optimalisere inkubasjonstiden ble melaninavfargingsreaksjoner utført ved inkubasjonstider som strekker seg fra 2–1 0 time. Reaksjonsblandingen inneholdt 10 ul av det rå enzymet oppløst i en buffer og 1990 ul 0,02 prosent vekt/volum melanin ved pH 4 i nærvær og fravær av VA. Reaksjonsblandingene ble deretter inkubert ved en temperatur på 30 grader og prosentandelen av melaninavfarging ble oppnådd.

SEM-analyse av nedbrutt melanin. Overflatemorfologiske endringer av melaninet ble analysert ved hjelp av skanningelektronmikroskopi (JEOL JSM-5910, Peabody, MA, USA) 24. Ubehandlet melanin ble brukt som kontroll. Prøvene ble tørket og festet på kobberstubber (10×10mm2) med dobbeltsidig karbontape (klebrig på begge sider). Stubbene ble vasket med vaskemiddel og tørket med varmepistoltørker (KADA 85U/SMD) ved 200 grader i 2 minutter før prøvefiksering. Sølvpasta-ledning (SPI-CHEM, West Chester, PA, USA) ble brukt for å sikre elektronstråleledning. Gull ble avsatt på prøven med plasma laget med høy spenning (25 mA strøm i 50 s) og vakuum (10−2 ATM). Overflatemorfologien til prøvene ble undersøkt ved 3000 forstørrelseseffekt.

FTIR-analyse av avfarget melanin.Reaksjonene eller prøvene som viste den høyeste avfargingen av melanin i optimaliseringsforsøket ble videre analysert ved FTIR (Model No 56, Merlin, Tyskland) spektroskopi. Prøvene ble sentrifugert (10,000 rpm i 1 min) og lufttørket som et forberedelsestrinn for FTIR-analysen 20. En kvalitativ analyse av melaninprøver ble utført ved bruk av UV–Vis nær-infrarødt (NIR) spektrometer Lambda 900/Perkin Elmer Instruments. Spektrene ble registrert i området 1000 til 3500 cm−1. Prøver ble fremstilt i KBr-pellets med pulverdispersjon. Det ubehandlede syntetiske melaninet ble brukt som kontroll i denne analysen.

Cytotoksisitet av nedbrutt melanin og LiP.Dødelighetstester for saltlakereker ble utført for å kontrollere cytotoksisiteten til det nedbrutt melanin 14,15. Eggene til saltlake ble klekket i en rektangulær skål med kunstig sjøvann. Fatet inneholdt en plastskiller med små hull og delte fatet i to ulike rom. Eggene ble flekkete i det større rommet og tildekket for å unngå lysinntrengning, mens det mindre rommet ble opplyst med en lampe på toppen av det. De klekkede larvene ble tiltrukket av lyset mot det lille rommet. Etter 48 timers inkubering ble de modne naupliene samlet fra det opplyste rommet ved bruk av en pasteurisert pipette.

Statistisk analyse.De eksperimentelle dataene ble analysert ved hjelp av den statistiske programvaren 'Design Expert 9'. Grafiske bilder ble tegnet ved hjelp av tre eksperimentelle forsøk med beregnet standardavvik. Den statistiske signifikansen av forsøkskjøringen ble beregnet av ANOVA.

Datatilgjengelighet

Referanser

4. Clarkson, TW, Magos, L. & Myers, GJ Tetoksikologien til kvikksølv – nåværende eksponeringer og kliniske manifestasjoner. N. Engl. J. Med. 349, 1731–1737 (2003).

5. Lynde, C., Kraf, J. & Lynde, C. Aktuelle behandlinger for melasma og postinflammatorisk hyperpigmentering. Hudterapi Lett. 11, 1–6 (2006).

6. Hughes, J. & Rustin, M. Corticosteroids. Clin. Dermatol. 15, 715-721 (1997).

7. Płonka, P. & Grabacka, M. Melaninsyntese i mikroorganismer: bioteknologiske og medisinske aspekter. Acta Biochim. Pol. 53, 423–443 (2006).

8. Lim, Y.-J. et al. Hemmende effekter av arbutin på melaninbiosyntese av -melanocyttstimulerende hormonindusert hyperpigmentering i dyrket brunaktig marsvinhudvev. Arch. Pharmacal Res. 32, 367–373 (2009).

9. Petit, L. & Pierard, G. Hudbelysningsprodukter besøkt på nytt. Int. J. Cosmet. Sci. 25, 169–181 (2003).

10. Rättö, M., Chatani, M., Ritschkof, A.-C. & Viikari, L. Screening av mikroorganismer for avfarging av melaniner produsert av blåflekksopp. Appl. Microbiol. Bioteknologi. 55, 210–213 (2001).

11. Nagasaki, K. et al. Rensing, karakterisering og genkloning av Ceriporiopsis sp. stamme MD-1 peroksidaser som avfarger menneskehårmelanin. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5106–5112 (2008).

12. Ruiz-Dueñas, FJ & Martínez, Á. T. Mikrobiell nedbrytning av lignin: hvordan en klumpete gjenstridig polymer resirkuleres effektivt i naturen og hvordan vi kan dra nytte av dette. Microb. Bioteknologi. 2, 164–177 (2009).

13. Holmes, EW & Tompson, KD (Google-patenter, 2014).

14. Baravalia, Y., Vaghasiya, Y. & Chanda, S. Brine reker cytotoksisitet, anti-inflammatoriske og smertestillende egenskaper av Woodfordia fruticosa Kurz blomster. Iran. J. Pharm. Res.: IJPR 11, 851 (2012).

15. Milhem, MM, Al-Hiyasat, AS & Darmani, H. Toksisitetstesting av gjenopprettende tannmaterialer ved bruk av saltlake rekelarver (Artemia salina). J. Appl. Oral Sci.

16, 297–301 (2008). 16. Falade, AO et al. Ligninperoksidasefunksjoner og potensielle bruksområder. Microbiologyopen 6, e00394.

17. Sung, HJ Avfarging av melanin ved ligninperoksidase med in-situ generert H2O2 for bleking av kosmetikkapplikasjoner (2020).

18. Pérez, J., Munoz-Dorado, J., De la Rubia, T. & Martinez, J. Biologisk nedbrytning og biologiske behandlinger av cellulose, hemicellulose og lignin: en oversikt. Int. Microbiol. 5, 53–63 (2002).

19. Anderson, MJ, Gull, K. & Denning, DW Molekylær typing ved tilfeldig amplifikasjon av polymorft DNA og M13 sørlig hybridisering av relaterte parede isolater av Aspergillus fumigatus. J. Clin. Microbiol. 34, 87-93 (1996).

20. Sabar, MA et al. Nedbrytning av lavrangert kull av Rhizopus oryzae isolert fra en pakistansk kullgruve og dets økte utslipp av organiske stoffer. Drivstoff 253, 257–265 (2019).

21. Yadav, M., Singh, S. & Yadava, S. Rensing, karakterisering og kulldepolymeriseringsaktivitet av ligninperoksidase fra Lenzitus betulina MTCC-1183. Appl. Biochem. Microbiol. 48, 583–589 (2012).

22. Mohan, S., Viruthagiri, T. & Arunkumar, C. Anvendelse av Plackett-Burman-design for screening av mediekomponentene for tannaseproduksjon fra programskallet ved bruk av nedsenket gjæring. Int. J. Pharm. Res. Rev. 2, 24–29 (2013).

23. Woo, SH, Cho, JS, Lee, BS & Kim, EK Avfarging av melanin med ligninperoksidase fra Phanerochaete chrysosporium. Bioteknologi. Bioprosess. Eng. 9, 256 (2004).

24. Karp, JM et al. Dyrking av menneskelige embryonale stamceller uten embryoidkroppstrinn forbedrer osteogenesen in vitro. Stamceller 24, 835–843 (2006).

Bekreftelse

Forfatterbidrag

Konkurrerende interesser

ForlagetsMerkSpringer Nature forblir nøytral om jurisdiksjonskrav i publiserte kart og institusjonelle tilknytninger.

For mer informasjon: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501